إلغاء التفكيك لمجمع مورين لأمراض القلب والعقد

Summary

يهدف هذا البروتوكول إلى تداعي قلب ورئتي الفئران. يمكن أن تكون سقالات المصفوفة خارج الخلية الناتجة (ECM) ملطخة بالمناعة ومصورة لرسم خريطة لموقع وتضاريم مكوناتها.

Abstract

نقدم هنا بروتوكول التفكيك لقلب الفأر والرئتين. وتنتج سقالات ECM الهيكلية التي يمكن استخدامها لتحليل طوبولوجيا ECM وتكوينها. وهو يقوم على إجراء جراحي دقيق مصمم لقسطرة القصبة الهوائية والأورطة من فأر القتل الرحيم لتشويش القلب والرئتين مع عوامل التفكيك. يمكن أن يكون مجمع القلب الرئوي الديسيلي في وقت لاحق ملطخا بالمناعة للكشف عن موقع بروتينات ECM الهيكلية. يمكن الانتهاء من الإجراء بأكمله في 4 أيام.

سقالات ECM الناتجة عن هذا البروتوكول خالية من التشوهات الأبعاد. غياب الخلايا يتيح الفحص الهيكلي للهياكل ECM وصولا الى قرار submicron في 3D. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الأنسجة السليمة والمرضية من الفئران التي لا تتجاوز أعمارهم 4 أسابيع ، بما في ذلك نماذج الماوس من التليف والسرطان ، مما يفتح الطريق لتحديد إعادة عرض ECM المرتبطة بمرض القلب والكون.

Introduction

و ECM هي شبكة ثلاثية الأبعاد مصنوعة من البروتينات والجلوكان التي تستوعب جميع الخلايا في كائن متعدد الخلايا، وإعطاء الأعضاء شكلها وتنظيم سلوك الخلية طوال ^{الحياة1}. من تخصيب البويضة فصاعدا، تقوم الخلايا ببناء وإعادة تشكيل ECM، وبالتالي يتم التحكم فيها بدقة من قبلها. الغرض من هذا البروتوكول هو فتح طريقة لتحليل خريطة الفأر ECM ، حيث أن الفئران هي الكائن الحي النموذجي الأكثر استخداما في الفيزيولوجيا المرضية للثدييات.

وكان الدافع وراء تطوير هذه الطريقة هو الحاجة إلى توصيف وعزل ^ECM2 الأصلي المرتبط بالنقائل. نظرا لأن الأورام تفتقر إلى الأوعية الدموية التشريحية المناسبة والفئران هي كائنات صغيرة نسبيا ، فقد تم تصميم الإجراءات الجراحية الدقيقة لقسطرة الشريان الأورطي إلى الوراء ، مع عزل دوران الأوعية الرئيسية المؤدية إلى الورم (على سبيل المثال ، الأوردة الرئوية) ، وبالتالي تركيز تدفق الكاشف والسماح بإزالة الورم. تنتج هذه الطريقة سقالات ECM مع هيكل ^محفوظ2 يمكن أن يكون ملطخا بالمناعة ومصورا ، مما يسمح برسم خرائط بنية ECM بتفاصيل submicron. لتنفيذ هذا البروتوكول، من الضروري اكتساب المهارات الجراحية والجراحية الدقيقة (تشريح، والتسوية الدقيقة والقسطرة) التي قد تمثل قيدا محتملا على استخدامه. على حد علمنا، تمثل هذه الطريقة أحدث ما في تحليل تصوير بنية ECM ^{الأصلي2,3}.

Protocol

وقد تم استعراض جميع الإجراءات المدرجة هنا والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية التي تنظم الطب التجريبي في جامعة كوبنهاغن وتتفق مع التشريعات الدنماركية والأوروبية. لإثبات هذا البروتوكول ، استخدمنا فئران BALB / cJ الأنثوية من عمر 8-12 أسبوعا وفأرة أنثى MMTV-PyMT تبلغ من العمر 11 أسبوعا.

