Cultura tridimensional de adipócitos como modelo para estudar a remodelação do tecido adiposo branco induzida por caquexia

Resumo

Este protocolo descreve um sistema de cultura de impressão magnética tridimensional (3D) que permite a dissecção da remodelação do tecido adiposo branco (WAT) induzida por um meio condicionado de células cancerígenas. O uso de um sistema de cultura 3D de adipócitos UCP1+ que expressam uma proteína fluorescente verde (GFP) permite o estudo de adipócitos bege que contribuem para a remodelação do tecido adiposo.

Resumo

A caquexia do câncer (CC) apresenta-se como uma síndrome com múltiplas manifestações, causando um acentuado desequilíbrio metabólico de múltiplos órgãos. Recentemente, foi proposto que a perda caquética seja estimulada por vários mediadores inflamatórios, que podem perturbar a fisiologia integrativa dos tecidos adiposos e outros tecidos, como o cérebro e o músculo. Nesse cenário, o tumor pode sobreviver às custas do hospedeiro. Em pesquisas clínicas recentes, a intensidade da depleção dos diferentes depósitos de gordura tem sido negativamente correlacionada com o resultado de sobrevida do paciente. Estudos também mostraram que vários distúrbios metabólicos podem alterar a remodelação do tecido adiposo branco (TAB), especialmente nos estágios iniciais do desenvolvimento da caquexia. A disfunção do WAT resultante da remodelação do tecido é um contribuinte para a caquexia geral, com as principais modificações no WAT consistindo em alterações morfofuncionais, aumento da lipólise dos adipócitos, acúmulo de células imunes, redução da adipogênese, alterações na população de células progenitoras e aumento de "nichos" contendo células bege / brite.

Para estudar as várias facetas da remodelação do WAT induzida por caquexia, particularmente as alterações das células progenitoras e a remodelação bege, a cultura bidimensional (2D) tem sido a primeira opção para estudos in vitro. No entanto, essa abordagem não resume adequadamente a complexidade do WATT. Ensaios aprimorados para a reconstrução do TA funcional ex vivo ajudam na compreensão das interações fisiológicas entre as distintas populações celulares. Este protocolo descreve um eficiente sistema de cultura de tecidos de impressão tridimensional (3D) baseado em nanopartículas magnéticas. O protocolo é otimizado para investigar o remodelamento do WAT induzido por fatores induzidos por caquexia (CIFs). Os resultados mostram que uma cultura 3D é uma ferramenta apropriada para estudar a modelagem WAT ex vivo e pode ser útil para telas funcionais para identificar moléculas bioativas para aplicações individuais de populações de células adiposas e auxiliar na descoberta de terapia anticaquética celular baseada em WAT.

Introdução

Os organismos vivos são compostos de células em microambientes 3D com interação célula-célula e célula-matriz e elaboram dinâmicas de transporte de nutrientes e células ^1,2. No entanto, a maior parte do conhecimento fundamental adquirido em biologia celular foi gerado usando cultura de células monocamada (2D). Embora a cultura 2D possa responder a algumas das questões mecanicistas, essa abordagem recapitula inadequadamente o ambiente natural em que as células residem e pode ser incompatível com a previsão de uma resposta complexa a medicamentos¹. Além disso, as células sentem seu ambiente físico por meio da mecanotransdução. De fato, as forças mecânicas são traduzidas em sinais bioquímicos que, em última análise, influenciam os padrões de expressão gênica e o destino da célula. Nas últimas décadas, a cultura de tecidos 3D surgiu como uma nova ferramenta in vitro que pode mimetizar o microambiente in vivo com maior fidelidade. Isso pode evitar algumas armadilhas mecanicistas geradas por abordagens 2D in vitro³.

A caquexia do câncer (CC) é definida como uma síndrome com múltiplas manifestações, causando um desequilíbrio metabólico acentuado de múltiplos órgãos. Durante o desenvolvimento da caquexia, o WAT sofre inúmeras alterações morfológicas, resultando em aumento da lipólise dos adipócitos, acúmulo de células imunes, redução da adipogênese, alterações na população de células progenitoras e aumento de "nichos" contendo células bege/brite (remodelação bege)⁴. No entanto, recapitular o mecanismo pelo qual a caquexia afeta o remodelamento do WAT usando modelos in vitro apresenta um desafio técnico significativo. De fato, alguns estudos que tentaram investigar a comunicação tumor/tecido usaram cultura de células in vitro (2D) em monocamada, contornando a complexidade do microambiente 3D do WAT.

