악액질에 의한 백색 지방 조직 리모델링을 연구하기 위한 모델로서의 3차원 지방세포 배양

요약

이 프로토콜은 암세포의 조건화된 배지에 의해 유도된 백색 지방 조직(WAT) 리모델링의 해부를 허용하는 3차원(3D) 자기 인쇄 배양 시스템을 설명합니다. 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 UCP1+ 지방세포의 3D 배양 시스템을 사용하여 지방 조직 리모델링에 기여하는 베이지색 지방세포를 연구할 수 있습니다.

초록

암 악액질(CC)은 여러 증상을 보이는 증후군으로 나타나며, 현저한 다기관 대사 불균형을 유발합니다. 최근에는 악액질 소모가 지방 조직 및 뇌 및 근육과 같은 다른 조직의 통합 생리를 방해할 수 있는 여러 염증 매개체에 의해 자극되는 것으로 제안되었습니다. 이 시나리오에서 종양은 숙주의 비용으로 생존할 수 있습니다. 최근의 임상 연구에서, 다양한 지방 침전물의 고갈 강도는 환자의 생존 결과와 음의 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다. 연구에 따르면 다양한 대사 장애는 특히 악액질 발달의 초기 단계에서 백색 지방 조직(WAT) 리모델링을 변경할 수 있습니다. 조직 리모델링으로 인한 WAT 기능 장애는 전반적인 악액질의 원인이며, WAT의 주요 변형은 형태 기능 변화, 지방 세포 지방 분해 증가, 면역 세포 축적, 지방 형성 감소, 전구 세포 집단의 변화 및 베이지색/브라이트 세포를 포함하는 "틈새"의 증가로 구성됩니다.

악액질에 의한 WAT 리모델링의 다양한 측면, 특히 전구 세포와 베이지색 리모델링의 변화를 연구하기 위해 2차원(2D) 배양이 체외 연구의 첫 번째 옵션이었습니다. 그러나 이 방법은 WAT 복잡성을 적절하게 요약하지 않습니다. 기능적 AT ex vivo의 재구성을 위한 개선된 분석은 서로 다른 세포 집단 간의 생리학적 상호 작용을 이해하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜은 자성 나노 입자를 기반으로 하는 효율적인 3차원(3D) 프린팅 조직 배양 시스템을 설명합니다. 이 프로토콜은 악액질 유도 인자(CIF)에 의해 유도된 WAT 리모델링을 조사하는 데 최적화되어 있습니다. 그 결과, 3D 배양은 생체 외 WAT 모델링을 연구하는 데 적합한 도구이며, 개별 지방 세포 집단에 대한 생체 활성 분자를 식별하고 WAT 기반 세포 항악질 요법의 발견을 돕기 위한 기능 스크리닝에 유용할 수 있음을 보여줍니다.

서문

살아있는 유기체는 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호 작용과 영양소 및 세포에 대한 정교한 수송 역학을 가진 3D 미세환경의 세포로 구성됩니다 ^1,2. 그러나 세포 생물학에서 얻은 대부분의 기본 지식은 단층 세포 배양(2D)을 사용하여 생성되었습니다. 2D 배양은 일부 기계론적 질문에 답할 수 있지만, 이 접근 방식은 세포가 상주하는 자연 환경을 부적절하게 요약하고 복잡한 약물 반응을 예측하는 것과 양립할 수 없습니다¹. 또한 세포는 기계 전달을 통해 물리적 환경을 감지합니다. 실제로, 기계적 힘은 궁극적으로 유전자 발현 패턴과 세포의 운명에 영향을 미치는 생화학적 신호로 변환됩니다. 지난 수십 년 동안 3D 조직 배양은 생체 내 미세환경을 보다 충실하게 모방할 수 있는 새로운 체외 도구로 부상했습니다. 이를 통해 체외 2D 접근 방식³에서 생성되는 몇 가지 기계론적 함정을 피할 수 있습니다.

암 악액질(CC)은 여러 증상이 나타나는 증후군으로 정의되며, 현저한 다기관 대사 불균형을 유발합니다. 악액질이 발달하는 동안 WAT는 지방 세포 지방 분해 증가, 면역 세포 축적, 지방 형성 감소, 전구 세포 집단 변화, 베이지색/브라이트 세포를 포함하는 "틈새" 증가(베이지색 리^모델링)4. 그러나 체외 모델을 사용하여 악액질이 WAT 리모델링에 영향을 미치는 메커니즘을 요약하는 것은 중요한 기술적 과제를 제시합니다. 실제로, 종양/조직 커뮤니케이션에 대한 조사를 시도한 일부 연구에서는 WAT의 3D 미세환경의 복잡성을 우회하기 위해 단층 체외 세포 배양(2D)을 사용했습니다.