ملاحظة: تجنب التلوث البكتيري سقالة ECM decellularized يعطي أفضل نتيجة التصوير ويسمح تخزين عينة على المدى الطويل. ولذلك فمن المهم للحفاظ على جميع الخطوات عقيمة. على هذا النحو، يجب أن تكون جميع الأدوات والمواد الجراحية، بما في ذلك خياطة، خياطة صغيرة، والحلول، والأنابيب، موصلات لوير والقسطرة، عقيمة. يجب تطهير الأسطح ، بما في ذلك صينية البوليسترين ، بالإيثانول بنسبة 70٪ ، ويفضل أن يتم التشوه تحت غطاء تدفق صفح. جميع الإجراءات تتم في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. الجراحة المجهرية بعد الوفاة

1. قتل الفأر باستخدام غرفة ثاني _أكسيد الكربون.
   1. ضع الماوس في غرفة 4 لتر، وابدأ في ملء مع _CO2 100٪، بدءا من 0.2 لتر / دقيقة لمدة 2 دقيقة، وزيادة حتى تصل إلى تدفق 0.8 لتر / دقيقة بعد 3 دقائق. يجب أن يسقط الماوس فاقدا للوعي خلال أول دقيقتين ، ثم يجب أن يتوقف التنفس (عادة حوالي 5 دقائق ، ولكن يمكن الحفاظ على التدفق حسب الضرورة). تأكيد الوفاة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
2. حلق الصدر والبطن وظهر الماوس مع مقص الشعر وتطهير مع الإيثانول 70٪. الحلاقة يقلل كثيرا من عدد القطع الأثرية بسبب وجود الشعر إما على عينات للتصوير أو التحليل الكيميائي الحيوي.
3. دبوس الماوس إلى صينية البوليسترين، وتمديد المصابيح الأمامية و hindlimbs، فضلا عن رأسه والذيل. ضعه تحت مجهر الجراحة المجهرية.
4. باستخدام مقص نمط مستقيم مايو إنشاء الوصول الجراحي مع شق جلدي يمتد من المنطقة تحت الفك السفلي إلى أسفل البطن وتشريح تحت الجلد لفضح جدار الصدر والحمور.
5. باستخدام مقص جراحي دقيق، وقطع العضلات الصدرية الرئيسية والصدرية طفيفة على طول الفضاء الوربي السادس على جانبي الجدار الصدري.
6. باستخدام مقص نمط مستقيم، وقطع القص على طول الشقوق السابقة، ومن ثم إكمال استئصال القص عن طريق قطع القص على طول محورها الطويل، ثم رفع ودبوس كلا الجانبين من الجدار الصدري لفضح مجمع القلب والعظمة.
7. باستخدام ملقط صغير مستدير الرؤوس (أو ملقط صغير من Dumont) ، اقتطع الغدة الصعترية والأنسجة الدهنية المحيطة بها عن طريق سحبها بدقة من ملحقاتها. هذا سيكشف عن السفن الرئيسية.
8. باستخدام الكي، الكي الوريد كافا تنازلي و، وذلك باستخدام مقص نمط مستقيم، وقطع المريء.
9. باستخدام ملقط صغير حاد ، افصل الأوردة البراتشيوسيفية والبراتشيوسيفال ، وترك الشرايين السباتية الشائعة واليسارية من الأنسجة الأساسية لتسهيل الربط والكي.
10. باستخدام حامل الإبرة الدقيقة ، ملقط صغير حاد و 9-0 غرز خياطة مكان فوق ظهور brachiocephalic ، تركت الشرايين السباتية الشائعة واليسارية تحت الترقوة.
11. كي الأوردة العضدية.
12. فصل الغدد اللعابية تحت الفك السفلي على طول خط الوسط لفضح عضلات الرقبة والرغامى. فصل العضلات لفضح الرباط الكريكوثيرويد. باستخدام مقص صغير، افتح مدخلا عن طريق تقسيم الرباط.
13. إدخال قسطرة 27 G في القصبة الهوائية ودفع بدقة حتى فروع القصبة الهوائية في القصبات الهوائية (أي، حتى يتم الوفاء بمقاومة القسطرة، ثم تراجع 3 ملم). كن حذرا من تعطيل الشعب الهوائية. باستخدام خياطة 6-0، ضع 3 غرز حول القصبة الهوائية لتأمين القسطرة.
14. قسم الماوس في ذروة الفقرة الصدرية 12th. الشريان الأورطي التنازلي يمتد بشكل مسبق إلى العمود الفقري وينبغي تقسيمه هنا جنبا إلى جنب مع العمود الفقري. تعيين النصف السفلي بعيدا.
15. القسطرة إلى الوراء الشريان الأورطي ودفع القسطرة حتى تصل إلى القوس الأبهري. باستخدام خياطة 9-0، ضع 4 غرز حول الشريان الأورطي، بداية من 5 مم تحت طرف القسطرة.

