Dezellularisation des murinen Kardiopulmonalkomplexes

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, das Herz und die Lunge von Mäusen zu dezellularisieren. Die resultierenden Gerüste der extrazellulären Matrix (ECM) können immungefärbt und abgebildet werden, um die Position und Topologie ihrer Komponenten abzubilden.

Zusammenfassung

Wir präsentieren hier ein Dezellularisierungsprotokoll für Mausherz und -lunge. Es produziert strukturelle ECM-Gerüste, die zur Analyse der ECM-Topologie und -Zusammensetzung verwendet werden können. Es basiert auf einem mikrochirurgischen Verfahren, das entwickelt wurde, um die Luftröhre und Aorta einer eingeschläferten Maus zu katheterisieren, um Herz und Lunge mit Dezellularisierungsmitteln zu durchdringen. Der dezellularisierte kardiopulmonale Komplex kann anschließend immungefärbt werden, um die Position struktureller ECM-Proteine aufzudecken. Das gesamte Verfahren kann in 4 Tagen abgeschlossen werden.

Die aus diesem Protokoll resultierenden ECM-Gerüste sind frei von Dimensionsverzerrungen. Das Fehlen von Zellen ermöglicht die strukturelle Untersuchung von ECM-Strukturen bis hin zur Submikronauflösung in 3D. Dieses Protokoll kann auf gesundes und krankes Gewebe von Mäusen im Alter von 4 Wochen angewendet werden, einschließlich Mausmodellen für Fibrose und Krebs, was den Weg zur Bestimmung des ECM-Remodelings im Zusammenhang mit kardiopulmonalen Erkrankungen ebnet.

Einleitung

Das ECM ist ein dreidimensionales Netzwerk aus Proteinen und Glykanen, das alle Zellen in einem vielzelligen Organismus beherbergt, Organen ihre Form verleiht und das Zellverhalten während des gesamten Lebens ^reguliert1. Ab der Eizellbefruchtung bauen und modellieren Zellen das ECM und werden wiederum streng von ihm kontrolliert. Der Zweck dieses Protokolls ist es, eine Möglichkeit zur Analyse und Kartierung von Maus-ECM zu eröffnen, da Mäuse der am häufigsten verwendete Modellorganismus in der Pathophysiologie von Säugetieren sind.

Die Entwicklung dieser Methode wurde durch die Notwendigkeit vorangetrieben, Metastasen-assoziiertes natives ^ECM2 zu charakterisieren und zu isolieren. Da Tumoren keine richtige anatomische Vaskularisierung fehlt und Mäuse relativ kleine Organismen sind, wurden mikrochirurgische Verfahren entwickelt, um die Aorta retrograd zu katheterisieren, während die Zirkulation des Hauptgefäßes, das zu einem Tumor führt (z. B. die Lungenvenen), isoliert wird, wodurch der Reagenzfluss fokussiert und die Tumordezellularisation ermöglicht wird. Diese Methode erzeugt ECM-Gerüste mit einer konservierten ^Struktur2, die immungefärbt und abgebildet werden können, was eine ECM-Strukturkartierung im Submikrometer-Detail ermöglicht. Um dieses Protokoll durchzuführen, ist es notwendig, chirurgische und mikrochirurgische Fähigkeiten (Dissektion, Mikroernährung und Katheterisierung) zu erwerben, die eine mögliche Einschränkung seiner Verwendung darstellen können. Unseres Wissens stellt diese Methode den Stand der Technik für die native ECM-Strukturbildgebung ^dar2,3.

Protokoll

Alle hier enthaltenen Verfahren wurden von der Ethikkommission zur Regulierung der experimentellen Medizin an der Universität Kopenhagen überprüft und genehmigt und stimmen mit der dänischen und europäischen Gesetzgebung überein. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, haben wir weibliche BALB/cJ-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen und eine MMTV-PyMT-Maus im Alter von 11 Wochen verwendet.

HINWEIS: Die Vermeidung einer bakteriellen Kontamination des dezellularisierten ECM-Gerüsts liefert das beste Bildgebungsergebnis und ermöglicht eine langfristige Probenlagerung. Es ist daher wichtig, alle Schritte steril zu halten. Daher müssen alle Instrumente und chirurgischen Materialien, einschließlich Naht, Mikronaht, Lösungen, Schläuche, Luer-Konnektoren und Katheter, steril sein. Oberflächen, einschließlich einer Polystyrolschale, müssen mit 70% Ethanol desinfiziert werden, und die Perfusion sollte vorzugsweise unter einer Laminar-Flow-Haube erfolgen. Alle Eingriffe finden bei Raumtemperatur statt, sofern nicht anders angegeben.

