マウス心肺複合体の脱細胞化

要約

このプロトコルは、マウスの心臓と肺の細胞化を解除することを目的としています。得られた細胞外マトリックス(ECM)足場は、免疫染色され、それらの成分の位置およびトポロジーをマッピングするために画像化することができる。

要約

ここでは、マウスの心臓と肺の脱細胞化プロトコルを紹介します。それはECMのトポロジーおよび組成を分析するために使用することができる構造ECM足場を作り出す。これは、心と肺を脱細胞化剤で浸透させるために安楽死マウスの気管および大殿をカテーテルするように設計された微小外科的処置に基づいています。脱細胞化された心肺複合体は、その後、構造ECMタンパク質の位置を明らかにするために免疫染色することができる。全体の手順は、4日で完了することができます。

このプロトコルから生じる ECM スキャフォールドは、寸法の歪みのないものです。細胞の不在により、3Dでのサブミクロン分解能までECM構造の構造検査が可能になります。このプロトコルは、線維症および癌のマウスモデルを含む、生後4週の若いマウスから健康で病気の組織に適用することができ、心肺疾患に関連するECMリモデリングを決定する方法を開く。

概要

ECMは、タンパク質とグリカンで構成された3次元ネットワークであり、多細胞生物のすべての細胞を収容し、臓器に形状を与え、生涯を通じて細胞の挙動を調節します¹。卵の受精から、細胞はECMを構築し、改造し、順番に厳密に制御されます。このプロトコルの目的は、マウスが哺乳類の病態生理学で最も使用されるモデル生物であるため、マウスECMを分析し、マッピングする方法を開くものです。

この方法の開発は、転移関連のネイティブ^ECM2を特徴付け、分離する必要性によって推進されました。腫瘍は適切な解剖学的血管化を欠き、マウスは比較的小さな生物であるため、大動脈を逆行させるため、大動脈を逆行させるため、腫瘍につながる主要な血管(例えば肺静脈)の循環を単離し、試薬の流れを集中させ、腫瘍脱細胞化を可能にするマイクロ外科的処置を行った。この方法は、免疫染色および画像化することができる保存構造²を有するECM足場を生成し、サブミクロンの詳細でECM構造マッピングを可能にする。このプロトコルを実行するには、その使用に潜在的な制限を表す可能性のある外科的および微小外科的スキル(解剖、顕微鏡およびカテーテル化)を習得する必要があります。我々の知る限りでは、この方法は、ネイティブECM構造イメージング解析^2,3の最先端を表^{しています}。

プロトコル

ここに含まれるすべての手順は、コペンハーゲン大学の実験医学を規制する倫理委員会によって審査され、承認されており、デンマークとヨーロッパの法律に同意しています。このプロトコルを実証するために、8-12週齢の雌BALB/cJマウスと11週齢のMMTV-PyMT雌マウスを使用しました。

注:脱細胞化されたECM足場の細菌汚染を避けることは、最良のイメージング結果を与え、長期のサンプル保存を可能にします。したがって、すべてのステップを無菌にしておくことが重要です。したがって、縫合糸、マイクロ縫合、溶液、チューブ、ルアーコネクタ、カテーテルを含むすべての器具および外科材料は無菌でなければなりません。ポリスチレントレイを含む表面は、70%エタノールで消毒する必要があり、灌流は、好ましくは層流フードの下で行われるべきである。特に明記されていない限り、すべての手順は室温で行われます。