2. التفكيك

1. قم بتوصيل الماوس بنظام مضخة باستخدام أنابيب السيليكون وموصلات Luer. Perfuse مع الماء deionized في 200 ميكرولتر / دقيقة لمدة 15 دقيقة. الاحتفاظ بمعدل التدفق هذا أثناء التفكيك.
2. تغيير عامل التغلغل إلى 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم (DOC) المخفف في الماء deionized وتغلغل بين عشية وضحاها.
3. تغيير عامل التشوه إلى 0.1٪ من كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS) المخفف في الماء التأين والتشويش لمدة 8 ساعات.
4. Perfuse مع المياه deionized بين عشية وضحاها لغسل SDS وDOC لمدة 24 ساعة.
5. إعادة استئصال القلب والرئتين decellularized عن طريق تقسيم ملحقاتها إلى الصدر باستخدام مقص منحني وتخزينها في أنبوب التبريد العقيم مع الماء deionized مع 1٪ (v/v) البنسلين-streptomycin و 0.3 ميكرومتر الصوديوم azide في 4 درجة مئوية يمكن تخزين سقالات ECM لمدة 12 ^{أسبوعا على} الأقل. إذا كان سيتم استخدام السقالة للتحليل الكيميائي الحيوي (على سبيل المثال، قياس الطيف الكتلي)، تجميد المفاجئة في النيتروجين السائل.

3. التثبيط المناعي

1. تخطيط التصوير: تحديد الأجسام المضادة الأولية (أو الأجسام المضادة) والجمع بين الأجسام المضادة الثانوية المترافقة الفلورية لتتناسب مع بعضها البعض وتتناسب مع خطوط الليزر من المجهر الفلوري.
2. منع العينة عن طريق غمرها في cryotube تحتوي على 6٪ (v/v) مصل حمار - 3٪ (ث / v) ألبوم مصل البقر (BSA) بين عشية وضحاها.
3. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية (أو الأجسام المضادة) في مصل الحمير 3٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 24 ساعة.
4. غسل 5 مرات لمدة 1 ساعة في كل مرة في 0.05٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني (PBST).
5. احتضان العينة مع الأجسام المضادة الثانوية المقترنة الفلورية (أو الأجسام المضادة) في مصل حمار 3٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 24 ساعة.
6. غسل 5 مرات لمدة ساعة واحدة في 0.05٪ (PBST). انتظر 1 ساعة بين كل غسل.
7. أضف الماء المؤين واحفظه على بعد 4 درجات مئوية من الضوء المباشر. عند هذه النقطة ، سقالة على استعداد للصورة.

4. التصوير

1. ضع العينة في طبق ذو قاع زجاجي وترطيبها بقطرات من محلول التخزين (PBS أو الماء المؤين).
2. إعداد الهدف. نوصي باستخدام هدف غمر المياه.
3. فحص العينة باستخدام ضوء مضان.
4. التبديل إلى التحكم في الكمبيوتر. قم بتشغيل الليزر وضبط كثافة الليزر وفتحة الثقب والأطوال الموجية للكاشفات والكسب والدقة والتكبير. تعيين رقم وحجم الخطوة ل z-المكدس وبدء الاستحواذ. نوصي باستخدام الإثارة بالليزر متعددة الفوتون لزيادة اختراق الأنسجة وتقليل تشتت الضوء والتبييض وتلف الأنسجة.

