דקלולריזציה של קומפלקס הקרדיו-ריאות מורין

Summary

פרוטוקול זה נועד לבטל את הלב והריאות של עכברים. ניתן לחסן ולדמות את הפיגומים החוץ-תאיים (ECM) המתקבלים כדי למפות את המיקום והטופולוגיה של הרכיבים שלהם.

Abstract

אנו מציגים כאן פרוטוקול דפלולרציה ללב העכבר ולריאות. הוא מייצר פיגומי ECM מבניים שניתן להשתמש בהם כדי לנתח טופולוגיה והרכב ECM. הוא מבוסס על הליך מיקרו-כירורגי שנועד לצנתר את קנה הנשימה ואת אב העורקים של עכבר מורדם כדי לשוטט בלב ובריאות עם חומרים מנטרלים. קומפלקס קרדיו-ריאות decellularized לאחר מכן ניתן לחסן כדי לחשוף את המיקום של חלבוני ECM מבניים. ניתן להשלים את כל ההליך ב-4 ימים.

פיגומי ECM הנובעים מפרוטוקול זה נקיים מעיוותים ממדיים. היעדר תאים מאפשר בדיקה מבנית של מבני ECM עד לרזולוציית תת-מיקרון בתלת-ממד. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על רקמה בריאה וחולנית מעכברים בגיל 4 שבועות, כולל מודלים עכבר של פיברוזיס וסרטן, פתיחת הדרך כדי לקבוע ECM שיפוץ הקשורים למחלות לב ריאה.

Introduction

ה- ECM היא רשת תלת ממדית העשויה מחלבונים וגליקנים המתאימה לכל התאים באורגניזם רב-תאי, המעניקה לאיברים את צורתם ומווסתת את התנהגות התאים לאורך ^החיים1. מהפריית ביצית ואילך, תאים בונים ומשפצים את ה- ECM, והם נשלטים בקפדנות על ידי זה. מטרת פרוטוקול זה היא לפתוח דרך לנתח ולמפה את עכבר ECM, שכן עכברים הם האורגניזם המודל הנפוץ ביותר בפתופיזיולוגיה של יונקים.

ההתפתחות של שיטה זו הונעה על ידי הצורך לאפיין ולבודד ECM2 יליד גרורות ^{הקשורים} גרורות. כמו גידולים חסרים כלי דם אנטומיים נאותים ועכברים הם אורגניזמים קטנים יחסית, הליכים מיקרוכירורגיים תוכננו כדי להצטמצם בנסיגה של אב העורקים, תוך בידוד זרימת הכלי העיקרי המוביל לגידול (למשל, ורידים ריאתיים), ובכך למקד את זרימת ריאגנט ומאפשר דפלולרציה של הגידול. שיטה זו מייצרת פיגומי ECM עם מבנה ^שמור2 שניתן לחסן ולדמות, ומאפשרת מיפוי מבנה ECM בפירוט תת-מיקרון. כדי לבצע פרוטוקול זה, יש צורך לרכוש מיומנויות כירורגיות ומיקרוכירורגיות (ניתוח, מיקרו-uturing וצנתור) שעשויים לייצג מגבלה פוטנציאלית לשימוש בו. למיטב ידיעתנו, שיטה זו מייצגת את הארגון החדיש ביותר עבור ניתוח הדמיית מבנה ECM ^{מקורי2,3}.

Protocol

כל ההליכים הכלולים כאן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה האתית המסדירה את הרפואה הניסיונית באוניברסיטת קופנהגן ומסכימה עם החקיקה הדנית והאירופאית. כדי להדגים פרוטוקול זה, השתמשנו בעכברים נקבות BALB / cJ של 8-12 שבועות של עכבר נקבה MMTV-PyMT של גיל 11 שבועות.

הערה: הימנעות מזיהום חיידקי של פיגום ECM המוקלר מעניקה את תוצאות ההדמיה הטובות ביותר ומאפשרת אחסון מדגם לטווח ארוך. לכן חשוב לשמור על כל הצעדים סטריליים. ככזה, כל המכשירים והחומר הכירורגי, כולל תפר, מיקרו-תפר, פתרונות, צינורות, מחברי Luer וצנתרים, חייבים להיות סטריליים. משטחים, כולל מגש פוליסטירן, חייבים להיות מחוטאים עם 70% אתנול, ואת זלוף רצוי להתבצע תחת מכסה המנוע זרימה למינאר. כל ההליכים מתקיימים בטמפרטורת החדר, אלא אם צוין אחרת.

