悪液質誘発性白脂肪組織リモデリング研究のモデルとしての三次元脂肪細胞培養

要約

このプロトコルは、癌細胞からの馴応培地によって誘発される白色脂肪組織(WAT)リモデリングの解剖を可能にする3次元(3D)磁気印刷培養システムについて説明しています。緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するUCP1+脂肪細胞の3D培養システムを使用することで、脂肪組織のリモデリングに寄与するベージュ脂肪細胞の研究が可能になります。

要約

がん性悪液質(CC)は、複数の症状を呈する症候群として現れ、顕著な多臓器代謝の不均衡を引き起こします。最近、悪液質消耗は、いくつかの炎症性メディエーターによって刺激されることが提案されており、脂肪組織や脳や筋肉などの他の組織の統合生理機能を混乱させる可能性があります。このシナリオでは、腫瘍は宿主の費用で生存することができます。最近の臨床研究では、さまざまな脂肪沈着物の枯渇の強度は、患者の生存結果と負の相関があります。研究はまた、さまざまな代謝障害が、特に悪液質の発達の初期段階で、白脂肪組織(WAT)のリモデリングを変える可能性があることも示しています。組織リモデリングに起因するWAT機能障害は、全体的な悪液質の一因であり、WATの主な修飾は、形態機能の変化、脂肪細胞脂肪分解の増加、免疫細胞の蓄積、脂肪形成の減少、前駆細胞集団の変化、およびベージュ/ブライト細胞を含む「ニッチ」の増加で構成されています。

悪液質誘発性WATリモデリングのさまざまな側面、特に前駆細胞の変化とベージュのリモデリングを研究するために、2次元(2D)培養はin vitro研究の最初の選択肢でした。ただし、このアプローチでは WAT の複雑さを適切に要約できません。 機能的ATのex vivo再構築のための改良されたアッセイは、異なる細胞集団間の生理学的相互作用の理解に役立ちます。このプロトコルは、磁性ナノ粒子に基づく効率的な3次元(3D)印刷組織培養システムについて説明しています。このプロトコルは、悪液質誘発因子(CIF)によって誘発されるWATリモデリングの調査に最適化されています。この結果は、3D培養がWATモデリングをex vivoで研究するための適切なツールであり、個々の脂肪細胞集団の生理活性分子を同定し、WATベースの細胞抗悪液質療法の発見を支援する機能スクリーニングに役立つ可能性があることを示しています。

概要

生物は、細胞間および細胞-マトリックスの相互作用と、栄養素と細胞の精巧な輸送ダイナミクスを備えた3D微小環境の細胞で構成されています^1,2。しかし、細胞生物学で得られる基本的な知識のほとんどは、単層細胞培養(2D)を使用して生成されています。2D培養はメカニズム的な問題のいくつかに答えることができますが、このアプローチは細胞が存在する自然環境を不適切に再現しており、複雑な薬物応答の予測と互換性がない可能性があります¹。さらに、細胞は機械伝達を通じて物理的環境を感知します。実際、機械的な力は生化学的なシグナルに変換され、最終的には遺伝子発現パターンと細胞の運命に影響を与えます。過去数十年の間に、3D組織培養は、in vivo微小環境をより忠実に模倣できる新しいin vitroツールとして登場しました。これにより、in vitro 2Dアプローチ³によって生成されるいくつかのメカニズムの落とし穴を回避できます。

がん性悪液質(CC)は、複数の症状を呈する症候群と定義され、顕著な多臓器代謝の不均衡を引き起こします。悪液質の発生中、WATは多数の形態学的変化を経、その結果、脂肪細胞の脂肪分解の増加、免疫細胞の蓄積、脂肪形成の減少、前駆細胞集団の変化、およびベージュ/ブライト細胞を含む「ニッチ」の増加(ベージュのリモデリング)⁴。しかし、in vitroモデルを使用して、悪液質がWATリモデリングに影響を与えるメカニズムを再現することは、大きな技術的課題を提示します。実際、腫瘍/組織コミュニケーションの研究を試みたいくつかの研究では、単層in vitro細胞培養(2D)を使用しており、WATの3D微小環境の複雑さを回避しています。