5. تلطيخ هيماتوكسيلين إيوزين

1. استئصال 1 فص الرئة من فأر القتل الرحيم.
2. ضعه في 10 مم × 10 مم × 5 مم كريومولد وغطيه بما يقرب من 500 ميكرولتر من مركب OCT.
3. تجميد على الجليد الجاف (-70 درجة مئوية) والحفاظ على العينة في تلك الدرجة حرارة.
4. استئصال واحد فص الرئة decellularized من الماوس المعالجة وفقا للخطوة 2.5.
5. ضعه في cryomold مع أكبر مساحة سطحية لأسفل وغطيه بمجمع OCT كما هو محدد في الخطوة 5.2.
6. تجميد على الجليد الجاف (-70 درجة مئوية) والحفاظ على العينة في تلك الدرجة الحرارة حتى المطلوبة خلاف ذلك. يمكن تخزين العينة لمدة 12 أسبوعا على الأقل.
7. كتل الأنسجة المجمدة القسم في -20 درجة مئوية في cryostat مع سمك 5 ميكرومتر ووضع أقسام على الشرائح الزجاجية اللاصقة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
8. خذ الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة حتى يجف الهواء (حوالي 20 دقيقة).
9. تزج قريبا في برنامج تلفزيوني وإصلاح عن طريق غمر الشرائح في 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة. يغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم مرتين في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
10. تزج في محلول الهيماتوكسيلين ماير لمدة 10 دقيقة. هذه المرة يمكن تحسين وفقا لمصدر الأنسجة وإعداد وصمة عار.
11. يغسل في جرة كوبلين تحت الماء المقطر الجاري لمدة 10 دقائق.
12. تزج في حل إيوسين لمدة 7 دقائق. هذه المرة يمكن تحسين وفقا لمصدر الأنسجة وإعداد وصمة عار.
13. تراجع في الإيثانول 50٪ لإزالة اليوسين الزائد والجفاف عن طريق الانخفاض قريبا في الإيثانول 70٪، وفي 96٪ و 100٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية. تراجع في الزيلين عدة مرات.
14. تطبيق بضع قطرات من DPX تصاعد المتوسطة ووضع غطاء الزجاج.
15. اترك الشرائح لتجف بين عشية وضحاها تحت غطاء محرك السيارة الكيميائي.
16. مسح الشرائح ضوئيا في ماسح ضوئي للشرائح.

النتائج

الديسيلولارات القلبية الرئوية
بعد الانتهاء بنجاح من البروتوكول، والقلب والرئتين، فضلا عن الأنسجة الملحقة مثل القوس الأبهري، وسوف تكون خالية من الخلايا. يمكن التحقق من صحة Decellularization عن طريق تلطيخ hematoxylin-eosin (الشكل 1) من سقالات ECM التي تظهر إزالة ?...

Discussion

تقنيات إزالة الخلايا على أساس هياج الأنسجة تغيير هيكل ECM، مما يجعلها غير مناسبة لتحليل هيكل ^ECM4. الارتهاق الارتخائي ، باستخدام مسار تشريحي مثل الشريان الأورطي للرغامى ، يسمح بالوصول إلى السرير الشعري ، أو الحويصلات الهوائية الطرفية ، ويسهل تسليم عوامل التفكيك في جميع أنحاء ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)	Ethicon	6301124
9-0 micro-suture (Safil)	B Braun	G1048611
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12
Adson forceps with teeth	Fine Science Tools	11027-12
Castroviejo microneedle holder	Fine Science Tools	no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)	Leica	S6 D
Double-ended microspatula	Fine Science Tools	10091-12
Dumont microforceps (two)	Fine Science Tools	11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two)	Fine Science Tools	11251-35
Hair clippers	Oster	76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)	Fine Science Tools	12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)	BD	381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight)	Fine Science Tools	14110-15
Microforceps with ringed tips (two)	Aesculap	FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved)	Fine Science Tools	15001-08
Minicutter	KLS Martin	80-008-03-04
Molt Periostotome	Aesculap	D0543R
Needles (27 gauge; Microlance)	BD	21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin
Serrated scissors (CeramaCut, straight)	Fine Science Tools	14958-09
Spatula (Freer-Yasargil)	Aesculap	OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak)	BD	3021001
Syringes (10 mL; Plastipak)	BD	3021110
Tendon scissors (Walton)	Fine Science Tools	14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)	Serva	11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)	Millipore	AB756P	Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)			Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)	VWR	233-5364)
Serum (normal donkey serum)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
IMAGING
Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )	Leica
Fluorescence light source	Leica	EL6000
Microscope (inverted multiphoton microscope)	Leica	SP5-X MP
Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)	Leica	HCX PL APO
Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)
White-light laser (WLL)	Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water	Plum	1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)	World Precision Instruments	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Peristaltic pump (with 12 channels)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)	Ole Dich	31399
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate	Sigma-Aldrich	L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA	Fisher Scientific	15434389
96% Ethanol	Plum	201446-5L
Absolute ethanol	Plum	201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)	Hounisen	422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)	Tissue-Tek	4566
Cryostat	Leica	CM3050S
DPX mounting medium	Hounisen	1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5%	Sigma	1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)	Pfm medical	207500003
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)	Thermofisher	6319483
Mayers hematoxylin	Sigma	MHS32-1L
OCT compound	VWR	361603E
Slide scanner (Nanozoomer)	Hamamatsu Photonics
Xylene	Sigma	534056-4L