Децеллюляризация мышиного сердечно-легочного комплекса

Резюме

Этот протокол направлен на децеллюляризацию сердца и легких мышей. Полученные каркасы внеклеточного матрикса (ECM) могут быть иммуноокрашены и визуализированы для отображения местоположения и топологии их компонентов.

Аннотация

Мы представляем здесь протокол децеллюляризации сердца и легких мыши. Он создает структурные каркасы ECM, которые можно использовать для анализа топологии и состава ECM. Он основан на микрохирургической процедуре, предназначенной для катетеризации трахеи и аорты усыпленной мыши для перфузии сердца и легких децеллюляризирующими агентами. Децеллюляризованный сердечно-легочный комплекс впоследствии может быть иммуноокрашен, чтобы выявить расположение структурных белков ECM. Вся процедура может быть завершена за 4 дня.

Каркасы ECM, полученные в результате этого протокола, свободны от размерных искажений. Отсутствие ячеек позволяет проводить структурное исследование структур ECM вплоть до субмикронного разрешения в 3D. Этот протокол может быть применен к здоровым и больным тканям мышей в возрасте от 4 недель, включая мышиные модели фиброза и рака, открывая путь к определению ремоделирования ECM, связанного с сердечно-легочным заболеванием.

Введение

ECM представляет собой трехмерную сеть, состоящую из белков и гликанов, которая вмещает все клетки в многоклеточном организме, придавая органам их форму и регулируя поведение клеток на протяжении всей ^жизни1. Начиная с оплодотворения яйцеклеток, клетки строят и реконструируют ECM и, в свою очередь, строго контролируются им. Целью этого протокола является открытие способа анализа и картирования ECM мыши, поскольку мыши являются наиболее используемым модельным организмом в патофизиологии млекопитающих.

Развитие этого метода было обусловлено необходимостью охарактеризовать и изолировать связанный с метастазами нативный ^ECM2. Поскольку опухоли не имеют надлежащей анатомической васкуляризации, а мыши являются относительно небольшими организмами, микрохирургические процедуры были разработаны для ретроградной катетеризации аорты, при этом изолируя кровообращение основного сосуда, ведущего к опухоли (например, легочных вен), тем самым фокусируя поток реагентов и позволяя децеллюляризацию опухоли. Этот метод создает каркасы ECM с сохраненной ^{структурой2}, которые могут быть иммуноокрашены и визуализированы, что позволяет отображать структуру ECM в субмикронных деталях. Для выполнения этого протокола необходимо приобрести хирургические и микрохирургические навыки (рассечение, микрозащищение и катетеризация), которые могут представлять собой потенциальное ограничение его использования. Насколько нам известно, этот метод представляет собой современное состояние для анализа нативной структуры ^ECM2,3.

протокол

Все процедуры, включенные здесь, были рассмотрены и одобрены этическим комитетом, регулирующим экспериментальную медицину в Копенгагенском университете, и согласуются с датским и европейским законодательством. Чтобы продемонстрировать этот протокол, мы использовали самок мышей BALB / cJ в возрасте 8-12 недель и самку мыши MMTV-PyMT в возрасте 11 недель.

ПРИМЕЧАНИЕ: Предотвращение бактериального загрязнения децеллюляризированного каркаса ECM дает наилучший результат визуализации и позволяет длительное хранение образцов. Поэтому важно, чтобы все ступени были стерильными. Таким образом, все инструменты и хирургические материалы, включая шов, микрошов, растворы, трубки, соединители Luer и катетеры, должны быть стерильными. Поверхности, включая полистирольный лоток, должны быть продезинфицированы 70% этанолом, а перфузию предпочтительно проводить под ламинарной проточной вытяжкой. Все процедуры проходят при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Посмертная микрохирургия