1. 事後マイクロサージャスト

1. CO2チャンバーを使用してマウスを安楽死させる。
   1. マウスを4 Lチャンバーに入れ、100%_CO2で満たし始め、0.2 L/分から2分間、3分後に0.8 L/分の流れに達するまで増加します。マウスは最初の2分の間に意識を失い、その後呼吸は停止する必要があります(通常は約5分ですが、必要に応じて流れを維持することができます)。次のステップに進む前に死亡を確認します。
2. 毛のクリッパーで胸部、腹部、マウスの背中を剃り、70%エタノールで消毒します。シェービングは、画像処理または生化学的分析のためのサンプル上の毛髪の存在に起因するアーチファクトの数を大幅に減少させます。
3. マウスをポリスチレントレイに固定し、前肢と後肢、頭と尾を伸ばします。マイクロサージャスト顕微鏡の下に置きます。
4. マヨストレートパターンハサミを使用すると、下顎領域から下腹部に行く皮切開で外科的アクセスを確立し、胸壁と腹膜を露出させるために皮下に解剖する。
5. 微小手術ハサミを使用して、胸部壁の両側の6番目の肋間空間に沿って大胸筋と小胸筋を切断する。
6. ストレートパターンはさみを使用して、前の切開に沿って胸骨を切断し、その長い軸に沿って胸骨を切断することによって、ステノトミーを完了し、その後、高くし、心肺複合体を露出する胸壁の両側を固定します。
7. 丸い先端のマイクロ鉗子(またはデュモンマイクロ鉗子)を使用して、胸腺および周囲の脂肪組織を繊細に引き離すことによって、その付着物を引き離すことによって切除する。これは主要な容器を明らかにします。
8. 焼灼器を使用して、下降するカヴァ静脈を焼灼し、まっすぐなパターンはさみを使用して食道を切断します。
9. 鋭利なマイクロ鉗子を使用して、腕頭蓋静脈と腕頭蓋を分離し、共通の頸動脈および左鎖骨下動脈を下層組織から分離し、結紮および焼灼を促進する。
10. マイクロニードルホルダーを使用して、鋭いマイクロ鉗子と9-0縫合は、腕頭蓋、左一般的な頸動脈および左鎖骨動脈の出現の上にステッチを置く。
11. ブラキオセファリック静脈を焼灼する。
12. 正中線に沿って下顎下唾液腺を分離し、首の筋肉と気管を露出させます。筋肉を分離して、コリコ甲状腺靭帯を露出させます。マイクロハサミを使用して、靭帯を切開して入り口を開きます。
13. 気管に27Gカテーテルを導入し、気管が気管支に分岐するまで繊細に押し込みます(すなわち、カテーテルに対する抵抗が満たされるまで、3mm後退します)。気管支を乱さないで注意してください。6-0縫合を使用して、気管の周りに3ステッチを置き、カテーテルを固定します。
14. 12番目の胸椎の高さでマウスを切り離します。下降大動脈は脊柱に対して前もって走り、脊椎と一緒にここで切り離す必要があります。下半分を離します。
15. 逆行的に大動脈をカテーテルし、大動脈弧に到達するまでカテーテルを押す。9-0縫合を使用して、カテーテル先端の下に5mmを開始して、大オルタの周りに4針を置きます。

2. 脱細胞化

1. シリコンチューブとLuerコネクタを使用して、マウスをポンプシステムに接続します。200 μL/min で 15 分間、脱イオン水を使用します。脱細胞化中にこの流量を維持する。
2. 灌流剤をデオキシコール酸ナトリウム(DOC)に変え、脱イオン水で希釈し、一晩浸透させます。
3. 灌流剤を、脱イオン水で希釈して8時間パーフューズした0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に変更します。
4. 脱イオン水を一晩浸透させ、SDSとDOCを24時間洗い流します。
5. 湾曲したはさみを使用して胸郭に付着物を切り離して脱細胞化した心臓と肺を切除し、1%(v/v)ペニシリンストレプトマイシンと0.3 μMナトリウムアジドを4°Cで除イオン水で滅菌クライオチューブに保存^します。足場が生化学的分析(例えば質量分析法)に使用される場合は、液体窒素中で凍結します。

3. 免疫染色

1. イメージングを計画する:一次抗体(または抗体)と蛍光結合二次抗体の組み合わせを決定し、互いに一致し、蛍光顕微鏡のレーザーラインに適合するようにします。
2. サンプルを6%(v/v)ロバ血清-3%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)を一晩含むクライオチューブに浸漬してブロックする。
3. PBSで3%ロバ血清中の一次抗体(または抗体)を24時間インキュベートする。
4. PBS(PBST)で0.05%トゥイーン20で1時間洗浄します。
5. サンプルを蛍光結合二次抗体(または抗体)を3%ロバ血清で24時間PBSでインキュベートします。
6. 0.05%(PBST)で1時間5回洗浄してください。各洗浄の間に1時間待ちます。
7. 脱イオン水を加え、直接光から離れた4°Cで保管します。この時点で、スキャフォールドはイメージを作成する準備が整いました。

4. イメージング

1. サンプルをガラス底の皿に入れ、2滴の貯蔵溶液(PBSまたは脱イオン水)で加湿します。
2. 目的を準備します。水浸しの目的を使用することをお勧めします。
3. 蛍光灯を用いてサンプルを検査します。
4. コンピュータ制御に切り替えます。レーザーをオンにし、レーザー強度、ピンホール開口、検出器の波長、ゲイン、解像度、ズームを調整します。z スタックの数とステップサイズを設定し、取得を開始します。多光子レーザー励起を使用して、組織の浸透を増加させ、光の散乱、漂白、組織損傷を最小限に抑えることをお勧めします。

