Coltura tridimensionale di adipociti come modello per studiare il rimodellamento del tessuto adiposo bianco indotto dalla cachessia

Riepilogo

Questo protocollo descrive un sistema di coltura di stampa magnetica tridimensionale (3D) che consente la dissezione del rimodellamento del tessuto adiposo bianco (WAT) indotto da un mezzo condizionato da cellule tumorali. L'utilizzo di un sistema di coltura 3D di adipociti UCP1+ che esprimono una proteina fluorescente verde (GFP) consente lo studio degli adipociti beige che contribuiscono al rimodellamento del tessuto adiposo.

Abstract

La cachessia tumorale (CC) si presenta come una sindrome con molteplici manifestazioni, che causa un marcato squilibrio metabolico multiorgano. Recentemente, è stato proposto che il deperimento cachettico sia stimolato da diversi mediatori infiammatori, che possono interrompere la fisiologia integrativa dei tessuti adiposi e di altri tessuti come il cervello e i muscoli. In questo scenario, il tumore può sopravvivere a spese dell'ospite. In recenti ricerche cliniche, l'intensità dell'esaurimento dei diversi depositi di grasso è stata correlata negativamente con l'esito di sopravvivenza del paziente. Gli studi hanno anche dimostrato che vari disturbi metabolici possono alterare il rimodellamento del tessuto adiposo bianco (WAT), specialmente nelle prime fasi di sviluppo della cachessia. La disfunzione WAT derivante dal rimodellamento tissutale contribuisce alla cachessia complessiva, con le principali modificazioni della WAT che consistono in cambiamenti morfo-funzionali, aumento della lipolisi degli adipociti, accumulo di cellule immunitarie, riduzione dell'adipogenesi, cambiamenti nella popolazione di cellule progenitrici e aumento di "nicchie" contenenti cellule beige/brite.

Per studiare i vari aspetti del rimodellamento WAT indotto dalla cachessia, in particolare i cambiamenti delle cellule progenitrici e il rimodellamento del beige, la coltura bidimensionale (2D) è stata la prima opzione per gli studi in vitro. Tuttavia, questo approccio non riassume adeguatamente la complessità del WAT. Saggi migliorati per la ricostruzione di AT funzionale ex vivo aiutano la comprensione delle interazioni fisiologiche tra le distinte popolazioni cellulari. Questo protocollo descrive un efficiente sistema di coltura tissutale con stampa tridimensionale (3D) basato su nanoparticelle magnetiche. Il protocollo è ottimizzato per lo studio del rimodellamento WAT indotto da fattori indotti dalla cachessia (CIF). I risultati mostrano che una coltura 3D è uno strumento appropriato per studiare la modellazione WAT ex vivo e può essere utile per gli screening funzionali per identificare molecole bioattive per applicazioni di singole popolazioni di cellule adipose e aiutare la scoperta della terapia anticachettica cellulare basata su WAT.

Introduzione

Gli organismi viventi sono composti da cellule in microambienti 3D con interazione cellula-cellula e cellula-matrice ed elaborate dinamiche di trasporto di nutrienti e cellule ^1,2. Tuttavia, la maggior parte delle conoscenze fondamentali acquisite in biologia cellulare sono state generate utilizzando la coltura cellulare monostrato (2D). Sebbene la coltura 2D possa rispondere ad alcune delle domande meccanicistiche, questo approccio non riassume adeguatamente l'ambiente naturale in cui risiedono le cellule e può essere incompatibile con la previsione di una risposta farmacologica complessa¹. Inoltre, le cellule percepiscono l'ambiente fisico circostante attraverso la meccanotrasduzione. Infatti, le forze meccaniche vengono tradotte in segnali biochimici che alla fine influenzano i modelli di espressione genica e il destino della cellula. Negli ultimi decenni, la coltura tissutale 3D è emersa come un nuovo strumento in vitro in grado di imitare il microambiente in vivo con maggiore fedeltà. Ciò può evitare alcune insidie meccanicistiche generate dagli approcci 2D in vitro³.

La cachessia tumorale (CC) è definita come una sindrome con molteplici manifestazioni, che causa un marcato squilibrio metabolico multiorgano. Durante lo sviluppo della cachessia, la WAT subisce numerosi cambiamenti morfologici con conseguente aumento della lipolisi degli adipociti, accumulo di cellule immunitarie, riduzione dell'adipogenesi, cambiamenti della popolazione di cellule progenitrici e aumento delle "nicchie" contenenti cellule beige/brite (rimodellamento beige)⁴. Tuttavia, ricapitolare il meccanismo con cui la cachessia influisce sul rimodellamento WAT utilizzando modelli in vitro presenta una sfida tecnica significativa. Infatti, alcuni studi che hanno tentato di indagare la comunicazione tumore/tessuto hanno utilizzato colture cellulari in vitro monostrato (2D), eludendo la complessità del microambiente 3D del WAT.

