Murine Kardiyopulmoner Kompleksinin Hücreden Arındırılması

Özet

Bu protokol farelerin kalbini ve akciğerlerini hücreden çıkarmayı amaçlamaktadır. Elde edilen hücre dışı matris (ECM) iskeleleri, bileşenlerinin konumunu ve topolojisini haritalamak için immünostain edilebilir ve görüntülenebilir.

Özet

Burada fare kalbi ve akciğerleri için bir hücreden arındırma protokolü sunuyoruz. ECM topolojisini ve bileşimini analiz etmek için kullanılabilecek yapısal ECM iskeleleri üretir. Kalbi ve akciğerleri hücreden çıkarıcı ajanlarla boğmak için ötenazili bir farenin trakeasını ve aortlarını kateterize etmek için tasarlanmış mikrocerrahi bir prosedüre dayanmaktadır. Hücreden çıkarıcı kardiyopulmoner kompleks daha sonra yapısal ECM proteinlerinin yerini ortaya çıkarmak için immünositize edilebilir. Tüm prosedür 4 günde tamamlanabilir.

Bu protokolden kaynaklanan ECM iskeleleri boyutsal bozulmalardan arındırılmıştır. Hücrelerin yokluğu, ECM yapılarının 3D olarak mikrokron çözünürlüğe kadar yapısal olarak incelenmesini sağlar. Bu protokol, fibrozis ve kanserin fare modelleri de dahil olmak üzere 4 haftalık kadar genç farelerden sağlıklı ve hastalıklı dokulara uygulanabilir ve kardiyopulmoner hastalıkla ilişkili ECM tadilatını belirlemenin yolunu açar.

Giriş

ECM, çok hücreli bir organizmadaki tüm hücreleri barındıran, organlara şekil veren ve yaşam boyunca hücre davranışını düzenleyen protein ve glikanlardan oluşan üç boyutlu bir ^ağdır1. Yumurta döllenmesinden itibaren, hücreler ECM'yi oluşturur ve yeniden şekillendirir ve buna karşılık kesinlikle kontrol edilir. Bu protokolün amacı, fareler memeli patofizyolojisinde en çok kullanılan model organizma olduğu için fare ECM'yi analiz etmenin ve haritalamak için bir yol açmaktır.

Bu yöntemin gelişimi, metastaz ilişkili yerel ^ECM2'yi karakterize etme ve izole etme ihtiyacından kaynaklanmıştır. Tümörler uygun anatomik vaskülerizasyondan yoksun olduğundan ve fareler nispeten küçük organizmalar olduğundan, mikrocerrahi prosedürler aortu geriye dönük kateterize etmek için tasarlanmıştır, bu nedenle tümöre (örneğin pulmoner damarlara) giden ana damarın dolaşımını izole eder, böylece reaktif akışına odaklanır ve tümör desellülerizasyonuna izin verir. Bu yöntem, bağışıklık sistemi baskılanabilen ve görüntülenebilen korunmuş bir ^yapıya2 sahip ECM iskeleleri üreterek ecm yapısının altmikron detaylı olarak haritalandırılmasını sağlar. Bu protokolü gerçekleştirmek için, kullanımına potansiyel bir sınırlama oluşturabilecek cerrahi ve mikrocerrahi becerileri (diseksiyon, mikrosütür ve kateterizasyon) kazanmak gerekir. Bilgimize göre, bu yöntem yerel ECM yapı görüntüleme analizi için en son teknolojiyi temsil ^eder2,3.

Protokol

Burada yer alan tüm prosedürler Kopenhag Üniversitesi'nde deneysel tıbbı düzenleyen etik komite tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır ve Danimarka ve Avrupa mevzuatına uygundur. Bu protokolü göstermek için, 8-12 haftalık dişi BALB / cJ fareleri ve 11 haftalık bir MMTV-PyMT dişi fare kullandık.

NOT: Hücreden çıkarımlı ECM iskelesinin bakteriyel kirlenmesini önlemek en iyi görüntüleme sonucunu verir ve uzun süreli numune depolamaya izin verir. Bu nedenle tüm adımları steril tutmak önemlidir. Bu nedenle, dikiş, mikro dikiş, çözeltiler, boru, Luer konektörleri ve kateterler de dahil olmak üzere tüm aletler ve cerrahi malzemeler steril olmalıdır. Polistiren tepsi de dahil olmak üzere yüzeyler% 70 etanol ile dezenfekte edilmeli ve perfüzyon tercihen laminer akış başlığı altında yapılmalıdır. Aksi belirtilmedikçe tüm prosedürler oda sıcaklığında gerçekleşir.