いくつかの実験的アプローチが3D培養を生成するが、アディポスフェロイドを生成するには、磁気浮上またはプリンティング⁵、吊り下げ⁶、およびマトリゲル足場システム⁷の3つの異なる組み立て方法が好ましい。これらのシステムはアディポスフェロイドに適していますが、長所と短所があるため、各実験デザインの特性に応じて選択する必要があります。上記の制限に基づき、磁気プリンティング法を用いて3D細胞培養物を作製した⁵。この方法は、金ナノ粒子と酸化鉄からなる磁性ナノ粒子集合体を使用するため、ほとんどの細胞タイプに適した印刷方法となっています。ここでは、3D細胞培養を用いて脂肪形成を誘導し、CIFを用いてCCの環境条件を再現しました。

プロトコル

1. 磁性ナノ粒子による2次元細胞のインキュベーション

1. 標準的な細胞培養手順を使用して、接着性2D培養物を~70%のコンフルエントまで増殖させます。
2. 磁性ナノ粒子アセンブリを調製します。冷蔵庫から取り出し、室温(20〜25°C)まで約15^分間温めます1。
3. 混合培地:磁性ナノ粒子を100 mm細胞培養プレートの12 mL培地に直接加えます。培地を数回懸濁および再懸濁して、ナノ粒子の均一な分布を得る。
   注意: 酸化鉄の色が茶色のため、媒体は暗く見えます。培養領域の濃度は2.5μL/^cm2 を推奨します。
4. 100 mmの2D培養プレートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄します。
5. ステップ1.3の混合培地12 mLを100 mm細胞培養プレートに加えます。プレートをインキュベーター(37°C、5%CO₂)で一晩インキュベートし、磁性ナノ粒子を細胞に付着させます

2. 96ウェルプレートでのスフェロイドアセンブリによる3D培養物の作成

1. 一晩インキュベートした後、細胞を洗浄し、3 x 10 mLのPBSでプレートを穏やかに攪拌することにより、残留培地と付着していない磁性ナノ粒子を除去します。
2. ペトリ皿からPBSを吸引し、0.25%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液と37°Cで2〜5分間インキュベートすることにより、細胞を剥離します。
3. 細胞が剥離するのを待っている間に、磁気ドライブを70%エタノール¹で消毒します。
4. 細胞が分離した後、トリプシン-EDTA溶液の4倍の容量で血清含有培地を添加してトリプシンの効果を中和し、懸濁液を円錐管に移します。
5. 懸濁液を500 × g で10分間遠心分離します。ペレットに触れないように注意しながら、上清を吸引します。
   注:遠心分離後、細胞は茶色に見え、培地中の細胞懸濁液は通常よりも暗く見えるはずです。細胞にはナノ粒子がちりばめられて見えるはずです¹。
6. 懸濁液中の細胞をカウントし、3D培養物の作成に必要な培地の量を計算します。脂肪球状浮物の場合は、96ウェルプレートで150μL中の5,000〜10,000細胞を使用します。
7. 96ウェルバイオプリンティングキットを使用して、細胞忌避剤の96ウェルプレートをスフェロイドドライブの上部に置きます。
8. 150 μLの細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルにピペットで注入し、プレートを閉じると、細胞が磁石の形で底部に凝集します。
9. プレートをインキュベーター内のスフェロイドドライブに1〜2時間放置して、コンピテントスフェロイドを生成します。
   注:これらの培養物は濃厚で茶色に見えるはずで、プレートに印刷する必要があります(図S1)。 図S2 は、96ウェルプレートのスフェロイドアセンブリの3D磁気プリンティングの主なステップの要約ワークフローを示しています。

3. 白色脂肪生成誘導

1. メンテナンスと誘導メディアの準備⁸;毎回使用する前に誘導媒体を準備してください。
   1. 5 μg/mL のインスリン (10 mg/mL ストックを 4 °C で 1 週間保存) と 0.5 μM ロシグリタゾン (10 mM ストックのジメチルスルホキシド (DMSO)) を含む維持培地を調製します。
   2. エタノール中の0.125 Mストックから125 μMインドメタシン、エタノール中の2 mg/mLストックから2 μg/mLのデキサメタゾン、DMSO中の0.25 Mストックから0.5 mMイソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)、およびDMSO中の10 mMストックから0.5 μMロシグリタゾンを含む誘導培地を調製します。
      注:インドメタシンを60°Cに加熱して溶解します。
2. スフェロイドの印刷から24〜48時間後、通常の完全媒体を誘導媒体(0日目)と交換します。
3. 48時間後(2日目)に、誘導媒体をメンテナンス媒体と交換します。
4. 細胞が完全に分化するまで、3〜5日ごとに培地を交換します。
   注:一般に、誘導培地による7〜8日間の刺激後、細胞は成熟脂肪細胞に分化し、脂肪球状体の端で見ることができる油滴で満たされます。