1. Усыплите мышь с помощью камеры _CO2 .
   1. Поместите мышь в камеру объемом 4 л и начните заполнять 100% _CO2, начиная с 0,2 л/мин в течение 2 мин, увеличивая до достижения потока 0,8 л/мин через 3 мин. Мышь должна упасть без сознания в течение первых 2 мин, а затем дыхание должно прекратиться (обычно около 5 мин, но поток может поддерживаться по мере необходимости). Подтвердите смерть, прежде чем переходить к следующему шагу.
2. Побрить грудную клетку, брюшко и спину мыши машинкой для стрижки волос и продезинфицировать 70% этанолом. Бритье значительно уменьшает количество артефактов за счет наличия волос либо на образцах для визуализации, либо на биохимическом анализе.
3. Прикрепите мышь к полистирольному лотку, вытянув ее передние и задние конечности, а также голову и хвост. Поместите его под микроскоп микрохирургии.
4. С помощью ножниц с прямым рисунком Майо устанавливают хирургический доступ с кожным разрезом, идущим от подчелюстной области к нижней части живота и рассекают подкожно, чтобы обнажить грудную стенку и брюшину.
5. С помощью микрохирургических ножниц разрезают большую грудную клетку и малую грудную мышцы вдоль шестого межреберного пространства по обеим сторонам грудной стенки.
6. Используя ножницы с прямым рисунком, разрезайте грудину вдоль предыдущих разрезов, а затем завершите стернотомию, разрезав грудину вдоль ее длинной оси, затем поднимите и закрепите обе стороны грудной стенки, чтобы обнажить сердечно-легочный комплекс.
7. Используя микрощипцы с круглым наконечником (или микрощипцы Дюмона), иссечь тимус и окружающую жировую ткань, деликатно стягивая их с прикреплений. Это позволит выявить основные суда.
8. С помощью прижигания прижигают нисходящую полую вену и, используя ножницы с прямым рисунком, разрезают пищевод.
9. Используя острые микрощипцы, отделяют брахиоцефальные вены от брахиоцефальных и брахиоцефальных, оставляют общие сонные и левые подключичные артерии от подлежащей ткани, чтобы облегчить перевязку и прижигание.
10. Используя микроигольчатый держатель, острые микрощипцы и 9-0 швов, накладывающих швы над появлением брахиоцефальной, левой общей сонной и левой подключичной артерий.
11. Прижигают брахиоцефальные вены.
12. Отделите подчелюстные слюнные железы вдоль средней линии, чтобы обнажить мышцы шеи и трахею. Отделите мышцы, чтобы обнажить крикотиреоидную связку. С помощью микроножек откройте вход, разрезав связку.
13. Введите катетер 27 г в трахею и деликатно надавите до тех пор, пока трахея не разветвится в бронхи (т. е. до тех пор, пока не будет достигнуто сопротивление катетеру, затем отступите на 3 мм). Будьте осторожны, чтобы не нарушить работу бронхов. Используя шов 6-0, наложите 3 шва вокруг трахеи, чтобы закрепить катетер.
14. Сечение мыши на высоте 12-го грудного позвонка. Нисходящая аорта проходит спереди к позвоночнику и должна быть разделена здесь вместе с позвоночником. Раздвиньте нижнюю половину.
15. Ретроградно катетеризирует аорту и толкает катетер до тех пор, пока он не достигнет дуги аорты. Используя 9-0 швов, наложите 4 шва вокруг аорты, начиная с 5 мм ниже кончика катетера.

2. Децеллюляризация

1. Подключите мышь к насосной системе с помощью силиконовых трубок и разъемов Luer. Перфузируйте с деионизированной водой при 200 мкл/мин в течение 15 мин. Поддерживайте эту скорость потока во время децеллюляризации.
2. Замените перфузионный агент на 0,5% дезоксихолат натрия (DOC), разведенный в деионизированной воде и перфьюированный на ночь.
3. Изменить перфузионный агент на 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), разбавленного в деионизированной воде и перфузионировать в течение 8 часов.
4. Настаивайте на деионизированной воде в течение ночи, чтобы смыть SDS и DOC в течение 24 ч.
5. Резецировать децеллюляризированное сердце и легкие путем разрезания его прикреплений к грудной клетке с помощью изогнутых ножниц и хранить в стерильной криотрубке с деионизированной водой с 1% (v/v) пенициллин-стрептомицином и 0,3 мкМ азида натрия при 4 °C. Каркасы ECM могут храниться не менее 12 ^{недель1}. Если каркас будет использоваться для биохимического анализа (например, масс-спектрометрии), заморозьте в жидком азоте.

3. Иммуноокрашивание

1. Планируйте визуализацию: определите первичное антитело (или антитела) и комбинацию флуоресцентно конъюгированных вторичных антител, чтобы соответствовать друг другу и соответствовать лазерным линиям флуоресцентного микроскопа.
2. Заблокируйте образец, погрузив его в криотрубу, содержащую 6% (v/v) ослиной сыворотки - 3% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (BSA) на ночь.
3. Инкубировать с первичными антителами (или антителами) в 3% ослиной сыворотке в PBS в течение 24 ч.
4. Промывайте 5 раз в течение 1 ч каждый раз в 0,05% анимации 20 в PBS (PBST).
5. Инкубируйте образец с флуоресцентно конъюгированным вторичным антителом (или антителами) в 3% ослиной сыворотке в PBS в течение 24 ч.
6. Стирать 5 раз в течение 1 часа по 0,05% (PBST). Подождите 1 ч между каждой стиркой.
7. Добавьте деионизированную воду и храните при температуре 4 °C вдали от прямого света. На этом этапе каркас готов к созданию изображения.

4. Визуализация

1. Поместите образец в стеклянную посуду и увлажните его двумя каплями раствора для хранения (PBS или деионизированной водой).
2. Подготовьте цель. Мы рекомендуем использовать объектив погружения в воду.
3. Осмотрите образец с помощью флуоресцентного света.
4. Переключитесь на управление компьютером. Включите лазеры и отрегулируйте интенсивность лазера, диафрагму точечных отверстий, длины волн детекторов, коэффициент усиления, разрешение и масштабирование. Задайте число и размер шага для z-стека и начните сбор. Мы рекомендуем использовать многофотонное лазерное возбуждение для увеличения проникновения в ткани и минимизации рассеяния света, отбеливания и повреждения тканей.

