Decellularizzazione del Complesso Cardiopolmonare Murino

Riepilogo

Questo protocollo mira a decellularizzare il cuore e i polmoni dei topi. Gli scaffold a matrice extracellulare (ECM) risultanti possono essere immunocolorati e ripresi per mappare la posizione e la topologia dei loro componenti.

Abstract

Presentiamo qui un protocollo di decellularizzazione per cuore e polmoni di topo. Produce scaffold ECM strutturali che possono essere utilizzati per analizzare la topologia e la composizione ECM. Si basa su una procedura microchirurgica progettata per cateterizzare la trachea e l'aorta di un topo eutanasizzato per perfondere il cuore e i polmoni con agenti decellularizzanti. Il complesso cardiopolmonare decellularizzato può successivamente essere immunocolorato per rivelare la posizione delle proteine ECM strutturali. L'intera procedura può essere completata in 4 giorni.

Gli scaffold ECM risultanti da questo protocollo sono privi di distorsioni dimensionali. L'assenza di cellule consente l'esame strutturale delle strutture ECM fino alla risoluzione submicron in 3D. Questo protocollo può essere applicato a tessuti sani e malati di topi di 4 settimane, compresi modelli murini di fibrosi e cancro, aprendo la strada a determinare il rimodellamento dell'ECM associato alla malattia cardiopolmonare.

Introduzione

L'ECM è una rete tridimensionale fatta di proteine e glicani che ospita tutte le cellule in un organismo multicellulare, dando agli organi la loro forma e regolando il comportamento cellulare per tutta la ^vita1. Dalla fecondazione degli ovuli in poi, le cellule costruiscono e rimodellano l'ECM e sono a loro volta strettamente controllate da esso. Lo scopo di questo protocollo è quello di aprire un modo per analizzare e mappare l'ECM del topo, poiché i topi sono l'organismo modello più utilizzato nella fisiopatologia dei mammiferi.

Lo sviluppo di questo metodo è stato guidato dalla necessità di caratterizzare e isolare l'ECM2 nativo associato alle metastasi. Poiché i tumori mancano di un'adeguata vascolarizzazione anatomica e i topi sono organismi relativamente piccoli, le procedure microchirurgiche sono state progettate per cateterizzare retrogradamente l'aorta, isolando la circolazione del vaso principale che porta a un tumore (ad esempio, le vene polmonari), focalizzando così il flusso di reagenti e consentendo la decellularizzazione del tumore. Questo metodo produce scaffold ECM con una struttura ^conservata2 che possono essere immunocolorati e ripresi, consentendo la mappatura della struttura ECM nei dettagli submicronici. Per realizzare questo protocollo è necessario acquisire competenze chirurgiche e microchirurgiche (dissezione, microsuturazione e cateterizzazione) che possono rappresentare una potenziale limitazione al suo utilizzo. Per quanto ne sappiamo, questo metodo rappresenta lo stato dell'arte per l'analisi nativa della struttura ^ECM2,3.

Protocollo

Tutte le procedure qui incluse sono state riviste e approvate dal comitato etico che regola la medicina sperimentale dell'Università di Copenaghen e concordano con la legislazione danese ed europea. Per dimostrare questo protocollo, abbiamo utilizzato topi BALB/cJ femmina di 8-12 settimane di età e un topo femmina MMTV-PyMT di 11 settimane di età.

NOTA: evitare la contaminazione batterica dell'impalcatura ECM decellularizzata offre il miglior risultato di imaging e consente la conservazione a lungo termine del campione. È quindi importante mantenere sterili tutti i passaggi. Pertanto, tutti gli strumenti e il materiale chirurgico, tra cui sutura, micro-sutura, soluzioni, tubi, connettori Luer e cateteri, devono essere sterili. Le superfici, incluso un vassoio in polistirolo, devono essere disinfettate con etanolo al 70% e la perfusione deve essere effettuata preferibilmente sotto una cappa a flusso laminare. Tutte le procedure si svolgono a temperatura ambiente se non diversamente indicato.

