Culture tridimensionnelle d’adipocytes comme modèle pour étudier le remodelage du tissu adipeux blanc induit par la cachexie

Résumé

Ce protocole décrit un système de culture d’impression magnétique tridimensionnel (3D) qui permet la dissection du remodelage du tissu adipeux blanc (WAT) induit par un milieu conditionné à partir de cellules cancéreuses. L’utilisation d’un système de culture 3D d’adipocytes UCP1+ exprimant une protéine fluorescente verte (GFP) permet d’étudier les adipocytes beiges contribuant au remodelage du tissu adipeux.

Résumé

La cachexie cancéreuse (CC) se présente comme un syndrome aux manifestations multiples, provoquant un déséquilibre métabolique multiviscéral marqué. Récemment, il a été proposé que la fonte cachectique soit stimulée par plusieurs médiateurs inflammatoires, ce qui peut perturber la physiologie intégrative des tissus adipeux et d’autres tissus tels que le cerveau et les muscles. Dans ce scénario, la tumeur peut survivre aux dépens de l’hôte. Dans des recherches cliniques récentes, l’intensité de l’épuisement des différents dépôts de graisse a été négativement corrélée avec le résultat de survie du patient. Des études ont également montré que divers troubles métaboliques peuvent modifier le remodelage du tissu adipeux blanc (WAT), en particulier dans les premiers stades du développement de la cachexie. Le dysfonctionnement de la WAT résultant du remodelage tissulaire contribue à la cachexie globale, les principales modifications de la WAT consistant en des changements morpho-fonctionnels, une augmentation de la lipolyse adipocytaire, une accumulation de cellules immunitaires, une réduction de l’adipogenèse, des modifications de la population de cellules progénitrices et l’augmentation des « niches » contenant des cellules beiges/brite.

Pour étudier les différentes facettes du remodelage WAT induit par la cachexie, en particulier les changements dans les cellules progénitrices et le remodelage beige, la culture bidimensionnelle (2D) a été la première option pour les études in vitro. Cependant, cette approche ne résume pas adéquatement la complexité du WAT. Des tests améliorés pour la reconstruction de l’AT fonctionnelle ex vivo aident à comprendre les interactions physiologiques entre les différentes populations cellulaires. Ce protocole décrit un système efficace de culture tissulaire d’impression tridimensionnelle (3D) basé sur des nanoparticules magnétiques. Le protocole est optimisé pour l’étude du remodelage WAT induit par les facteurs induits par la cachexie (CIF). Les résultats montrent qu’une culture 3D est un outil approprié pour étudier la modélisation WAT ex vivo et peut être utile pour les criblages fonctionnels afin d’identifier des molécules bioactives pour des applications de populations de cellules adipeuses individuelles et aider à la découverte d’une thérapie anticachectique cellulaire basée sur WAT.

Introduction

Les organismes vivants sont composés de cellules dans des microenvironnements 3D avec une interaction cellule-cellule et cellule-matrice et une dynamique de transport élaborée pour les nutriments et les cellules ^1,2. Cependant, la plupart des connaissances fondamentales acquises en biologie cellulaire ont été générées à l’aide de la culture cellulaire monocouche (2D). Bien que la culture 2D puisse répondre à certaines des questions mécanistes, cette approche récapitule de manière inadéquate l’environnement naturel dans lequel résident les cellules et peut être incompatible avec la prédiction d’une réponse médicamenteuse complexe¹. De plus, les cellules perçoivent leur environnement physique par mécanotransduction. En effet, les forces mécaniques sont traduites en signaux biochimiques qui influencent finalement les modèles d’expression des gènes et le destin de la cellule. Au cours des dernières décennies, la culture tissulaire 3D est apparue comme un nouvel outil in vitro capable d’imiter le microenvironnement in vivo avec une plus grande fidélité. Cela permet d’éviter certains pièges mécanistes générés par les approches 2D in vitro³.

La cachexie cancéreuse (CC) est définie comme un syndrome aux manifestations multiples, provoquant un déséquilibre métabolique multiviscéral marqué. Au cours du développement de la cachexie, la WAT subit de nombreux changements morphologiques entraînant une augmentation de la lipolyse adipocytaire, une accumulation de cellules immunitaires, une réduction de l’adipogenèse, des changements de la population de cellules progénitrices et une augmentation des « niches » contenant des cellules beiges/brites (remodelage beige)⁴. Cependant, récapituler le mécanisme par lequel la cachexie affecte le remodelage des WAT à l’aide de modèles in vitro présente un défi technique important. En effet, quelques études qui ont tenté d’étudier la communication tumeur/tissu ont utilisé la culture cellulaire in vitro monocouche (2D), contournant ainsi la complexité du microenvironnement 3D du WAT.