1. מיקרוכירורגיה שלאחר המוות

1. המתת חסד העכבר באמצעות תא _CO2 .
   1. מניחים את העכבר לתוך תא 4 ליטר, ולהתחיל למלא עם 100% _CO2, החל מ 0.2 L / min במשך 2 דקות, הגדלת עד להגיע לזרימה של 0.8 L / min לאחר 3 דקות. העכבר צריך ליפול מחוסר הכרה במהלך 2 הדקות הראשונות, ולאחר מכן הנשימה צריכה להיפסק (בדרך כלל סביב 5 דקות, אבל הזרימה יכולה להישמר לפי הצורך). אשר את המוות לפני שתמשיך לשלב הבא.
2. לגלח את בית החזה, הבטן ואת הגב של העכבר עם קוצץ השיער ולחטא עם 70% אתנול. גילוח מפחית מאוד את מספר הממצאים בשל נוכחות של שיער או על דגימות עבור הדמיה או ניתוח ביוכימי.
3. הצמד את העכבר למגש פוליסטירן, המרחיב את חזיתו ואת אחוריו, כמו גם את ראשו וזנבו. מניחים אותו מתחת למיקרוסקופ המיקרו-כירורגיה.
4. באמצעות מספריים דפוס ישר מאיו ליצור גישה כירורגית עם חתך עורי פועל מהאזור התת-קרקעי לבטן התחתונה ולניתח תת עורית כדי לחשוף את דופן בית החזה ואת הצפק.
5. באמצעות מספריים מיקרו-כירורגיים, חתכו את שרירי החזה העיקריים ואת שרירי החזה הקטנים לאורך החלל הבין-קוסטלי השישי משני צידי דופן בית החזה.
6. באמצעות מספריים בדפוס ישר, לחתוך את החזה לאורך החתכים הקודמים, ולאחר מכן להשלים כריתת חזה על ידי חיתוך ציר החזה לאורך הציר הארוך שלה, ולאחר מכן לרומם ולהצמיד את שני הצדדים של דופן בית החזה כדי לחשוף את קומפלקס הלבו-ריולאומי.
7. באמצעות מלקחיים זעירים עגולים (או מלקחיים זעירים של דומונט), מוציאים את התימוס ורקמת השומן שמסביב על ידי משיכתם בעדינות מההחזקות שלהם. זה יחשוף את כלי השיט העיקריים.
8. באמצעות cautery, לצרוב את וריד קאווה היורד, באמצעות מספריים דפוס ישר, לחתוך את הוושט.
9. באמצעות מלקחיים זעירים חדים, להפריד את הוורידים brachiocephalic ואת brachiocephalic, השאיר עורקים עורקים תת-בריקליים נפוצים מן הרקמה הבסיסית כדי להקל על קשירה וצרוב.
10. באמצעות מחזיק מחט מיקרו, מיקרו-מלקחיים חדים ותפרים במקום תפר 9-0 מעל הופעתו של brachiocephalic, השאיר עורקים עורקים נפוצים והעורקים התת-בריחיים השמאליים.
11. לצרוב את הוורידים brachiocephalic.
12. להפריד את בלוטות הרוק submandibular לאורך קו האמצע כדי לחשוף את שרירי הצוואר ואת קנה הנשימה. להפריד את השרירים כדי לחשוף את הרצועה cricothyroid. באמצעות מיקרו מספריים, לפתוח כניסה על ידי חתך הרצועה.
13. הציגו קטטר 27 גרם קנה הנשימה ולדחוף בעדינות עד קנה הנשימה מסתעף לתוך הסימפונות (כלומר, עד ההתנגדות לצנתר נפגש, ולאחר מכן לסגת 3 מ"מ). תיזהר לא לשבש את הסימפונות. בעזרת תפר 6-0, מניחים 3 תפרים סביב קנה הנשימה כדי לאבטח את הצנתר.
14. תחלק את העכבר בגובה החוליה ה-12 של בית החזה. באבי העורקים היורד פועל באופן הקדמי לעמוד השדרה ויש לחלק אותו כאן יחד עם עמוד השדרה. תבדיל את החצי התחתון.
15. מצטבטים בדיעבד את העורקים ודוחפים את הצנתר עד שהוא מגיע לקשת של בירי העורקים. בעזרת תפר 9-0, מניחים 4 תפרים סביב העורקים, החל מ-5 מ"מ מתחת לקצה הצנתר.