5. ヘマトキシリン-エオジン染色

1. 安楽死させたマウスから1つの肺葉を切り物にする。
2. 10 mm x 10 mm x 5 mm のクライオムオールに入れ、約 500 μL の OCT 化合物で覆います。
3. ドライアイス(-70°C)で凍結し、その温度でサンプルを維持します。
4. ステップ2.5に従って処理されたマウスから1つの脱細胞化された肺葉を物品切りする。
5. 最大の表面積を下にしたクライオムドに配置し、ステップ5.2で指定されているようにOCT化合物で覆います。
6. ドライアイス(-70°C)で凍結し、必要になるまでその温度でサンプルを維持します。サンプルは、少なくとも12週間保存することができます。
7. 5 μmの厚さのクライオスタットで-20 °Cの凍結組織ブロックを切り離し、粘着ガラススライドに切片を置き、-80°Cで保管します。
8. スライドを室温まで取り、空気が乾くまで(約20分)
9. PBSに浸し、15分間PBSに4%パラホルムアルデヒドにスライドを浸して固定します。PBSで1回5分間洗浄し、蒸留水で5分間2回洗浄します。
10. マイヤーのヘマトキシリン溶液に10分間浸漬します。この時間は、組織源および染色剤調製に従って最適化することができる。
11. 蒸留水の下で10分間コプリン瓶で洗います。
12. 7分間、エオシン溶液に浸します。この時間は、組織源および染色剤調製に従って最適化することができる。
13. 50%エタノールに浸して、70%エタノールに、96%と100%エタノールで30秒間、すぐに浸漬して余分なエオシンを除去し、脱水する。キシレンに数回浸します。
14. DPX取付媒体を少し滴下し、ガラスカバースリップを入れます。
15. 化学フードの下で一晩乾燥するようにスライドを残します。
16. スライド スキャナーでスライドをスキャンします。

結果

心肺脱細胞化
プロトコルを正常に完了した後、心臓と肺、ならびに大動脈弧のような別館組織は、細胞から解放される。脱細胞化は、天然組織と比較して核の除去を示すECM足場のヘマトキシリン-エオシン染色(図1)によって検証することができる。これらの足場は新鮮な器官の寸法を保持し、不溶性ECM構造はそのまま^...

ディスカッション

組織撹拌に基づく脱細胞化技術はECM構造を変化させ、ECM構造解析⁴に不適当にする。輸液脱細胞化は、気管の大器官のような解剖学的経路を用いて、毛細血管床、または末期のアルベオリに到達することを可能にし、器官全体の脱細胞化剤の送達を促進する。ジウテリオニック、アニオン性、非イオン性洗剤を使用して組織を脱細胞化すると報告されています

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)	Ethicon	6301124
9-0 micro-suture (Safil)	B Braun	G1048611
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12
Adson forceps with teeth	Fine Science Tools	11027-12
Castroviejo microneedle holder	Fine Science Tools	no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)	Leica	S6 D
Double-ended microspatula	Fine Science Tools	10091-12
Dumont microforceps (two)	Fine Science Tools	11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two)	Fine Science Tools	11251-35
Hair clippers	Oster	76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)	Fine Science Tools	12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)	BD	381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight)	Fine Science Tools	14110-15
Microforceps with ringed tips (two)	Aesculap	FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved)	Fine Science Tools	15001-08
Minicutter	KLS Martin	80-008-03-04
Molt Periostotome	Aesculap	D0543R
Needles (27 gauge; Microlance)	BD	21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin
Serrated scissors (CeramaCut, straight)	Fine Science Tools	14958-09
Spatula (Freer-Yasargil)	Aesculap	OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak)	BD	3021001
Syringes (10 mL; Plastipak)	BD	3021110
Tendon scissors (Walton)	Fine Science Tools	14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)	Serva	11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)	Millipore	AB756P	Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)			Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)	VWR	233-5364)
Serum (normal donkey serum)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
IMAGING
Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )	Leica
Fluorescence light source	Leica	EL6000
Microscope (inverted multiphoton microscope)	Leica	SP5-X MP
Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)	Leica	HCX PL APO
Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)
White-light laser (WLL)	Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water	Plum	1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)	World Precision Instruments	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Peristaltic pump (with 12 channels)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)	Ole Dich	31399
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate	Sigma-Aldrich	L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA	Fisher Scientific	15434389
96% Ethanol	Plum	201446-5L
Absolute ethanol	Plum	201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)	Hounisen	422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)	Tissue-Tek	4566
Cryostat	Leica	CM3050S
DPX mounting medium	Hounisen	1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5%	Sigma	1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)	Pfm medical	207500003
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)	Thermofisher	6319483
Mayers hematoxylin	Sigma	MHS32-1L
OCT compound	VWR	361603E
Slide scanner (Nanozoomer)	Hamamatsu Photonics
Xylene	Sigma	534056-4L