1. Postmortale Mikrochirurgie

1. Die Maus wird mit einer _{CO2-Kammer eingeschläfert} .
   1. Legen Sie die Maus in eine 4-Liter-Kammer und beginnen Sie, sich mit 100% _CO2 zu füllen, beginnend bei 0,2 l / min für 2 minuten, bis sie nach 3 Minuten einen Durchfluss von 0,8 l / min erreicht. Die Maus sollte während der ersten 2 Minuten bewusstlos werden, und dann sollte die Atmung aufhören (normalerweise etwa 5 Minuten, aber der Fluss kann bei Bedarf aufrechterhalten werden). Bestätigen Sie den Tod, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
2. Rasieren Sie Thorax, Bauch und Rücken der Maus mit der Haarschneidemaschine und desinfizieren Sie sie mit 70% Ethanol. Die Rasur reduziert die Anzahl der Artefakte aufgrund des Vorhandenseins von Haaren entweder auf Proben zur Bildgebung oder zur biochemischen Analyse erheblich.
3. Befestigen Sie die Maus an einer Styroporschale und strecken Sie ihre Vorder- und Hinterbeine sowie kopf- und schwanz aus. Legen Sie es unter das mikrochirurgische Mikroskop.
4. Mit einer Mayo-Schere mit geradem Muster stellen Sie einen chirurgischen Zugang mit einem Hautschnitt her, der von der submandibulären Region zum Unterbauch verläuft, und seziert subkutan, um die Brustwand und das Peritoneum freizulegen.
5. Schneiden Sie mit einer mikrochirurgischen Schere die Muskeln Pectoralis major und Pectoralis minor entlang des sechsten Interkostalraums auf beiden Seiten der Brustwand ab.
6. Schneiden Sie mit einer Schere mit geradem Muster das Brustbein entlang der vorherigen Schnitte ab und vervollständigen Sie dann eine Sternotomie, indem Sie das Brustbein entlang seiner langen Achse schneiden, dann beide Seiten der Brustwand anheben und festnageln, um den Kardiopulmonalkomplex freizulegen.
7. Entfernen Sie mit einer rundspitzigen Mikrozange (oder Dumont-Mikrozange) den Thymus und das umgebende Fettgewebe, indem Sie sie vorsichtig von ihren Anbauteilen abziehen. Dies wird die wichtigsten Schiffe enthüllen.
8. Verwenden Sie die Kauterisation, kauterisieren Sie die absteigende Cava-Vene und schneiden Sie mit einer geraden Musterschere die Speiseröhre.
9. Trennen Sie mit einer scharfen Mikrozange die brachiozephalen Venen und die brachiozephalen, linken gemeinsamen Halsschlagadern und linken Subclaviaarterien vom darunter liegenden Gewebe, um die Ligatur und Kauterisation zu erleichtern.
10. Mit einem Mikronadelhalter, einer scharfen Mikrozange und einer 9-0-Naht werden Die Stiche über die Entstehung der brachiozephalen, linken gemeinsamen Halsschlagader und der linken Arteria subclavia gelegt.
11. Kauterisieren Sie die brachiozephalen Venen.
12. Trennen Sie die submandibulären Speicheldrüsen entlang der Mittellinie, um die Nackenmuskulatur und die Luftröhre freizulegen. Trennen Sie die Muskeln, um das Cricothyroid-Band freizulegen. Öffnen Sie mit einer Mikroschere einen Eingang, indem Sie das Band schneiden.
13. Führen Sie einen 27 G-Katheter in die Luftröhre ein und drücken Sie vorsichtig, bis sich die Luftröhre in die Bronchien verzweigt (d. H. Bis der Widerstand gegen den Katheter erreicht ist, und ziehen Sie sich dann 3 mm zurück). Achten Sie darauf, die Bronchien nicht zu stören. Legen Sie mit einer 6-0-Naht 3 Stiche um die Luftröhre, um den Katheter zu sichern.
14. Schneiden Sie die Maus auf der Höhe des 12. Brustwirbels. Die absteigende Aorta verläuft anterior zur Wirbelsäule und sollte hier zusammen mit der Wirbelsäule geschnitten werden. Setzen Sie die untere Hälfte auseinander.
15. Katheterisieren Sie die Aorta retrograd und drücken Sie den Katheter, bis er den Aortenbogen erreicht. Legen Sie mit einer 9-0-Naht 4 Stiche um die Aorta, beginnend 5 mm unter der Katheterspitze.