1. Microchirurgia post mortem

1. Eutanasia del mouse utilizzando una camera a _CO2 .
   1. Posizionare il mouse in una camera da 4 L e iniziare a riempire con _CO2 al 100%, a partire da 0,2 L / min per 2 minuti, aumentando fino a raggiungere un flusso di 0,8 L / min dopo 3 minuti. Il topo dovrebbe perdere conoscenza durante i primi 2 minuti, e poi la respirazione dovrebbe cessare (di solito circa 5 minuti, ma il flusso può essere mantenuto se necessario). Conferma la morte prima di procedere al passaggio successivo.
2. Rasare il torace, l'addome e la parte posteriore del topo con il tagliacapelli e disinfettare con etanolo al 70%. La rasatura riduce notevolmente il numero di artefatti a causa della presenza di capelli su campioni per l'imaging o l'analisi biochimica.
3. Fissare il mouse a un vassoio in polistirolo, estendendo gli arti anteriori e posteriori, nonché la testa e la coda. Mettilo sotto il microscopio microchirurgico.
4. Utilizzando una forbice a modello dritto Mayo stabilire l'accesso chirurgico con un'incisione cutanea che va dalla regione sottomandibolare all'addome inferiore e sezionare per via sottocutanea per esporre la parete toracica e il peritoneo.
5. Usando le forbici microchirurgiche, tagliare i muscoli pettorali maggiori e pettorali minori lungo il sesto spazio intercostale su entrambi i lati della parete toracica.
6. Usando forbici a modello dritto, tagliare lo sterno lungo le incisioni precedenti, quindi completare una sternotomia tagliando lo sterno lungo il suo asse lungo, quindi elevare e fissare entrambi i lati della parete toracica per esporre il complesso cardiopolmonare.
7. Usando micro-pinze a punta rotonda (o micro-pinze di Dumont), asportare il timo e il tessuto adiposo circostante estraendoli delicatamente dai loro attacchi. Questo rivelerà le navi principali.
8. Usando la cauterizzazione, cauterizzare la vena cava discendente e, usando forbici a modello dritto, tagliare l'esofago.
9. Usando micro-pinze affilate, separare le vene brachiocefaliche e quelle brachiocefale, le arterie carotidi e succlavia sinistra dal tessuto sottostante per facilitare la legatura e la cauterizzazione.
10. Usando il supporto del micro-ago, la micro-pinza affilata e la sutura 9-0 posizionano i punti sopra l'emergere delle arterie brachiocefale, carotidi comuni e succlavia sinistra.
11. Cauterizzare le vene brachiocefaliche.
12. Separare le ghiandole salivari sottomandibolari lungo la linea mediana per esporre i muscoli del collo e la trachea. Separare i muscoli per esporre il legamento cricotiroideo. Usando micro-forbici, apri un ingresso sezionando il legamento.
13. Introdurre un catetere da 27 G nella trachea e spingere delicatamente fino a quando la trachea si ramifica nei bronchi (cioè, fino a quando non viene raggiunta la resistenza al catetere, quindi ritirarsi di 3 mm). Fare attenzione a non interrompere i bronchi. Usando una sutura 6-0, posizionare 3 punti attorno alla trachea per fissare il catetere.
14. Sezione il topo all'altezza della 12a vertebra toracica. L'aorta discendente corre anteriormente alla colonna vertebrale e dovrebbe essere sezionata qui insieme alla colonna vertebrale. Distingui la metà inferiore.
15. Cateterizzare retrogradamente l'aorta e spingere il catetere fino a raggiungere l'arco aortico. Usando la sutura 9-0, posizionare 4 punti intorno all'aorta, iniziando 5 mm sotto la punta del catetere.