여러 가지 실험적 접근법이 3D 배양을 생성하지만, 지방 다면체를 생성하기 위해서는 자기 부상 또는 프린팅(magnetic levitation or printing)⁵, 행잉 드롭(hanging drop⁾⁶, 마트리겔 스캐폴드 시스템(Matrigel-scaffold systems⁾⁷의 세 가지 조립 방법이 선호됩니다. 지방분해체에 적합함에도 불구하고 이러한 시스템에는 장점과 단점이 있으므로 각 실험 설계의 특성에 따라 선택해야 합니다. 위에서 언급한 한계에 따라 자기 프린팅 방법을 사용하여 3D 세포 배양물⁵을 생성했습니다. 이 방법은 금 나노 입자와 산화철로 구성된 자성 나노 입자 어셈블리를 사용하여 대부분의 세포 유형에 적합한 인쇄 방법을 만듭니다. 여기에서는 3D 세포 배양을 사용하여 지방 형성을 유도하고, CIF를 사용하여 CC의 환경 조건을 재현했습니다.

프로토콜

1. 자성 나노 입자를 이용한 2D 세포 배양

1. 표준 세포 배양 절차를 사용하여 부착성 2D 배양을 ~ 70% confluence까지 성장시킵니다.
2. 자성 나노입자 어셈블리를 제조합니다. 냉장고에서 꺼내 실온(20-25°C)으로 약 15^{분 예}열 1.
3. 혼합 배지: 100mm 세포 배양 플레이트에 있는 12mL의 배지에 자성 나노 입자를 직접 추가합니다. 매체를 몇 번 현탁 및 재현탁하여 나노 입자의 균일한 분포를 얻습니다.
   알림: 매체는 산화철의 갈색 때문에 어둡게 나타납니다. 배양 면적의 2.5 μL/^cm2 농도가 권장됩니다.
4. 100mm 2D 배양 플레이트를 인산염 완충 식염수(PBS)로 세 번 세척합니다.
5. 1.3단계에서 혼합된 배지 12mL를 100mm 세포 배양 플레이트에 추가합니다. 자성 나노 입자가 세포에 부착 될 수 있도록 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO₂)에서 밤새 플레이트를 배양합니다.

2. 96웰 플레이트에서 스페로이드 어셈블리로 3D 배양 생성

1. 하룻밤 배양 후 세포를 세척하여 3 x 10mL의 PBS로 플레이트를 부드럽게 교반하여 잔류 매체 및 부착되지 않은 자성 나노 입자를 제거합니다.
2. 페트리 접시에서 PBS를 흡인하고 37°C에서 2-5분 동안 0.25% 트립신-에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA) 용액으로 배양하여 세포를 분리합니다.
3. 세포가 분리될 때까지 기다리는 동안 자기 드라이브를 70% 에탄올로 소독합니다¹.
4. 세포가 분리된 후 트립신-EDTA 용액 부피의 4배에 혈청 함유 배지를 첨가하여 트립신의 효과를 중화한 다음 현탁액을 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
5. 현탁액을 500×g에서 10 분 동안 원 심분리합니다. 상등액을 흡입하고 펠릿을 만지지 않도록 주의하십시오.
   참고: 원심분리 후 세포는 갈색으로 보여야 하며 배지의 세포 현탁액은 평소보다 어둡게 나타나야 합니다. 세포는 나노 입자로 뒤덮인 것처럼 보여야^{합니다 1}.
6. 현탁액의 세포를 계수하고 3D 배양을 생성하는 데 필요한 중간 부피의 부피를 계산합니다. 지방세포체의 경우, 96-well plates의 150 μL에 있는 5,000 - 10,000개의 세포를 사용합니다.
7. 96웰 바이오프린팅 키트를 사용하여 세포 발피성 96웰 플레이트를 스페로이드 드라이브 상단에 놓습니다.
8. 150μL의 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅하고 플레이트를 닫아 세포가 자석 형태로 바닥에 응집될 수 있도록 합니다.
9. 인큐베이터의 스페로이드 드라이브에 있는 플레이트를 1-2시간 동안 그대로 두어 유능한 스페로이드를 생성합니다.
   참고: 이러한 배양은 조밀하고 갈색으로 나타나야 하며 플레이트에 인쇄되어야 합니다(그림 S1). 그림 S2 는 96웰 플레이트에서 스페로이드 어셈블리의 3D 자기 프린팅의 주요 단계에 대한 요약 워크플로우를 보여줍니다.

3. 백색 지방 형성 유도

1. 유지 보수 및 유도 매체 준비⁸; 매번 사용하기 전에 유도 매체를 준비하십시오.
   1. 5μg/mL의 인슐린(1주일 동안 4°C에서 10mg/mL 스톡) 및 0.5μM 로시글리타존(디메틸설폭사이드(DMSO)의 10mM 스톡)을 포함하는 유지 배지를 준비합니다.
   2. 에탄올 중 0.125M 스톡에서 125μM 인도메타신, 에탄올 중 2mg/mL 스톡에서 2μg/mL의 덱사메타손, DMSO의 0.25M 스톡에서 0.5mM 이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX) 및 DMSO의 10mM 스톡에서 0.5μM 로시글리타존을 포함하는 유도 배지를 준비합니다.
      알림: 인도메타신을 60°C로 가열하여 녹입니다.
2. 프린팅 스페로이드 24-48시간 후 일반 완전 배지를 유도 배지(0일)로 교체합니다.
3. 48시간(2일차) 후 유도 매체를 유지 관리 매체로 교체하십시오.
4. 세포가 완전히 분화될 때까지 3-5일마다 배지를 교체하십시오.
   참고: 일반적으로 유도 배지로 자극한 후 7-8일 후에 세포는 성숙한 지방 세포로 분화하고 지방 다면체의 가장자리에서 볼 수 있는 기름 방울로 채워집니다.