2. Dezellularisierung

1. Schließen Sie die Maus über Silikonschläuche und Luer-Anschlüsse an ein Pumpensystem an. 15 min lang mit entionisiertem Wasser bei 200 μL/min perfundieren. Behalten Sie diese Durchflussrate während der Dezellularisation bei.
2. Ändern Sie das Perfusionsmittel auf 0,5% Natriumdesoxycholat (DOC), verdünnt in entionisiertem Wasser, und perfundieren Sie es über Nacht.
3. Ändern Sie das Perfusionsmittel auf 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), das in deionisiertem Wasser verdünnt ist, und perfundieren Sie es 8 Stunden lang.
4. Über Nacht mit entionisiertem Wasser perfundieren, um SDS und DOC für 24 h wegzuspülen.
5. Resezieren Sie das dezellularisierte Herz und die Lunge, indem Sie seine Anhaftungen am Thorax mit einer gekrümmten Schere schneiden und in einem sterilen Kryorohr mit deionisiertem Wasser mit 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin und 0,3 μM Natriumazid bei 4 °C lagern. ECM-Gerüste können mindestens 12 Wochen gelagert ^werden1. Wenn das Gerüst für die biochemische Analyse (z. B. Massenspektrometrie) verwendet wird, schockieren Sie in flüssigem Stickstoff.

3. Immunfärbung

1. Planen Sie die Bildgebung: Bestimmen Sie den primären Antikörper (oder die Antikörper) und die Kombination von fluoreszierend konjugierten sekundären Antikörpern, um zueinander zu passen und die Laserlinien des Fluoreszenzmikroskops anzupassen.
2. Blockieren Sie die Probe, indem Sie sie über Nacht in ein Kryotube mit 6% (v /v) Eselserum - 3% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) eintauchen.
3. Inkubieren Sie mit primären Antikörpern (oder Antikörpern) in 3% Eselserum in PBS für 24 h.
4. Waschen Sie 5 mal für 1 h jedes Mal in 0,05% Tween 20 in PBS (PBST).
5. Inkubieren Sie die Probe mit fluoreszierend konjugierten sekundären Antikörpern (oder Antikörpern) in 3% Eselserum in PBS für 24 h.
6. Waschen Sie 5 mal für 1 Stunde in 0,05% (PBST). Warten Sie 1 h zwischen den einzelnen Wäschen.
7. Entionisiertes Wasser hinzufügen und bei 4 °C vor direktem Licht geschützt lagern. An diesem Punkt ist das Gerüst bereit zum Abbild.

4. Bildgebung

1. Legen Sie die Probe in eine Glasbodenschale und befeuchten Sie sie mit zwei Tröpfchen Speicherlösung (PBS oder entionisiertes Wasser).
2. Bereiten Sie das Ziel vor. Wir empfehlen die Verwendung eines Wasserimmersionsobjektivs.
3. Untersuchen Sie die Probe mit Fluoreszenzlicht.
4. Wechseln Sie zur Computersteuerung. Schalten Sie Laser ein und passen Sie Laserintensität, Lochöffnung, Wellenlängen der Detektoren, Verstärkung, Auflösung und Zoom an. Legen Sie die Anzahl und Schrittweite für z-stack fest und beginnen Sie mit der Erfassung. Wir empfehlen die Verwendung von Multiphotonen-Laseranregung, um die Gewebepenetration zu erhöhen und lichtstreuung, Bleichmittel und Gewebeschäden zu minimieren.