Sebbene diversi approcci sperimentali generino la coltura 3D, per produrre adiposferoidi si preferiscono tre diversi metodi di assemblaggio: levitazione magnetica o stampa⁵, goccia sospesa⁶ e sistemi di scaffold Matrigel⁷. Nonostante siano appropriati per gli adiposferoidi, questi sistemi presentano vantaggi e svantaggi e dovrebbero essere scelti in base alle caratteristiche di ciascun disegno sperimentale. Sulla base delle limitazioni sopra menzionate, il metodo di stampa magnetica è stato utilizzato per generare colture cellulari 3D⁵. Questo metodo utilizza un assemblaggio di nanoparticelle magnetiche costituito da nanoparticelle d'oro e ossido di ferro, rendendo il metodo di stampa adatto alla maggior parte dei tipi di cellule. Qui, le colture cellulari 3D sono state utilizzate per indurre l'adipogenesi e i CIF sono stati utilizzati per riprodurre le condizioni ambientali del CC.

Protocollo

1. Incubazione di cellule 2D con nanoparticelle magnetiche

1. Coltiva colture 2D aderenti a ~ 70% di confluenza utilizzando le procedure standard di coltura cellulare.
2. Preparare l'assemblaggio di nanoparticelle magnetiche. Toglietelo dal frigorifero e lasciatelo scaldare a temperatura ambiente (20-25 °C) per circa 15 min¹.
3. Terreno misto: aggiungere le nanoparticelle magnetiche direttamente a 12 mL di terreno in piastre di coltura cellulare da 100 mm. Sospendere e risospendere il mezzo alcune volte per ottenere una distribuzione omogenea delle nanoparticelle.
   NOTA: Il mezzo apparirà scuro a causa del colore marrone dell'ossido di ferro. Si raccomanda una concentrazione di 2,5 μL/cm² dell'area di coltura.
4. Lavare tre volte la piastra di coltura 2D da 100 mm con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
5. Aggiungere 12 mL del terreno miscelato dal passaggio 1.3 alle piastre per colture cellulari da 100 mm. Incubare le piastre per una notte in un incubatore (37 °C, 5% CO₂) per consentire l'adesione delle nanoparticelle magnetiche alle cellule

2. Creazione di colture 3D con assemblaggio di sferoidi in piastre a 96 pozzetti

1. Dopo l'incubazione notturna, lavare le cellule per rimuovere eventuali residui di terreno e nanoparticelle magnetiche non attaccate agitando delicatamente le piastre con 3 x 10 mL di PBS.
2. Aspirare il PBS dalla capsula di Petri e staccare le cellule mediante incubazione con una soluzione di acido tripsin-etilendiammina tetraacetico (EDTA) allo 0,25% per 2-5 minuti a 37 °C.
3. In attesa che le celle si stacchino, disinfettare le unità magnetiche con etanolo al 70%¹.
4. Dopo che le cellule si sono staccate, aggiungere un terreno contenente siero a 4 volte il volume della soluzione di tripsina-EDTA per neutralizzare l'effetto della tripsina, quindi trasferire la sospensione in un tubo conico.
5. Centrifugare la sospensione, a 500 × g per 10 min. Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non toccare il pellet.
   NOTA: Dopo la centrifugazione, le cellule dovrebbero apparire marroni e le sospensioni cellulari nel terreno dovrebbero apparire più scure del solito. Le cellule dovrebbero apparire cosparse di nanoparticelle¹.
6. Contare le cellule in sospensione e calcolare il volume dei volumi medi necessari per creare colture 3D. Per gli adiposferoidi, utilizzare da 5.000 a 10.000 cellule in 150 μl in piastre a 96 pozzetti.
7. Utilizzando un kit di bioprinting a 96 pozzetti, posizionare una piastra a 96 pozzetti repellente per le cellule nella parte superiore dell'unità Spheroid.
8. Pipettare 150 μl di sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e chiudere la piastra per consentire alle cellule di aggregarsi sul fondo a forma di magnete.
9. Lasciare la piastra sull'unità sferoidale nell'incubatrice per 1-2 ore per ottenere uno sferoide competente.
   NOTA: Queste colture dovrebbero apparire dense e marroni e dovrebbero essere stampate sulla lastra (Figura S1). La Figura S2 presenta un flusso di lavoro riassuntivo delle fasi principali della stampa magnetica 3D dell'assemblaggio di sferoidi in piastre a 96 pozzetti.

3. Induzione dell'adipogenesi bianca

1. Preparare i mezzi di manutenzione e di induzione⁸; Preparare il mezzo di induzione prima di ogni utilizzo.
   1. Preparare un terreno di mantenimento contenente 5 μg/mL di insulina (10 mg/mL di riserva conservata a 4 °C per una settimana) e 0,5 μM di rosiglitazone (10 mM di riserva in dimetilsolfossido (DMSO)).
   2. Preparare un terreno di induzione contenente 125 μM di indometacina da uno stock 0,125 M di etanolo, 2 μg/mL di desametasone da uno stock di 2 mg/mL di etanolo, 0,5 mM di isobutile-1-metilxantina (IBMX) da uno stock 0,25 M di DMSO e 0,5 μM di rosiglitazone da 10 mM di DMSO.
      NOTA: Riscaldare l'indometacina a 60 °C per scioglierla.
2. Dopo 24-48 ore di stampa degli sferoidi, sostituire il normale supporto completo con il mezzo di induzione (giorno 0).
3. Dopo 48 ore (giorno 2), sostituire il mezzo di induzione con il mezzo di mantenimento.
4. Cambiare il terreno ogni 3-5 giorni fino a quando le cellule non sono completamente differenziate.
   NOTA: Generalmente, dopo 7-8 giorni di stimolazione con il mezzo di induzione, le cellule si differenziano in cellule adipose mature e sono piene di goccioline d'olio che possono essere viste ai bordi degli adiposferoidi.