2. דפלולריזציה

1. חבר את העכבר למערכת משאבה באמצעות צינורות סיליקון ומחברי Luer. לטבול עם מים deionized ב 200 μL / דקה במשך 15 דקות. שמור על קצב זרימה זה במהלך הפחתה.
2. שנה את חומר הזילוף ל-0.5% נתרן דאוקסיכולאט (DOC) מדולל במים דה-יון ולפרוף בן לילה.
3. שנה את חומר זלוף ל 0.1% נתרן דודסיל סולפט (SDS) מדולל במים deionized ו perfuse במשך 8 שעות.
4. יש לטפטף מים דה-יונים למשך הלילה כדי לשטוף את ה-SDS וה-DOC למשך 24 שעות.
5. יש לכרות את הלב והריאות המנושלים על ידי חתך את זיקותיו לבית החזה באמצעות מספריים מעוקלות ולאחסן בצינור קריו סטרילי עם מים דה-יונים עם 1% (v/v) פניצילין-סטרפטומיצין ו 0.3 מיקרומטר נתרן אזיד ב 4 °C. פיגומי ECM ניתן לאחסן לפחות במשך 12 ^{שבועות1}. אם הפיגומים ישמשו לניתוח ביוכימי (למשל, ספקטרומטריית מסה), הצמדה להקפאה בחנקן נוזלי.

3. חיסונים

1. תכנן את ההדמיה: קבע נוגדנים ראשוניים (או נוגדנים) ואת השילוב של נוגדנים משניים מצומדים פלואורסצנטית כדי להתאים זה לזה ולהתאים את קווי הלייזר של מיקרוסקופ הפלואורסצנטיות.
2. לחסום את המדגם על ידי טבילה אותו cryotube המכיל 6% (v / v) סרום חמור - 3% (w / v) אלבומין סרום בקר (BSA) לילה.
3. דגירה עם נוגדן ראשוני (או נוגדנים) בסרום חמור 3% ב- PBS למשך 24 שעות.
4. לשטוף 5 פעמים במשך 1 שעות בכל פעם ב 0.05% tween 20 ב PBS (PBST).
5. לדגור את המדגם עם נוגדן משני מצומד פלואורסצנטי (או נוגדנים) בסרום חמור 3% ב- PBS למשך 24 שעות.
6. לשטוף 5 פעמים במשך שעה אחת ב 0.05% (PBST). המתן שעה בין כל שטיפה.
7. מוסיפים מים דה-יוניזציה ומאחסנים במרחק של 4 מעלות צלזיוס מאור ישיר. בשלב זה, הפיגומים מוכנים לתמונה.

4. הדמיה

1. מניחים את המדגם בצלחת עם תחתית זכוכית ולחים אותה עם שתי טיפות של פתרון אחסון (PBS או מים דה-יוניים).
2. הכן את המטרה. אנו ממליצים להשתמש במטרה טבילת מים.
3. בדוק את המדגם באמצעות אור פלואורסצנטיות.
4. עבור לבקרת מחשב. הפעל לייזרים ולהתאים את עוצמת הלייזר, צמצם חור הסיכה, גלאים אורכי גל, רווח, רזולוציה וזום. הגדר את המספר ואת גודל השלב עבור z-stack ולהתחיל רכישה. אנו ממליצים להשתמש עירור לייזר מולטי פוטוני כדי להגביר את חדירת הרקמות ולמזער את פיזור האור, ההלבנה ונזק לרקמות.