1. Ölüm sonrası mikrocerrahi

1. Fareyi bir _CO2 odası kullanarak ötenazi edin.
   1. Fareyi 4 L odaya yerleştirin ve 2 dakika boyunca _0,2 L / dk'dan başlayarak% 100 CO2 ile doldurmaya başlayın, 3 dakika sonra 0,8 L / dk'lık bir akışa ulaşana kadar artırın. Fare ilk 2 dakika boyunca bilinçsiz kalmalı ve daha sonra solunum sona ermelidir (genellikle yaklaşık 5 dakika, ancak akış gerektiği gibi korunabilir). Bir sonraki adıma geçmeden önce ölümü onaylayın.
2. Toraksı, karnı ve farenin arkasını saç kesme makinesi ile tıraş edin ve% 70 etanol ile dezenfekte edin. Tıraş, görüntüleme veya biyokimyasal analiz için numunelerde saç varlığı nedeniyle eser sayısını büyük ölçüde azaltır.
3. Fareyi bir polistiren tepsiye sabitleyin, ön ve arka ayaklarının yanı sıra başını ve kuyruğunu uzatın. Mikrocerrahi mikroskobun altına yerleştirin.
4. Mayo düz desen makası kullanarak, alt menekbüler bölgeden alt karın bölgesine kadar uzanan bir kese kesisi ile cerrahi erişim kurun ve torasik duvarı ve peritonları ortaya çıkarmak için deri altından parçalara bölün.
5. Mikrocerrahi makas kullanarak, göğüs duvarının her iki tarafındaki altıncı interkostal boşluk boyunca pektoralis majör ve pektoralis küçük kaslarını kesin.
6. Düz desenli makas kullanarak, sternumu önceki kesiler boyunca kesin ve daha sonra sternumu uzun ekseni boyunca keserek bir sternotomiyi tamamlayın, ardından kardiyopulmoner kompleksi ortaya çıkarmak için torasik duvarın her iki tarafını yükseltin ve sabitlayın.
7. Yuvarlak uçlu mikro-toparlamalar (veya Dumont mikro-toparlamaları) kullanarak, timus ve çevresindeki yağ dokusunu hassas bir şekilde ataşmanlarından çekerek çıkarır. Bu büyük gemileri ortaya çıkardı.
8. Koter kullanarak, azalan kava damarını dağla ve düz desen makası kullanarak yemek borusunu kesin.
9. Keskin mikro-tokaps kullanarak, brakiyofalik damarları ve brakiyofalik, sol ortak karotis ve sol subklaviyen arterleri alttaki dokudan ayırarak ligasyon ve koterizasyonu kolaylaştırın.
10. Mikro iğne tutucu, keskin mikro-emişler ve 9-0 dikiş kullanılarak brakiyofalik, sol ortak karotid ve sol subklaviyen arterlerin ortaya çıkışının üzerine dikişler yerleştirilir.
11. Braşiyofalik damarları dağla.
12. Boyun kaslarını ve trakeayı açığa çıkarmak için orta hat boyunca submandibuler tükürük bezlerini ayırın. Krikotiroid ligamenti ortaya çıkarmak için kasları ayırın. Mikro makas kullanarak, bağı bölümlere alarak bir giriş açın.
13. Trakeaya 27 G kateter takın ve trakea dalları bronşlara girene kadar hassas bir şekilde itin (yani katetere direnç karşılanana kadar, sonra 3 mm geri çekilin). Bronşları bozmamaya dikkat edin. 6-0 dikiş kullanarak, kateteri sabitlemek için nefes borusunun etrafına 3 dikiş yerleştirin.
14. Fareyi 12. İnen aort omurgaya doğru ön olarak çalışır ve omurga ile birlikte burada bölümlenmelidir. Alt yarısını ayırın.
15. Aortu retrograd katetere ve kateteri aort arkına ulaşana kadar itin. 9-0 dikiş kullanarak, kateter ucunun 5 mm altından başlayarak aortun etrafına 4 dikiş yerleştirin.