2. Decellularizzazione

1. Collegare il mouse a un sistema di pompe utilizzando tubi in silicone e connettori Luer. Perfondere con acqua deionizzata a 200 μL/min per 15 min. Mantenere questa portata durante la decellularizzazione.
2. Cambiare l'agente di perfusione allo 0,5% di sodio desossicolato (DOC) diluito in acqua deionizzata e perfondere durante la notte.
3. Modificare l'agente di perfusione allo 0,1% di sodio dodecilsolfato (SDS) diluito in acqua deionizzata e perfondere per 8 ore.
4. Perfondere con acqua deionizzata durante la notte per lavare via SDS e DOC per 24 ore.
5. Resecare il cuore e i polmoni decellularizzati sezionando i suoi attaccamenti al torace usando una forbice curva e conservare in un criotubo sterile con acqua deionizzata con l'1% (v / v) di penicillina-streptomicina e 0,3 μM di azide di sodio a 4 ° C. Gli scaffold ECM possono essere conservati per almeno 12 ^settimane1. Se l'impalcatura verrà utilizzata per l'analisi biochimica (ad esempio, la spettrometria di massa), il congelamento a scatto in azoto liquido.

3. Immunocolorazione

1. Pianificare l'imaging: determinare l'anticorpo primario (o anticorpi) e la combinazione di anticorpi secondari coniugati fluorescentemente per abbinarsi tra loro e adattarsi alle linee laser del microscopio a fluorescenza.
2. Bloccare il campione immergendolo in un criotubo contenente il 6% (v/v) di siero d'asino - il 3% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA) durante la notte.
3. Incubare con anticorpi primari (o anticorpi) in siero d'asino al 3% in PBS per 24 ore.
4. Lavare 5 volte per 1 ora ogni volta in 0,05% interpolazione 20 in PBS (PBST).
5. Incubare il campione con anticorpi secondari coniugati fluorescenti (o anticorpi) in siero d'asino al 3% in PBS per 24 ore.
6. Lavare 5 volte per 1 ora nello 0,05% (PBST). Attendere 1 ora tra ogni lavaggio.
7. Aggiungere acqua deionizzata e conservare a 4 °C al riparo dalla luce diretta. A questo punto, l'impalcatura è pronta per l'immagine.

4. Imaging

1. Posizionare il campione in un piatto con fondo di vetro e umidificarlo con due goccioline di soluzione di conservazione (PBS o acqua deionizzata).
2. Prepara l'obiettivo. Si consiglia di utilizzare un obiettivo di immersione in acqua.
3. Ispezionare il campione utilizzando la luce a fluorescenza.
4. Passare al controllo del computer. Accendi i laser e regola l'intensità del laser, l'apertura stenopeica, le lunghezze d'onda dei rilevatori, il guadagno, la risoluzione e lo zoom. Imposta il numero e la dimensione del passo per z-stack e inizia l'acquisizione. Si consiglia di utilizzare l'eccitazione laser multifotonica per aumentare la penetrazione dei tessuti e ridurre al minimo la dispersione della luce, lo sbiancamento e il danno tissutale.

5. Colorazione dell'ematossilina-eosina

1. Asportazione 1 lobo polmonare da un topo eutanasizzato.
2. Posizionare in un criostampo di 10 mm x 10 mm x 5 mm e coprirlo con circa 500 μL di composto OCT.
3. Congelare su ghiaccio secco (-70 °C) e mantenere il campione a tale temperatura.
4. Asportare un lobo polmonare decellularizzato da un topo trasformato secondo il passaggio 2.5.
5. Porre in un criostampo con la superficie più grande verso il basso e coprirlo con un composto OCT come specificato al punto 5.2.
6. Congelare su ghiaccio secco (-70°C) e mantenere il campione a quella temperatura fino a quando non sarà altrimenti richiesto. Il campione può essere conservato per almeno 12 settimane.
7. Sezione blocchi di tessuto congelato a -20 °C in un criostato con spessore di 5 μm e posizionare sezioni su vetrini adesivi e conservare a -80 °C.
8. Portare le diapositive a temperatura ambiente fino a quando non si asciugano all'aria (circa 20 minuti).
9. Immergere brevemente in PBS e fissare immergendo i vetrini nel 4% di paraformaldeide in PBS per 15 min. Lavare una volta in PBS per 5 minuti, quindi due volte in acqua distillata per 5 minuti.
10. Immergere nella soluzione di ematossilina di Mayer per 10 minuti. Questo tempo può essere ottimizzato in base alla fonte del tessuto e alla preparazione delle macchie.
11. Lavare in un barattolo coplin sotto acqua distillata corrente per 10 minuti.
12. Immergere in soluzione di eosina per 7 min. Questo tempo può essere ottimizzato in base alla fonte del tessuto e alla preparazione delle macchie.
13. Immergere in etanolo al 50% per rimuovere l'eccesso di Eosina e disidratarlo immergendo brevemente in etanolo al 70% e in etanolo al 96% e al 100% per 30 secondi. Immergere nello xilene più volte.
14. Applicare alcune gocce di supporto di montaggio DPX e posizionare una copertura in vetro.
15. Lasciare asciugare le diapositive durante la notte sotto un cappuccio chimico.
16. Scansione delle diapositive in uno scanner di diapositive.