Embora várias abordagens experimentais gerem cultura 3D, três métodos de montagem diferentes são preferidos para produzir adiposferoides: levitação magnética ou impressão⁵, gota suspensa⁶ e sistemas de andaime Matrigel⁷. Apesar de serem apropriados para adiposferoides, esses sistemas apresentam vantagens e desvantagens e devem ser escolhidos de acordo com as características de cada desenho experimental. Com base nas limitações mencionadas acima, o método de impressão magnética foi usado para gerar culturas de células 3D⁵. Este método usa um conjunto de nanopartículas magnéticas que consiste em nanopartículas de ouro e óxido de ferro, tornando o método de impressão adequado para a maioria dos tipos de células. Aqui, culturas de células 3D foram usadas para induzir a adipogênese e CIFs foram usados para reproduzir a condição ambiental do CC.

Protocolo

1. Incubação de células 2D com nanopartículas magnéticas

1. Cultive culturas 2D aderentes a ~ 70% de confluência usando procedimentos padrão de cultura de células.
2. Prepare o conjunto de nanopartículas magnéticas. Retire da geladeira e deixe aquecer até a temperatura ambiente (20-25 °C) por cerca de 15 min¹.
3. Meio misto: Adicione as nanopartículas magnéticas diretamente a 12 mL de meio em placas de cultura de células de 100 mm. Suspenda e ressuspenda o meio algumas vezes para obter uma distribuição homogênea das nanopartículas.
   NOTA: O meio parecerá escuro por causa da cor marrom do óxido de ferro. Recomenda-se uma concentração de 2,5 μL/^cm2 da área de cultura.
4. Lave a placa de cultura 2D de 100 mm três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
5. Adicionar 12 ml do meio misto do passo 1.3 às placas de cultura de células de 100 mm. Incubar as placas durante a noite em uma incubadora (37 °C, 5% CO₂) para permitir a fixação das nanopartículas magnéticas às células

2. Criação de culturas 3D com montagem de esferóides em placas de 96 poços

1. Após a incubação durante a noite, lave as células para remover qualquer meio residual e nanopartículas magnéticas não aderidas, agitando suavemente as placas com 3 x 10 mL de PBS.
2. Aspire o PBS da placa de Petri e separe as células por incubação com solução de ácido tripsina-etilenodiamina tetracético (EDTA) a 0,25% por 2-5 min a 37 ° C.
3. Enquanto espera que as células se desprendam, desinfete os acionamentos magnéticos com etanol a 70%¹.
4. Depois que as células se separarem, adicione meio contendo soro a 4x o volume da solução de tripsina-EDTA para neutralizar o efeito da tripsina e, em seguida, transfira a suspensão para um tubo cônico.
5. Centrifugar a suspensão a 500 × g durante 10 min. Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não tocar no pellet.
   NOTA: Após a centrifugação, as células devem parecer marrons e as suspensões celulares em meio devem parecer mais escuras do que o normal. As células devem aparecer salpicadas com as nanopartículas¹.
6. Conte as células em suspensão e calcule o volume de volumes médios necessários para criar culturas 3D. Para adiposferóides, use 5.000 a 10.000 células em 150 μL em placas de 96 poços.
7. Usando um kit de bioimpressão de 96 poços, coloque uma placa de 96 poços repelente de células na parte superior do Spheroid Drive.
8. Pipetar 150 μL de suspensão de células em cada poço da placa de 96 poços e fechar a placa para permitir que as células se agreguem no fundo na forma de um ímã.
9. Deixe a placa na unidade esferóide na incubadora por 1-2 h para produzir um esferóide competente.
   NOTA: Essas culturas devem parecer densas e marrons e devem ser impressas na placa (Figura S1). A Figura S2 apresenta um fluxo de trabalho resumido das principais etapas da impressão magnética 3D da montagem de esferóides em placas de 96 poços.

3. Indução de adipogênese branca

1. Preparar meios de manutenção e indução⁸; Prepare o meio de indução antes de cada uso.
   1. Prepare um meio de manutenção contendo 5 μg / mL de insulina (estoque de 10 mg / mL armazenado a 4 ° C por uma semana) e 0,5 μM de rosiglitazona (estoque de 10 mM em dimetilsulfóxido (DMSO)).
   2. Prepare o meio de indução contendo 125 μM de indometacina de um estoque de 0,125 M em etanol, 2 μg / mL de dexametasona de um estoque de 2 mg / mL em etanol, 0,5 mM de isobutil-1-metilxantina (IBMX) de um estoque de 0,25 M em DMSO e 0,5 μM de rosiglitazona de um estoque de 10 mM em DMSO.
      NOTA: Aqueça a indometacina a 60 °C para dissolver.
2. Após 24-48 h de impressão de esferóides, substitua o meio completo regular pelo meio de indução (dia 0).
3. Após 48 h (dia 2), substitua o meio de indução pelo meio de manutenção.
4. Troque o meio a cada 3-5 dias até que as células estejam totalmente diferenciadas.
   NOTA: Geralmente, após 7-8 dias de estimulação com o meio de indução, as células se diferenciam em células de gordura maduras e são preenchidas com gotículas de óleo que podem ser vistas nas bordas dos adiposferóides.