2. Hücreden Arındırma

1. Silikon boru ve Luer konektörleri kullanarak fareyi bir pompa sistemine bağlayın. 15 dakika boyunca 200 μL / dak'ta deiyonize su ile perfuse. Hücreden arındırma sırasında bu akış hızını koruyun.
2. Perfüzyon maddesini deiyonize suda seyreltilmiş% 0,5 sodyum deoksikolat (DOC) olarak değiştirin ve bir gecede perfüzyon.
3. Perfüzyon maddesini deiyonize suda seyreltilmiş% 0.1 sodyum dodecyl sülfat (SDS) ile değiştirin ve 8 saat boyunca perfuse yapın.
4. SDS ve DOC'u 24 saat boyunca yıkamak için bir gecede deiyonize su ile perfuse.
5. Hücreden çıkarılan kalp ve akciğerleri kavisli bir makas kullanarak toraksa bağlayarak resect yapın ve %1 (v/v) penisilin-streptomisin ve 4 °C'de 0.3 μM sodyum azit ile deiyonize su içeren steril bir kriyo-tüpte saklayın^. İskele biyokimyasal analiz için kullanılacaksa (örneğin, kütle spektrometresi), sıvı nitrometrede snap dondurun.

3. İmmünasyon

1. Görüntülemeyi planlayın: birincil antikoru (veya antikorları) ve floresan konjuge sekonder antikorların kombinasyonunu birbirleriyle eşleşecek ve floresan mikroskobun lazer hatlarına uyacak şekilde belirleyin.
2. Örneği% 6 (v / v) eşek serumu içeren bir kriyotüme batırarak engelleyin - bir gecede% 3 (w / v) sığır serumu albümin (BSA).
3. PBS'de %3 eşek serumunda primer antikor (veya antikorlar) ile 24 saat kuluçkaya yatırın.
4. PBS'de (PBST) 20% ara 0,05'te her seferinde 1 saat boyunca 5 kez yıkayın.
5. PBS'de %3 eşek serumunda floresan konjuge sekonder antikor (veya antikorlar) ile numuneyi 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
6. %0,05'te (PBST) 1 saat boyunca 5 kez yıkayın. Her yıkama arasında 1 saat bekleyin.
7. İyonize su ekleyin ve doğrudan ışıktan 4 °C'de saklayın. Bu noktada, iskele görüntüye hazırdır.

4. Görüntüleme

1. Numuneyi cam tabanlı bir tabağa yerleştirin ve iki damla saklama çözeltisi (PBS veya deiyonize su) ile nemlendirin.
2. Hedefi hazırlayın. Suya daldırma hedefi kullanmanızı öneririz.
3. Floresan ışığı kullanarak numuneyi inceleyin.
4. Bilgisayar kontrolüne geçin. Lazerleri açın ve lazer yoğunluğunu, iğne deliği diyaframını, dedektör dalga boylarını, kazancı, çözünürlüğünü ve yakınlaştırmasını ayarlayın. z yığını için sayı ve adım boyutunu ayarlayın ve edinmeye başlayın. Doku penetrasyonunu artırmak ve ışık, ağartma ve doku hasarının saçılmasını en aza indirmek için multifotoğraf lazer ekscitasyon kullanmanızı öneririz.

5. Hematoksilin-eosin lekeleme

1. Ötenazili bir fareden 1 akciğer lobundan alıntı.
2. 10 mm x 10 mm x 5 mm kriyoold yerleştirin ve yaklaşık 500 μL OCT bileşiği ile örtün.
3. Kuru buzda (-70 °C) dondurun ve numuneyi bu sıcaklıkta saklayın.
4. 2.5. adıma göre işlenmiş bir fareden bir hücreden çıkarmış akciğer lobu çıkar.
5. En büyük yüzey alanı aşağı olan bir kriyoold yerleştirin ve adım 5.2'de belirtildiği gibi OCT bileşiği ile örtün.
6. Kuru buzda (-70°C) dondurun ve numuneyi başka türlü gerekli olana kadar bu sıcaklıkta saklayın. Örnek en az 12 hafta saklanabilir.
7. Bölüm donmuş doku blokları -20 °C'de 5 μm kalınlığında bir kriyostatta ve yapışkan cam slaytlara bölümler yerleştirin ve -80 °C'de saklayın.
8. Hava kuruyana kadar (yaklaşık 20 dk) kaymaları oda sıcaklığına alın.
9. Kısa bir süre PBS'ye dalın ve slaytları PBS'de % 4 paraformaldehit içine 15 dakika daldırarak düzeltin. PBS'de bir kez 5 dakika, ardından iki kez damıtılmış suda 5 dakika yıkayın.
10. Mayer'in hematoksilin çözeltisinin içine 10 dakika daldırın. Bu süre doku kaynağına ve leke hazırlamaya göre optimize edilebilir.
11. Bir Coplin kavanozunda damıtılmış su altında 10 dakika yıkayın.
12. 7 dakika boyunca eosin çözeltisinin içine dalın. Bu süre doku kaynağına ve leke hazırlamaya göre optimize edilebilir.
13. %70 etanol ve %96 ve %100 etanol 30 saniye boyunca kısa bir süre daldırma ile fazla Eozin ve susuzluk gidermek için% 50 etanol daldırın. Xylene'e birkaç kez daldırın.
14. Birkaç damla DPX montaj ortamı uygulayın ve bir cam kapak parçası yerleştirin.
15. Slaytları kimyasal bir kaputun altında bir gecede kurumaya bırakın.
16. Slayt tarayıcıdaki slaytları tarayın.