5. Окрашивание гематоксилин-эозином

1. Иссечение 1 доли легкого у усыпленной мыши.
2. Поместите в криомольд размером 10 мм x 10 мм x 5 мм и накройте его приблизительно 500 мкл соединения OCT.
3. Заморозить на сухом льду (-70 °C) и поддерживать образец при этой температуре.
4. Иссечение одной децеллюляризированной доли легкого из обработанной мыши в соответствии с шагом 2.5.
5. Поместите в криомольд с наибольшей площадью поверхности вниз и покройте его соединением OCT, как указано на этапе 5.2.
6. Заморозить на сухом льду (-70°C) и поддерживать образец при этой температуре до тех пор, пока не потребуется иное. Образец может храниться не менее 12 недель.
7. Сечение замороженных тканевых блоков при -20 °C в криостате толщиной 5 мкм и размещение срезов на клейких стеклянных слайдах и хранение при -80 °C.
8. Доведите горки до комнатной температуры до высыхания на воздухе (примерно 20 мин).
9. Коротко погрузитесь в PBS и исправьте, погрузив слайды в 4% параформальдегид в PBS на 15 минут. Промыть один раз в PBS в течение 5 мин, затем дважды в дистиллированной воде в течение 5 мин.
10. Погрузить в раствор гематоксилина Майера на 10 мин. Это время может быть оптимизировано в соответствии с источником ткани и подготовкой пятна.
11. Промыть в банке Коплина под проточной дистиллированной водой в течение 10 мин.
12. Погрузить в раствор эозина на 7 мин. Это время может быть оптимизировано в соответствии с источником ткани и подготовкой пятна.
13. Окуните в 50% этанол, чтобы удалить избыток эозина и обезвоживаться путем кратковременного погружения в 70% этанола, а также в 96% и 100% этанола в течение 30 секунд. Обмакните в ксилол несколько раз.
14. Нанесите несколько капель монтажного носителя DPX и поместите стеклянную крышку.
15. Оставьте горки сушиться на ночь под химическим капотом.
16. Сканирование слайдов в сканере слайдов.

Результаты

Сердечно-легочная децеллюляризация
После успешного завершения протокола сердце и легкие, а также аннексированная ткань, такая как дуга аорты, будут свободны от клеток. Децеллюляризация может быть подтверждена окрашиванием гематоксилин-эозином (

Обсуждение

Методы децеллюляризации, основанные на тканевом перемешивании, изменяют структуру ECM, что делает их непригодными для анализа структуры ^ECM4. Перфузионная децеллюляризация с использованием анатомического пути, такого как аорта трахеи, позволяет достичь капиллярного русла и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)	Ethicon	6301124
9-0 micro-suture (Safil)	B Braun	G1048611
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12
Adson forceps with teeth	Fine Science Tools	11027-12
Castroviejo microneedle holder	Fine Science Tools	no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)	Leica	S6 D
Double-ended microspatula	Fine Science Tools	10091-12
Dumont microforceps (two)	Fine Science Tools	11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two)	Fine Science Tools	11251-35
Hair clippers	Oster	76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)	Fine Science Tools	12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)	BD	381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight)	Fine Science Tools	14110-15
Microforceps with ringed tips (two)	Aesculap	FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved)	Fine Science Tools	15001-08
Minicutter	KLS Martin	80-008-03-04
Molt Periostotome	Aesculap	D0543R
Needles (27 gauge; Microlance)	BD	21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin
Serrated scissors (CeramaCut, straight)	Fine Science Tools	14958-09
Spatula (Freer-Yasargil)	Aesculap	OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak)	BD	3021001
Syringes (10 mL; Plastipak)	BD	3021110
Tendon scissors (Walton)	Fine Science Tools	14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)	Serva	11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)	Millipore	AB756P	Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)			Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)	VWR	233-5364)
Serum (normal donkey serum)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
IMAGING
Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )	Leica
Fluorescence light source	Leica	EL6000
Microscope (inverted multiphoton microscope)	Leica	SP5-X MP
Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)	Leica	HCX PL APO
Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)
White-light laser (WLL)	Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water	Plum	1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)	World Precision Instruments	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Peristaltic pump (with 12 channels)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)	Ole Dich	31399
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate	Sigma-Aldrich	L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA	Fisher Scientific	15434389
96% Ethanol	Plum	201446-5L
Absolute ethanol	Plum	201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)	Hounisen	422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)	Tissue-Tek	4566
Cryostat	Leica	CM3050S
DPX mounting medium	Hounisen	1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5%	Sigma	1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)	Pfm medical	207500003
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)	Thermofisher	6319483
Mayers hematoxylin	Sigma	MHS32-1L
OCT compound	VWR	361603E
Slide scanner (Nanozoomer)	Hamamatsu Photonics
Xylene	Sigma	534056-4L