4. Produção de meio condicionado de carcinoma de pulmão de Lewis (LLC-CM)

1. Sementes de células de carcinoma de pulmão de Lewis (LL/2) em placas de cultura de células de 100 mm em meio de crescimento a uma densidade de 6000 células/cm².
   NOTA: O meio de crescimento contém meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina.
2. Após 2 dias, substitua o meio em cada placa por meio de crescimento fresco.
   NOTA: As células LL/2 contêm uma mistura heterogênea de células aderentes (maior número) e flutuantes.
3. Após 2 dias (dia 4), colher o meio condicionado e limpá-lo de células e detritos por centrifugação (500 × g, 10 min).
4. Congelar alíquotas do meio condicionado em azoto líquido para utilização posterior.
   NOTA: Para tratar esferoides com o meio condicionado, use uma combinação de 75% de meio de crescimento fresco e 25% de meio condicionado LLC.

Resultados

Adiposferoides de cultura 3D de células da fração vascular estromal (SVF)
As culturas 3D e 2D confluentes foram montadas com o mesmo número de células SVF da mesma preparação WAT inguinal de camundongo (Figura 1A, Figura 1B) e submetidas ao mesmo protocolo experimental para comparar o marcador de expressão gênica. Os esferoides estimulados com meio de indução expand...

Discussão

Este protocolo configura um sistema de cultura de células 3D para estudar a diferenciação de adipócitos em adiposferóides derivados de células SVF primárias de WAT. Comparado à cultura aderente 2D convencional, este sistema 3D facilita a remodelação de AT, que se assemelha muito às condições in vivo. Nos últimos anos, estudos mostraram que a cultura de células em 3D produz morfologia celular e sinalização distintas em comparação com um sistema de cultura 2D

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-5879	Cell culture
96-Well Bioprinting Kit, black	Greiner (Monroe, NC, USA)	655841	Cell culture
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-606-152	Immunofluorescence staining, secondary, 1:400 in TBS with 0.1% Tween-20
CELL CULTURE MICROPLATE, 96 WELL, PS, F-BOTTOM, µCLEAR, BLACK, CELLSTAR, CELL-REPELLENT SURFACE, LID, STERILE, 8 PCS./BAG	Greiner (Monroe, NC, USA)	655976	Cell culture
Dexamethasone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D-1756	Cell culture
DMEM	Corning (Manassas, VA, USA)	10-017-CV	Cell culture
Fetal Bovine Serum (Tova)	Gemini Bio (West Sacramento, CA)	100-500	Cell culture
Indomethacin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I-7378	Cell culture
Insulin	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	I0516	Cell culture
LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)	American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)	CRL-1642	Lewis Lung Carcinoma cell line
NanoShuttle-PL	Greiner (Monroe, NC, USA)	657843	Cell culture
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)	ThermoFisher (Waltham, MA, USA)	R37606	Immunofluorescence staining, following the manufacturer's instructions
Pen strep	Corning (Manassas, VA, USA)	30-002-CI	Cell culture
Perilipin-1 (D1D8) XP Rabbit mAb	Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)	9349	Immunofluorescence staining, primary, 1:1000 in TBS with 0.1% Tween-20
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	R-2408	Cell culture
Trypsin-EDTA, 0.05%	Corning (Manassas, VA, USA)	25-052-CI	Cell culture
Reverse-transcription PCR primers
Primer	Forward	Reverse
Adipoq	GTTCCCAATGTACCCATTCGC	TGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
Col4a1	TCCAAGGGCGAAGTGGGTTT	ACCCTTGCTCGCCTTTGACT
Cyclophilin a	ATGGCACTGGCGGCAGGTCC	TTGCCATTCCTGGACCCAAA
Fabp4	TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATG	TCCAGGCCTCTTCCTTTGGCTCA
Fn1	GCTTCCCCAACTGGTTACCCT	GGGTTGGTGATGAAGGGGGT
Pgc1a	GAAAACAGGAACAGCAGCAGAG	GGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG
Ucp1	TCCTAGGGACCATCACCACCC	AGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC
Mouse genotyping
Primer name	Description	Sequence
Cre F	Generic Cre forward	GCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre R	Generic Cre reverse	GTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318	mT/mG forward	CTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT
oIMR7319	mT/mG wild type reverse	CGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320	mT/mG mutant reverse	TCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336	UCP1 mutant forward	CAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC
WH337	UCP1 mutant reverse	GTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338	UCP1 wild type forward	GGT CAG CCT AAT TAG CTC TGT
WH339	UCP1 wild type reverse	GAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C