Sonuçlar

Kardiyopulmoner desellülerizasyon
Protokolü başarıyla tamamladıktan sonra kalp ve akciğerlerin yanı sıra aort arkı gibi ek dokular hücrelerden arındırılmış olacaktır. Desellülerizasyon, ecm iskelelerinin hematoksilin-eozin lekelenmesi (Şekil 1) ile doğrulanabilir. Bu iskeleler taze organların boyutlarını korur ve çözünmeyen ECM yapısı bozulmadan ^kalır2. Şekil 2

Tartışmalar

Doku ajitasyonuna dayalı desellülerizasyon teknikleri ECM yapısını değiştirerek ECM yapı analizi için uygun hale ^getirir4. Trakea aort gibi anatomik bir yol kullanarak perfüzyon desellülerizasyonu kılcal yatağa veya terminal alveollere ulaşmayı sağlar ve hücreden çıkarıcı ajanların organ boyunca teslimini kolaylaştırır. Dokuyu hücreden çıkarmak için zwitteriyonik, anionik ve iyonik olmayan deterjanların ^{kullanımı4,5,6}

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)	Ethicon	6301124
9-0 micro-suture (Safil)	B Braun	G1048611
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12
Adson forceps with teeth	Fine Science Tools	11027-12
Castroviejo microneedle holder	Fine Science Tools	no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)	Leica	S6 D
Double-ended microspatula	Fine Science Tools	10091-12
Dumont microforceps (two)	Fine Science Tools	11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two)	Fine Science Tools	11251-35
Hair clippers	Oster	76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)	Fine Science Tools	12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)	BD	381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight)	Fine Science Tools	14110-15
Microforceps with ringed tips (two)	Aesculap	FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved)	Fine Science Tools	15001-08
Minicutter	KLS Martin	80-008-03-04
Molt Periostotome	Aesculap	D0543R
Needles (27 gauge; Microlance)	BD	21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin
Serrated scissors (CeramaCut, straight)	Fine Science Tools	14958-09
Spatula (Freer-Yasargil)	Aesculap	OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak)	BD	3021001
Syringes (10 mL; Plastipak)	BD	3021110
Tendon scissors (Walton)	Fine Science Tools	14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)	Serva	11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)	Millipore	AB756P	Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)			Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)	VWR	233-5364)
Serum (normal donkey serum)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
IMAGING
Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )	Leica
Fluorescence light source	Leica	EL6000
Microscope (inverted multiphoton microscope)	Leica	SP5-X MP
Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)	Leica	HCX PL APO
Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)
White-light laser (WLL)	Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water	Plum	1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)	World Precision Instruments	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Peristaltic pump (with 12 channels)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)	Ole Dich	31399
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate	Sigma-Aldrich	L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA	Fisher Scientific	15434389
96% Ethanol	Plum	201446-5L
Absolute ethanol	Plum	201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)	Hounisen	422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)	Tissue-Tek	4566
Cryostat	Leica	CM3050S
DPX mounting medium	Hounisen	1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5%	Sigma	1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)	Pfm medical	207500003
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)	Thermofisher	6319483
Mayers hematoxylin	Sigma	MHS32-1L
OCT compound	VWR	361603E
Slide scanner (Nanozoomer)	Hamamatsu Photonics
Xylene	Sigma	534056-4L