Dezellularisation des murinen Kardiopulmonalkomplexes

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, das Herz und die Lunge von Mäusen zu dezellularisieren. Die resultierenden Gerüste der extrazellulären Matrix (ECM) können immungefärbt und abgebildet werden, um die Position und Topologie ihrer Komponenten abzubilden.

Zusammenfassung

Wir präsentieren hier ein Dezellularisierungsprotokoll für Mausherz und -lunge. Es produziert strukturelle ECM-Gerüste, die zur Analyse der ECM-Topologie und -Zusammensetzung verwendet werden können. Es basiert auf einem mikrochirurgischen Verfahren, das entwickelt wurde, um die Luftröhre und Aorta einer eingeschläferten Maus zu katheterisieren, um Herz und Lunge mit Dezellularisierungsmitteln zu durchdringen. Der dezellularisierte kardiopulmonale Komplex kann anschließend immungefärbt werden, um die Position struktureller ECM-Proteine aufzudecken. Das gesamte Verfahren kann in 4 Tagen abgeschlossen werden.

Die aus diesem Protokoll resultierenden ECM-Gerüste sind frei von Dimensionsverzerrungen. Das Fehlen von Zellen ermöglicht die strukturelle Untersuchung von ECM-Strukturen bis hin zur Submikronauflösung in 3D. Dieses Protokoll kann auf gesundes und krankes Gewebe von Mäusen im Alter von 4 Wochen angewendet werden, einschließlich Mausmodellen für Fibrose und Krebs, was den Weg zur Bestimmung des ECM-Remodelings im Zusammenhang mit kardiopulmonalen Erkrankungen ebnet.

Einleitung

Das ECM ist ein dreidimensionales Netzwerk aus Proteinen und Glykanen, das alle Zellen in einem vielzelligen Organismus beherbergt, Organen ihre Form verleiht und das Zellverhalten während des gesamten Lebens ^reguliert1. Ab der Eizellbefruchtung bauen und modellieren Zellen das ECM und werden wiederum streng von ihm kontrolliert. Der Zweck dieses Protokolls ist es, eine Möglichkeit zur Analyse und Kartierung von Maus-ECM zu eröffnen, da Mäuse der am häufigsten verwendete Modellorganismus in der Pathophysiologie von Säugetieren sind.

Die Entwicklung dieser Methode wurde durch die Notwendigkeit vorangetrieben, Metastas....

Protokoll

Alle hier enthaltenen Verfahren wurden von der Ethikkommission zur Regulierung der experimentellen Medizin an der Universität Kopenhagen überprüft und genehmigt und stimmen mit der dänischen und europäischen Gesetzgebung überein. Um dieses Protokoll zu demonstrieren, haben wir weibliche BALB/cJ-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen und eine MMTV-PyMT-Maus im Alter von 11 Wochen verwendet.

HINWEIS: Die Vermeidung einer bakteriellen Kontamination des dezellularisierten ECM-Gerüsts liefert das beste Bildgebungsergebnis und ermöglicht eine langfristige Probenlagerung. Es ist daher wichtig, alle Schritte steril zu halten. Daher müssen alle Instrumente ....

Ergebnisse

Kardiopulmonale Dezellularisation
Nach erfolgreichem Abschluss des Protokolls werden Herz und Lunge sowie das Begleitgewebe wie der Aortenbogen frei von Zellen sein. Die Dezellularisation kann durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung (Abbildung 1) der ECM-Gerüste validiert werden, die die Entfernung der Kerne im Vergleich zum nativen Gewebe zeigen. Diese Gerüste behalten die Abmessungen frischer Organe bei und ihre unlösliche ECM-Struktur ist .......

Diskussion

Dezellularisierungstechniken, die auf Gewebebewegung basieren, verändern die ECM-Struktur, wodurch sie für die ECM-Strukturanalyse ungeeignet ^sind4. Die Perfusionsdezellularisation unter Verwendung eines anatomischen Weges wie der Aorta der Luftröhre ermöglicht es, das Kapillarbett oder die terminalen Alveolen zu erreichen und erleichtert die Abgabe von Dezelluliermitteln im gesamten Organ. Die Verwendung von zwitterionischen, anionischen und nichtionischen Detergenzien zur Dezellularisierung .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)	Ethicon	6301124
9-0 micro-suture (Safil)	B Braun	G1048611
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12
Adson forceps with teeth	Fine Science Tools	11027-12
Castroviejo microneedle holder	Fine Science Tools	no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)	Leica	S6 D
Double-ended microspatula	Fine Science Tools	10091-12
Dumont microforceps (two)	Fine Science Tools	11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two)	Fine Science Tools	11251-35
Hair clippers	Oster	76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)	Fine Science Tools	12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)	BD	381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight)	Fine Science Tools	14110-15
Microforceps with ringed tips (two)	Aesculap	FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved)	Fine Science Tools	15001-08
Minicutter	KLS Martin	80-008-03-04
Molt Periostotome	Aesculap	D0543R
Needles (27 gauge; Microlance)	BD	21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin
Serrated scissors (CeramaCut, straight)	Fine Science Tools	14958-09
Spatula (Freer-Yasargil)	Aesculap	OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak)	BD	3021001
Syringes (10 mL; Plastipak)	BD	3021110
Tendon scissors (Walton)	Fine Science Tools	14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)	Serva	11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)	Millipore	AB756P	Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)			Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)	VWR	233-5364)
Serum (normal donkey serum)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
IMAGING
Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )	Leica
Fluorescence light source	Leica	EL6000
Microscope (inverted multiphoton microscope)	Leica	SP5-X MP
Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)	Leica	HCX PL APO
Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)
White-light laser (WLL)	Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water	Plum	1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)	World Precision Instruments	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Peristaltic pump (with 12 channels)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)	Ole Dich	31399
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate	Sigma-Aldrich	L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA	Fisher Scientific	15434389
96% Ethanol	Plum	201446-5L
Absolute ethanol	Plum	201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)	Hounisen	422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)	Tissue-Tek	4566
Cryostat	Leica	CM3050S
DPX mounting medium	Hounisen	1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5%	Sigma	1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)	Pfm medical	207500003
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)	Thermofisher	6319483
Mayers hematoxylin	Sigma	MHS32-1L
OCT compound	VWR	361603E
Slide scanner (Nanozoomer)	Hamamatsu Photonics
Xylene	Sigma	534056-4L