4. Produzione di terreno condizionato per carcinoma polmonare di Lewis (LLC-CM)

1. Cellule di carcinoma polmonare di Lewis (LL/2) in piastre di coltura cellulare da 100 mm in terreno di crescita a una densità di 6000 cellule/cm².
   NOTA: Il terreno di crescita contiene il terreno di Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 100 U/mL di penicillina-streptomicina.
2. Dopo 2 giorni, sostituire il terreno in ogni piastra con un terreno di coltura fresco.
   NOTA: Le celle LL/2 contengono un mix eterogeneo di cellule aderenti (numero maggiore) e cellule galleggianti.
3. Dopo 2 giorni (giorno 4), raccogliere il terreno condizionato e ripulirlo da cellule e detriti mediante centrifugazione (500 × g, 10 min).
4. Congelare le aliquote del mezzo condizionato in azoto liquido per un uso successivo.
   NOTA: Per trattare gli sferoidi con il terreno condizionato, utilizzare una combinazione di terreno di coltura fresco al 75% e terreno condizionato LLC al 25%.

Risultati

Adiposferoidi da coltura 3D di cellule della frazione vascolare stromale (SVF)
Sia le colture 3D che quelle 2D confluenti sono state impostate con lo stesso numero di cellule SVF provenienti dalla stessa preparazione WAT inguinale di topo (Figura 1A, Figura 1B) e sottoposte allo stesso protocollo sperimentale per confrontare il marcatore di espressione genica. Sferoidi stimola...

Discussione

Questo protocollo mette a punto un sistema di coltura cellulare 3D per studiare la differenziazione degli adipociti in adiposferoidi derivati da cellule SVF primarie da WAT. Rispetto alla tradizionale coltura aderente 2D, questo sistema 3D facilita il rimodellamento AT, che assomiglia molto alle condizioni in vivo. Negli ultimi anni, gli studi hanno dimostrato che la coltura di cellule in 3D produce una morfologia cellulare e una segnalazione distinte rispetto a un sistema di coltura 2D<...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-5879	Cell culture
96-Well Bioprinting Kit, black	Greiner (Monroe, NC, USA)	655841	Cell culture
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-606-152	Immunofluorescence staining, secondary, 1:400 in TBS with 0.1% Tween-20
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM, µCLEAR, BLACK, CELLSTAR, CELL-REPELLENT SURFACE, LID, STERILE, 8 PCS./BAG	Greiner (Monroe, NC, USA)	655976	Cell culture
Dexamethasone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D-1756	Cell culture
DMEM	Corning (Manassas, VA, USA)	10-017-CV	Cell culture
Fetal Bovine Serum (Tova)	Gemini Bio (West Sacramento, CA)	100-500	Cell culture
Indomethacin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-7378	Cell culture
Insulin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I0516	Cell culture
LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)	American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)	CRL-1642	Lewis Lung Carcinoma cell line
NanoShuttle-PL	Greiner (Monroe, NC, USA)	657843	Cell culture
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	ThermoFisher (Waltham, MA, USA)	R37606	Immunofluorescence staining, following the manufacturer's instructions
Pen strep	Corning (Manassas, VA, USA)	30-002-CI	Cell culture
Perilipin-1 (D1D8) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)	9349	Immunofluorescence staining, primary, 1:1000 in TBS with 0.1% Tween-20
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	R-2408	Cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05%	Corning (Manassas, VA, USA)	25-052-CI	Cell culture
Reverse-transcription PCR primers
Primer	Forward	Reverse
Adipoq	GTTCCCAATGTACCCATTCGC	TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
Col4a1	TCCAAGGGCGAAGTGGGTTT	ACCCTTGCTCGCCTTTGACT
Cyclophilin a	ATGGCACTGGCGGCAGGTCC	TTGCCATTCCTGGACCCAAA
Fabp4	TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG	TCCAGGCCTCTTCCTTTGGCTCA
Fn1	GCTTCCCCAACTGGTTACCCT	GGGTTGGTGATGAAGGGGGT
Pgc1a	GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG	GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG
Ucp1	TCCTAGGGACCATCACCACCC	AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC
Mouse genotyping
Primer name	Description	Sequence
Cre F	Generic Cre forward	GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre R	Generic Cre reverse	GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318	mT/mG forward	CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT
oIMR7319	mT/mG wild type reverse	CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320	mT/mG mutant reverse	TCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336	UCP1 mutant forward	CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC
WH337	UCP1 mutant reverse	GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338	UCP1 wild type forward	GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT
WH339	UCP1 wild type reverse	GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C