5. הכתמת המטוקסילין-אאוזין

1. Excise 1 אונת ריאות מעכבר מורדם.
2. מניחים ב 10 מ"מ x 10 מ"מ x 5 מ"מ cryomold לכסות אותו עם כ 500 μL של תרכובת OCT.
3. להקפיא על קרח יבש (-70 °C (70 °F) ולשמור על המדגם בטמפרטורה זו.
4. Excise אונה אחת ריאה decellularized מעכבר מעובד על פי שלב 2.5.
5. מניחים בקריומולד עם שטח הפנים הגדול ביותר למטה ולכסות אותו עם תרכובת OCT כפי שצוין בשלב 5.2.
6. יש להקפיא על קרח יבש (-70 מעלות צלזיוס) ולשמור על הדגימה בטמפרטורה זו עד שיידרש אחרת. ניתן לאחסן את הדגימה למשך 12 שבועות לפחות.
7. בלוקים רקמה קפואה סעיף ב -20 °C בקריוסטט עם עובי 5 מיקרומטר ומניחים חלקים על שקופיות זכוכית דבק ולאחסן ב -80 °C (80 °F).
8. יש ליטול את השקופיות לטמפרטורת החדר עד לייבוש האוויר (כ-20 דקות).
9. זמן קצר לטבול PBS ולתקן על ידי טבילת השקופיות ב 4% paraformaldehyde ב PBS במשך 15 דקות. לשטוף פעם אחת PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן פעמיים במים מזוקקים במשך 5 דקות.
10. תוכלו לטבול בתמיסת המטוקסילין של מאייר למשך 10 דקות. הפעם ניתן אופטימיזציה על פי מקור רקמה והכנת כתמים.
11. לשטוף בצנצנת קופלין מתחת מים מזוקקים זורמים במשך 10 דקות.
12. לטבול בפתרון אאוזין במשך 7 דקות. הפעם ניתן אופטימיזציה על פי מקור רקמה והכנת כתמים.
13. טובלים ב-50% אתנול כדי להסיר עודף אאוזין ומתייבשים תוך זמן קצר בטבילה ב-70% אתנול, וב-96% וב-100% אתנול למשך 30 שניות. טובלים בקסילן מספר פעמים.
14. יש למרוח כמה טיפות של הרכיבה על DPX בינונית ומניחים כיסוי זכוכית.
15. השאר שקופיות להתייבש לילה מתחת למכסה המנוע הכימי.
16. סרוק שקופיות בסורק שקופיות.

תוצאות

דפלולרציה לב-ריאה
לאחר השלמת הפרוטוקול בהצלחה, הלב והריאות, כמו גם רקמת נספח כגון קשת העורקים, יהיו נקיים מתאים. ניתן לאמת את ההקטוקסילין-אאוזין (איור 1) של פיגומי ECM המראים הסרה של הגרעינים בהשוואה לרקמה המקורית. פיגומים אלה שומרים על מידותיהם ש?...

Discussion

טכניקות Decellularization המבוססות על תסיסה רקמה לשנות מבנה ECM, מה שהופך אותם לא מתאים לניתוח מבנה ^ECM4. דטרמינוליזציה זלוף, באמצעות מסלול אנטומי כגון אב העורקים של קנה הנשימה, מאפשר להגיע למיטה נימי, או alveoli סופני, ומאפשר את המסירה של סוכנים decellularizing ברחבי האיבר. השימוש zwitterionic, אניוני ולא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)	Ethicon	6301124
9-0 micro-suture (Safil)	B Braun	G1048611
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12
Adson forceps with teeth	Fine Science Tools	11027-12
Castroviejo microneedle holder	Fine Science Tools	no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)	Leica	S6 D
Double-ended microspatula	Fine Science Tools	10091-12
Dumont microforceps (two)	Fine Science Tools	11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two)	Fine Science Tools	11251-35
Hair clippers	Oster	76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)	Fine Science Tools	12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)	BD	381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight)	Fine Science Tools	14110-15
Microforceps with ringed tips (two)	Aesculap	FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved)	Fine Science Tools	15001-08
Minicutter	KLS Martin	80-008-03-04
Molt Periostotome	Aesculap	D0543R
Needles (27 gauge; Microlance)	BD	21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin
Serrated scissors (CeramaCut, straight)	Fine Science Tools	14958-09
Spatula (Freer-Yasargil)	Aesculap	OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak)	BD	3021001
Syringes (10 mL; Plastipak)	BD	3021110
Tendon scissors (Walton)	Fine Science Tools	14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)	Serva	11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)	Millipore	AB756P	Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)			Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)	VWR	233-5364)
Serum (normal donkey serum)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
IMAGING
Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )	Leica
Fluorescence light source	Leica	EL6000
Microscope (inverted multiphoton microscope)	Leica	SP5-X MP
Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)	Leica	HCX PL APO
Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)
White-light laser (WLL)	Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water	Plum	1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)	World Precision Instruments	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Peristaltic pump (with 12 channels)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)	Ole Dich	31399
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate	Sigma-Aldrich	L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA	Fisher Scientific	15434389
96% Ethanol	Plum	201446-5L
Absolute ethanol	Plum	201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)	Hounisen	422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)	Tissue-Tek	4566
Cryostat	Leica	CM3050S
DPX mounting medium	Hounisen	1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5%	Sigma	1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)	Pfm medical	207500003
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)	Thermofisher	6319483
Mayers hematoxylin	Sigma	MHS32-1L
OCT compound	VWR	361603E
Slide scanner (Nanozoomer)	Hamamatsu Photonics
Xylene	Sigma	534056-4L