4. ルイス肺がん馴染培地(LLC-CM)の作製

1. ルイス肺がん(LL/2)細胞を、6000細胞/cm²の密度で増殖培地中の100 mm細胞培養プレートに播種します。
   注:増殖培地には、10%ウシ胎児血清(FBS)と100 U / mLのペニシリン-ストレプトマイシンを含むダルベッコの修飾イーグルス培地(DMEM)が含まれています。.
2. 2日後、各プレートの培地を新鮮な成長培地と交換します。
   注:LL / 2細胞には、接着細胞(数が多い)細胞と浮遊細胞の不均一な混合物が含まれています。
3. 2日後(4日目)、馴化培地を回収し、遠心分離(500 × g、10分)により細胞と破片を取り除きます。
4. 後で使用するために、調整された媒体のアリコートを液体窒素で凍結します。
   注:スフェロイドを馴化培地で処理するには、75%の新鮮な増殖培地と25%LLC馴化培地を組み合わせて使用します。

結果

間質血管画分(SVF)細胞の3D培養によるアディポスフェロイド
3D培養とコンフルエント2D培養の両方を、同じマウス鼠径WAT調製物(図1A、図1B)から採取した同じ数のSVF細胞でセットアップし、同じ実験プロトコルにかけて遺伝子発現マーカーを比較しました。誘導媒体で刺激されたスフェ?...

ディスカッション

このプロトコールは、WATの初代SVF細胞に由来する脂肪細胞の脂肪細胞分化を研究するための3D細胞培養システムを設定します。従来の2D接着培養と比較して、この3Dシステムは、in vivo条件によく似たATリモデリングを容易にします。ここ数年の研究によると、3Dで細胞を培養すると、2D培養システムと比較して、異なる細胞形態とシグナル伝達が得られることが示され?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-5879	Cell culture
96-Well Bioprinting Kit, black	Greiner (Monroe, NC, USA)	655841	Cell culture
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-606-152	Immunofluorescence staining, secondary, 1:400 in TBS with 0.1% Tween-20
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM, µCLEAR, BLACK, CELLSTAR, CELL-REPELLENT SURFACE, LID, STERILE, 8 PCS./BAG	Greiner (Monroe, NC, USA)	655976	Cell culture
Dexamethasone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D-1756	Cell culture
DMEM	Corning (Manassas, VA, USA)	10-017-CV	Cell culture
Fetal Bovine Serum (Tova)	Gemini Bio (West Sacramento, CA)	100-500	Cell culture
Indomethacin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-7378	Cell culture
Insulin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I0516	Cell culture
LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)	American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)	CRL-1642	Lewis Lung Carcinoma cell line
NanoShuttle-PL	Greiner (Monroe, NC, USA)	657843	Cell culture
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	ThermoFisher (Waltham, MA, USA)	R37606	Immunofluorescence staining, following the manufacturer's instructions
Pen strep	Corning (Manassas, VA, USA)	30-002-CI	Cell culture
Perilipin-1 (D1D8) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)	9349	Immunofluorescence staining, primary, 1:1000 in TBS with 0.1% Tween-20
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	R-2408	Cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05%	Corning (Manassas, VA, USA)	25-052-CI	Cell culture
Reverse-transcription PCR primers
Primer	Forward	Reverse
Adipoq	GTTCCCAATGTACCCATTCGC	TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
Col4a1	TCCAAGGGCGAAGTGGGTTT	ACCCTTGCTCGCCTTTGACT
Cyclophilin a	ATGGCACTGGCGGCAGGTCC	TTGCCATTCCTGGACCCAAA
Fabp4	TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG	TCCAGGCCTCTTCCTTTGGCTCA
Fn1	GCTTCCCCAACTGGTTACCCT	GGGTTGGTGATGAAGGGGGT
Pgc1a	GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG	GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG
Ucp1	TCCTAGGGACCATCACCACCC	AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC
Mouse genotyping
Primer name	Description	Sequence
Cre F	Generic Cre forward	GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre R	Generic Cre reverse	GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318	mT/mG forward	CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT
oIMR7319	mT/mG wild type reverse	CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320	mT/mG mutant reverse	TCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336	UCP1 mutant forward	CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC
WH337	UCP1 mutant reverse	GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338	UCP1 wild type forward	GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT
WH339	UCP1 wild type reverse	GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C