4. 루이스 폐암 조절 배지(LLC-CM) 생산

1. 6000 cells/cm²의 밀도로 성장 배지에서 100mm 세포 배양 플레이트에 있는 Seed Lewis 폐 암종(LL/2) 세포.
   참고: 성장 배지에는 10% 소 태아 혈청(FBS)과 100U/mL의 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM)가 포함되어 있습니다.
2. 2일 후, 각 플레이트의 배지를 신선한 성장 배지로 교체하십시오.
   참고: LL/2 세포는 부착 세포(더 높은 수)와 부동 세포의 이질적인 혼합을 포함합니다.
3. 2일(4일차) 후 컨디셔닝된 배지를 수확하고 원심분리(500 × g, 10분)로 세포와 파편을 제거합니다.
4. 나중에 사용할 수 있도록 조절된 배지의 부분 표본을 액체 질소에 동결합니다.
   알림: 컨디셔닝 배지로 스페로이드를 처리하려면 75% 신선 성장 배지와 25% LLC 컨디셔닝 배지의 조합을 사용하십시오.

결과

기질 혈관 분획(SVF) 세포의 3D 배양에서 유래한 지방스페로이드
3D 및 컨플루언드 2D 배양은 동일한 마우스 서혜부 WAT 제제(그림 1A, 그림 1B)에서 동일한 수의 SVF 세포로 설정하고 유전자 발현 마커를 비교하기 위해 동일한 실험 프로토콜을 적용했습니다. 유도 매질로 자극된 스페로이드는 ...

토론

이 프로토콜은 WAT의 1차 SVF 세포에서 유래한 지방세포의 지방세포 분화를 연구하기 위한 3D 세포 배양 시스템을 설정합니다. 기존의 2D 부착 배양과 비교하여 이 3D 시스템은 생체 내 조건과 매우 유사한 AT 리모델링을 용이하게 합니다. 지난 몇 년 동안 연구에 따르면 세포를 3D로 배양하면 2D 배양 시스템에 비해 뚜렷한 세포 형태와 신호가 생성되는 것으로 나타났습니다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-5879	Cell culture
96-Well Bioprinting Kit, black	Greiner (Monroe, NC, USA)	655841	Cell culture
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-606-152	Immunofluorescence staining, secondary, 1:400 in TBS with 0.1% Tween-20
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM, µCLEAR, BLACK, CELLSTAR, CELL-REPELLENT SURFACE, LID, STERILE, 8 PCS./BAG	Greiner (Monroe, NC, USA)	655976	Cell culture
Dexamethasone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D-1756	Cell culture
DMEM	Corning (Manassas, VA, USA)	10-017-CV	Cell culture
Fetal Bovine Serum (Tova)	Gemini Bio (West Sacramento, CA)	100-500	Cell culture
Indomethacin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-7378	Cell culture
Insulin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I0516	Cell culture
LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)	American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)	CRL-1642	Lewis Lung Carcinoma cell line
NanoShuttle-PL	Greiner (Monroe, NC, USA)	657843	Cell culture
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	ThermoFisher (Waltham, MA, USA)	R37606	Immunofluorescence staining, following the manufacturer's instructions
Pen strep	Corning (Manassas, VA, USA)	30-002-CI	Cell culture
Perilipin-1 (D1D8) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)	9349	Immunofluorescence staining, primary, 1:1000 in TBS with 0.1% Tween-20
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	R-2408	Cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05%	Corning (Manassas, VA, USA)	25-052-CI	Cell culture
Reverse-transcription PCR primers
Primer	Forward	Reverse
Adipoq	GTTCCCAATGTACCCATTCGC	TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
Col4a1	TCCAAGGGCGAAGTGGGTTT	ACCCTTGCTCGCCTTTGACT
Cyclophilin a	ATGGCACTGGCGGCAGGTCC	TTGCCATTCCTGGACCCAAA
Fabp4	TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG	TCCAGGCCTCTTCCTTTGGCTCA
Fn1	GCTTCCCCAACTGGTTACCCT	GGGTTGGTGATGAAGGGGGT
Pgc1a	GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG	GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG
Ucp1	TCCTAGGGACCATCACCACCC	AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC
Mouse genotyping
Primer name	Description	Sequence
Cre F	Generic Cre forward	GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre R	Generic Cre reverse	GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318	mT/mG forward	CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT
oIMR7319	mT/mG wild type reverse	CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320	mT/mG mutant reverse	TCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336	UCP1 mutant forward	CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC
WH337	UCP1 mutant reverse	GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338	UCP1 wild type forward	GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT
WH339	UCP1 wild type reverse	GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C