Risultati

Decellularizzazione cardiopolmonare
Dopo aver completato con successo il protocollo, il cuore e i polmoni, così come il tessuto annesso come l'arco aortico, saranno privi di cellule. La decellularizzazione può essere convalidata mediante colorazione ematossilina-eosina (Figura 1) degli scaffold ECM che mostrano la rimozione dei nuclei rispetto al tessuto nativo. Queste impalcature mantengono le dimensioni degli organi freschi e la sua st...

Discussione

Le tecniche di decellularizzazione basate sull'agitazione tissutale alterano la struttura dell'ECM, rendendole inadatte all'analisi della struttura ^ECM4. La decellularizzazione perfusione, utilizzando una via anatomica come l'aorta della trachea, permette di raggiungere il letto capillare, o alveoli terminali, e facilita la consegna di agenti decellularizzanti in tutto l'organo. L'uso di detergenti zwitterionionici, anionici e non ionici per decellularizzare il tessuto è ^segnala...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)	Ethicon	6301124
9-0 micro-suture (Safil)	B Braun	G1048611
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12
Adson forceps with teeth	Fine Science Tools	11027-12
Castroviejo microneedle holder	Fine Science Tools	no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)	Leica	S6 D
Double-ended microspatula	Fine Science Tools	10091-12
Dumont microforceps (two)	Fine Science Tools	11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two)	Fine Science Tools	11251-35
Hair clippers	Oster	76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)	Fine Science Tools	12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)	BD	381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight)	Fine Science Tools	14110-15
Microforceps with ringed tips (two)	Aesculap	FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved)	Fine Science Tools	15001-08
Minicutter	KLS Martin	80-008-03-04
Molt Periostotome	Aesculap	D0543R
Needles (27 gauge; Microlance)	BD	21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin
Serrated scissors (CeramaCut, straight)	Fine Science Tools	14958-09
Spatula (Freer-Yasargil)	Aesculap	OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak)	BD	3021001
Syringes (10 mL; Plastipak)	BD	3021110
Tendon scissors (Walton)	Fine Science Tools	14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)	Serva	11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)	Millipore	AB756P	Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)			Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)	VWR	233-5364)
Serum (normal donkey serum)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
IMAGING
Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )	Leica
Fluorescence light source	Leica	EL6000
Microscope (inverted multiphoton microscope)	Leica	SP5-X MP
Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)	Leica	HCX PL APO
Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)
White-light laser (WLL)	Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water	Plum	1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)	World Precision Instruments	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Peristaltic pump (with 12 channels)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)	Ole Dich	31399
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate	Sigma-Aldrich	L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA	Fisher Scientific	15434389
96% Ethanol	Plum	201446-5L
Absolute ethanol	Plum	201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)	Hounisen	422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)	Tissue-Tek	4566
Cryostat	Leica	CM3050S
DPX mounting medium	Hounisen	1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5%	Sigma	1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)	Pfm medical	207500003
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)	Thermofisher	6319483
Mayers hematoxylin	Sigma	MHS32-1L
OCT compound	VWR	361603E
Slide scanner (Nanozoomer)	Hamamatsu Photonics
Xylene	Sigma	534056-4L