5. Hämatoxylin-Eosin-Färbung

1. Entfernen Sie 1 Lungenlappen von einer eingeschläferten Maus.
2. In eine 10 mm x 10 mm x 5 mm große Kryomform geben und mit ca. 500 μL OCT-Compound bedecken.
3. Auf Trockeneis (-70 °C) einfrieren und die Probe auf dieser Temperatur halten.
4. Schneiden Sie einen dezellularisierten Lungenlappen aus einer verarbeiteten Maus gemäß Schritt 2.5 aus.
5. In eine Kryomol mit der größten Oberfläche nach unten geben und mit OCT-Verbindung gemäß Schritt 5.2 bedecken.
6. Auf Trockeneis (-70 °C) einfrieren und die Probe auf dieser Temperatur halten, bis etwas anderes erforderlich ist. Die Probe kann mindestens 12 Wochen gelagert werden.
7. Schneiden Sie gefrorene Gewebeblöcke bei -20 °C in einem Kryostaten mit 5 μm Dicke und legen Sie Abschnitte auf Objektträger aus Glas und lagern Sie sie bei -80 °C.
8. Bringen Sie die Folien auf Raumtemperatur, bis sie an der Luft getrocknet sind (ca. 20 min).
9. Tauchen Sie kurz in PBS ein und fixieren Sie es, indem Sie die Objektträger 15 Minuten lang in 4% Paraformaldehyd in PBS tauchen. Einmal in PBS für 5 min waschen, dann zweimal in destilliertem Wasser für 5 min.
10. 10 Min. in Mayers Hämatoxylinlösung eintauchen. Diese Zeit kann je nach Gewebequelle und Fleckenvorbereitung optimiert werden.
11. In einem Coplin-Glas unter fließendem destilliertem Wasser für 10 Min. waschen.
12. 7 Min. in Eosin-Lösung eintauchen. Diese Zeit kann je nach Gewebequelle und Fleckenvorbereitung optimiert werden.
13. Tauchen Sie in 50% Ethanol, um überschüssiges Eosin zu entfernen und zu dehydrieren, indem Sie kurz in 70% Ethanol und in 96% und 100% Ethanol für 30 Sekunden eintauchen. Mehrmals in Xylol tauchen.
14. Tragen Sie einige Tropfen DPX-Montagemedium auf und legen Sie einen Glasdeckglas auf.
15. Lassen Sie die Folien über Nacht unter einer chemischen Haube trocknen.
16. Scannen Sie Dias in einem Diascanner.

Ergebnisse

Kardiopulmonale Dezellularisation
Nach erfolgreichem Abschluss des Protokolls werden Herz und Lunge sowie das Begleitgewebe wie der Aortenbogen frei von Zellen sein. Die Dezellularisation kann durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung (Abbildung 1) der ECM-Gerüste validiert werden, die die Entfernung der Kerne im Vergleich zum nativen Gewebe zeigen. Diese Gerüste behalten die Abmessungen frischer Organe bei und ihre unlösliche ECM-Struktur ist ...

Diskussion

Dezellularisierungstechniken, die auf Gewebebewegung basieren, verändern die ECM-Struktur, wodurch sie für die ECM-Strukturanalyse ungeeignet ^sind4. Die Perfusionsdezellularisation unter Verwendung eines anatomischen Weges wie der Aorta der Luftröhre ermöglicht es, das Kapillarbett oder die terminalen Alveolen zu erreichen und erleichtert die Abgabe von Dezelluliermitteln im gesamten Organ. Die Verwendung von zwitterionischen, anionischen und nichtionischen Detergenzien zur Dezellularisierung ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)	Ethicon	6301124
9-0 micro-suture (Safil)	B Braun	G1048611
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12
Adson forceps with teeth	Fine Science Tools	11027-12
Castroviejo microneedle holder	Fine Science Tools	no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)	Leica	S6 D
Double-ended microspatula	Fine Science Tools	10091-12
Dumont microforceps (two)	Fine Science Tools	11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two)	Fine Science Tools	11251-35
Hair clippers	Oster	76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)	Fine Science Tools	12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)	BD	381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight)	Fine Science Tools	14110-15
Microforceps with ringed tips (two)	Aesculap	FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved)	Fine Science Tools	15001-08
Minicutter	KLS Martin	80-008-03-04
Molt Periostotome	Aesculap	D0543R
Needles (27 gauge; Microlance)	BD	21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin
Serrated scissors (CeramaCut, straight)	Fine Science Tools	14958-09
Spatula (Freer-Yasargil)	Aesculap	OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak)	BD	3021001
Syringes (10 mL; Plastipak)	BD	3021110
Tendon scissors (Walton)	Fine Science Tools	14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)	Serva	11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)	Millipore	AB756P	Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)			Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)	VWR	233-5364)
Serum (normal donkey serum)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
IMAGING
Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )	Leica
Fluorescence light source	Leica	EL6000
Microscope (inverted multiphoton microscope)	Leica	SP5-X MP
Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)	Leica	HCX PL APO
Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)
White-light laser (WLL)	Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water	Plum	1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)	World Precision Instruments	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Peristaltic pump (with 12 channels)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)	Ole Dich	31399
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate	Sigma-Aldrich	L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA	Fisher Scientific	15434389
96% Ethanol	Plum	201446-5L
Absolute ethanol	Plum	201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)	Hounisen	422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)	Tissue-Tek	4566
Cryostat	Leica	CM3050S
DPX mounting medium	Hounisen	1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5%	Sigma	1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)	Pfm medical	207500003
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)	Thermofisher	6319483
Mayers hematoxylin	Sigma	MHS32-1L
OCT compound	VWR	361603E
Slide scanner (Nanozoomer)	Hamamatsu Photonics
Xylene	Sigma	534056-4L