Bien que plusieurs approches expérimentales génèrent une culture 3D, trois méthodes d’assemblage différentes sont privilégiées pour produire des adiposphéroïdes : la lévitation magnétique ou l’impression⁵, la goutte suspendue⁶ et les systèmes d’échafaudage Matrigel⁷. Bien qu’ils conviennent aux adiposphéoïdes, ces systèmes présentent des avantages et des inconvénients et doivent être choisis en fonction des caractéristiques de chaque plan d’expérience. Sur la base des limitations mentionnées ci-dessus, la méthode d’impression magnétique a été utilisée pour générer des cultures cellulaires 3D⁵. Cette méthode utilise un assemblage de nanoparticules magnétiques composé de nanoparticules d’or et d’oxyde de fer, ce qui rend la méthode d’impression adaptée à la plupart des types de cellules. Ici, des cultures cellulaires 3D ont été utilisées pour induire l’adipogenèse, et des CIF ont été utilisés pour reproduire les conditions environnementales de CC.

Protocole

1. Incubation de cellules 2D avec des nanoparticules magnétiques

1. Cultivez des cultures 2D adhérentes à une confluence de ~ 70 % en utilisant des procédures de culture cellulaire standard.
2. Préparez l’assemblage des nanoparticules magnétiques. Sortez-le du réfrigérateur et laissez-le réchauffer à température ambiante (20-25 °C) pendant environ 15 min¹.
3. Milieu mixte : Ajouter les nanoparticules magnétiques directement à 12 ml de milieu dans des plaques de culture cellulaire de 100 mm. Suspendez et remettez le milieu en suspension à quelques reprises pour obtenir une répartition homogène des nanoparticules.
   REMARQUE : Le milieu apparaîtra sombre en raison de la couleur brune de l’oxyde de fer. Une concentration de 2,5 μL/^cm2 de la zone de culture est recommandée.
4. Lavez trois fois la plaque de culture 2D de 100 mm avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
5. Ajouter 12 ml du milieu mélangé de l’étape 1.3 aux plaques de culture cellulaire de 100 mm. Incuber les plaques pendant la nuit dans un incubateur (37 °C, 5 % CO₂) pour permettre la fixation des nanoparticules magnétiques sur les cellules

2. Création de cultures 3D avec assemblage de sphéroïdes dans des plaques de 96 puits

1. Après une nuit d’incubation, laver les cellules pour éliminer tout milieu résiduel et les nanoparticules magnétiques non attachées en agitant doucement les plaques avec 3 x 10 mL de PBS.
2. Aspirez le PBS de la boîte de Pétri et détachez les cellules par incubation avec une solution d’acide trypsine-éthylènediamine tétraacétique (EDTA) à 0,25 % pendant 2 à 5 min à 37 °C.
3. En attendant que les cellules se détachent, désinfectez les entraînements magnétiques avec de l’éthanol à 70 %¹.
4. Une fois que les cellules se sont détachées, ajoutez un milieu contenant du sérum à 4 fois le volume de la solution trypsine-EDTA pour neutraliser l’effet de la trypsine, puis transférez la suspension dans un tube conique.
5. Centrifuger la suspension, à 500 × g pendant 10 min. Aspirez le surnageant en prenant soin de ne pas toucher la pastille.
   REMARQUE : Après la centrifugation, les cellules doivent apparaître brunes et les suspensions cellulaires dans le milieu doivent apparaître plus foncées que d’habitude. Les cellules doivent apparaître parsemées de nanoparticules¹.
6. Comptez les cellules en suspension et calculez le volume de volumes moyens nécessaires à la création de cultures 3D. Pour les adiposphéroïdes, utilisez 5 000 à 10 000 cellules dans 150 μL dans des plaques à 96 puits.
7. À l’aide d’un kit de bio-impression à 96 puits, placez une plaque anticellulaire à 96 puits au sommet du Sphéroïde Drive.
8. Pipeter 150 μL de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque de 96 puits et fermer la plaque pour permettre aux cellules de s’agréger au fond en forme d’aimant.
9. Laissez la plaque sur l’entraînement du sphéroïde dans l’incubateur pendant 1 à 2 h pour obtenir un sphéroïde compétent.
   REMARQUE : Ces cultures doivent apparaître denses et brunes et doivent être imprimées sur la plaque (figure S1). La figure S2 présente un résumé du flux de travail des principales étapes de l’impression magnétique 3D de l’assemblage de sphéroïdes en plaques de 96 puits.

3. Induction de l’adipogenèse blanche

1. Préparer les supports d’entretien et d’induction⁸ ; Préparez le milieu à induction avant chaque utilisation.
   1. Préparez un milieu d’entretien contenant 5 μg/mL d’insuline (10 mg/mL stockant à 4 °C pendant une semaine) et 0,5 μM de rosiglitazone (10 mM de sulfoxyde de diméthyle (DMSO)).
   2. Préparez un milieu d’induction contenant 125 μM d’indométacine à partir d’un stock de 0,125 M dans de l’éthanol, 2 μg/mL de dexaméthasone à partir d’un stock de 2 mg/mL d’éthanol, 0,5 mM d’isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) à partir d’un stock de 0,25 M dans du DMSO et 0,5 μM de rosiglitazone à partir d’un stock de 10 mM dans du DMSO.
      REMARQUE : Chauffer l’indométacine à 60 °C pour dissoudre.
2. Après 24 à 48 h d’impression de sphéroïdes, remplacez le support complet habituel par le support à induction (jour 0).
3. Après 48 h (jour 2), remplacez le milieu à induction par le milieu d’entretien.
4. Changez de milieu tous les 3 à 5 jours jusqu’à ce que les cellules soient complètement différenciées.
   REMARQUE : Généralement, après 7-8 jours de stimulation avec le milieu d’induction, les cellules se différencient en cellules graisseuses matures et sont remplies de gouttelettes d’huile qui peuvent être vues sur les bords des adiposphéroïdes.

4. Production de milieu conditionné pour le carcinome pulmonaire de Lewis (LLC-CM)

1. Implantez des cellules de carcinome pulmonaire de Lewis (LL/2) dans des plaques de culture cellulaire de 100 mm dans un milieu de croissance à une densité de 6000 cellules/^cm2.
   REMARQUE : Le milieu de croissance contient du milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 100 U/mL de pénicilline-streptomycine.
2. Après 2 jours, remplacez le milieu dans chaque assiette par du milieu de croissance frais.
   REMARQUE : Les cellules LL/2 contiennent un mélange hétérogène de cellules adhérentes (nombre supérieur) et de cellules flottantes.
3. Après 2 jours (jour 4), récoltez le milieu conditionné et débarrassez-le des cellules et des débris par centrifugation (500 × g, 10 min).
4. Congelez des aliquotes du milieu conditionné dans de l’azote liquide pour une utilisation ultérieure.
   REMARQUE : Pour traiter les sphéroïdes avec le milieu conditionné, utilisez une combinaison de 75 % de milieu de croissance frais et de 25 % de milieu conditionné LLC.

Résultats

Adiposphéroïdes issus de la culture 3D de cellules de fraction vasculaire stromale (SVF)
Les cultures 3D et 2D confluentes ont été mises en place avec le même nombre de cellules SVF à partir de la même préparation WAT inguinale de souris (Figure 1A, Figure 1B) et soumises au même protocole expérimental pour comparer les marqueurs d’expression génique. Sphéroïdes...

Discussion

Ce protocole met en place un système de culture cellulaire 3D pour étudier la différenciation adipocytaire dans les adiposphéroïdes dérivés de cellules SVF primaires de WAT. Par rapport à la culture adhérente 2D conventionnelle, ce système 3D facilite le remodelage de l’AT, qui ressemble beaucoup aux conditions in vivo. Au cours des dernières années, des études ont montré que la culture de cellules en 3D produit une morphologie cellulaire et une signalisation distinctes p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-5879	Cell culture
96-Well Bioprinting Kit, black	Greiner (Monroe, NC, USA)	655841	Cell culture
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-606-152	Immunofluorescence staining, secondary, 1:400 in TBS with 0.1% Tween-20
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM, µCLEAR, BLACK, CELLSTAR, CELL-REPELLENT SURFACE, LID, STERILE, 8 PCS./BAG	Greiner (Monroe, NC, USA)	655976	Cell culture
Dexamethasone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D-1756	Cell culture
DMEM	Corning (Manassas, VA, USA)	10-017-CV	Cell culture
Fetal Bovine Serum (Tova)	Gemini Bio (West Sacramento, CA)	100-500	Cell culture
Indomethacin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-7378	Cell culture
Insulin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I0516	Cell culture
LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)	American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)	CRL-1642	Lewis Lung Carcinoma cell line
NanoShuttle-PL	Greiner (Monroe, NC, USA)	657843	Cell culture
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	ThermoFisher (Waltham, MA, USA)	R37606	Immunofluorescence staining, following the manufacturer's instructions
Pen strep	Corning (Manassas, VA, USA)	30-002-CI	Cell culture
Perilipin-1 (D1D8) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)	9349	Immunofluorescence staining, primary, 1:1000 in TBS with 0.1% Tween-20
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	R-2408	Cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05%	Corning (Manassas, VA, USA)	25-052-CI	Cell culture
Reverse-transcription PCR primers
Primer	Forward	Reverse
Adipoq	GTTCCCAATGTACCCATTCGC	TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
Col4a1	TCCAAGGGCGAAGTGGGTTT	ACCCTTGCTCGCCTTTGACT
Cyclophilin a	ATGGCACTGGCGGCAGGTCC	TTGCCATTCCTGGACCCAAA
Fabp4	TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG	TCCAGGCCTCTTCCTTTGGCTCA
Fn1	GCTTCCCCAACTGGTTACCCT	GGGTTGGTGATGAAGGGGGT
Pgc1a	GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG	GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG
Ucp1	TCCTAGGGACCATCACCACCC	AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC
Mouse genotyping
Primer name	Description	Sequence
Cre F	Generic Cre forward	GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre R	Generic Cre reverse	GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318	mT/mG forward	CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT
oIMR7319	mT/mG wild type reverse	CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320	mT/mG mutant reverse	TCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336	UCP1 mutant forward	CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC
WH337	UCP1 mutant reverse	GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338	UCP1 wild type forward	GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT
WH339	UCP1 wild type reverse	GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C