Décellularisation du complexe cardiopulmonaire murin

Résumé

Ce protocole vise à décellulariser le cœur et les poumons des souris. Les échafaudages de matrice extracellulaire (ECM) qui en résultent peuvent être immunocolorés et imagés pour cartographier l’emplacement et la topologie de leurs composants.

Résumé

Nous présentons ici un protocole de décellularisation pour le cœur et les poumons des souris. Il produit des échafaudages ECM structurels qui peuvent être utilisés pour analyser la topologie et la composition ECM. Il est basé sur une procédure microchirurgicale conçue pour cathétériser la trachée et l’aorte d’une souris euthanasiée afin de perfuser le cœur et les poumons avec des agents décellularisants. Le complexe cardiopulmonaire décellularisé peut ensuite être immunocoloré pour révéler l’emplacement des protéines ECM structurelles. L’ensemble de la procédure peut être complété en 4 jours.

Les échafaudages ECM résultant de ce protocole sont exempts de distorsions dimensionnelles. L’absence de cellules permet l’examen structurel des structures ECM jusqu’à une résolution submicronique en 3D. Ce protocole peut être appliqué aux tissus sains et malades de souris aussi jeunes que 4 semaines, y compris des modèles murins de fibrose et de cancer, ouvrant la voie à la détermination du remodelage ECM associé à la maladie cardiopulmonaire.

Introduction

L’ECM est un réseau tridimensionnel composé de protéines et de glycanes qui accueille toutes les cellules d’un organisme multicellulaire, donnant aux organes leur forme et régulant le comportement cellulaire tout au long de la ^vie1. À partir de la fécondation des ovules, les cellules construisent et remodèlent l’ECM, et sont à leur tour strictement contrôlées par celui-ci. Le but de ce protocole est d’ouvrir la voie à l’analyse et à la cartographie de l’ECM de la souris, car les souris sont l’organisme modèle le plus utilisé en physiopathologie des mammifères.

Le développement de cette méthode a été motivé par la nécessité de caractériser et d’isoler l’ECM2 natif associé aux métastases. Comme les tumeurs manquent de vascularisation anatomique appropriée et que les souris sont des organismes relativement petits, les procédures microchirurgicales ont été conçues pour cathétériser rétrogradement l’aorte, tout en isolant la circulation du vaisseau majeur menant à une tumeur (par exemple, les veines pulmonaires), concentrant ainsi le flux de réactif et permettant la décellularisation tumorale. Cette méthode produit des échafaudages ECM avec une structure ^conservée2 qui peut être immunocolorée et imagée, permettant une cartographie de la structure ECM dans des détails submicroniques. Pour réaliser ce protocole, il est nécessaire d’acquérir des compétences chirurgicales et microchirurgicales (dissection, microsuturing et cathétérisme) qui peuvent représenter une limitation potentielle à son utilisation. À notre connaissance, cette méthode représente l’état de l’art pour l’analyse d’imagerie de structure ECM ^native2,3.

Protocole

Toutes les procédures incluses ici ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique réglementant la médecine expérimentale de l’Université de Copenhague et sont conformes à la législation danoise et européenne. Pour démontrer ce protocole, nous avons utilisé des souris femelles BALB/cJ âgées de 8 à 12 semaines et une souris femelle MMTV-PyMT âgée de 11 semaines.

REMARQUE: Éviter la contamination bactérienne de l’échafaudage ECM décellularisé donne le meilleur résultat d’imagerie et permet le stockage à long terme des échantillons. Il est donc important de garder toutes les étapes stériles. En tant que tels, tous les instruments et le matériel chirurgical, y compris la suture, la micro-suture, les solutions, les tubes, les connecteurs Luer et les cathéters, doivent être stériles. Les surfaces, y compris un plateau en polystyrène, doivent être désinfectées avec de l’éthanol à 70% et la perfusion doit de préférence être effectuée sous une hotte à écoulement laminaire. Toutes les procédures ont lieu à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Microchirurgie post-mortem

1. Euthanasier la souris à l’aide d’une chambre à _CO2 .
   1. Placez la souris dans une chambre de 4 L et commencez à remplir avec 100% de _CO2, en commençant à 0,2 L / min pendant 2 min, en augmentant jusqu’à atteindre un débit de 0,8 L / min après 3 min. La souris devrait tomber inconsciente pendant les 2 premières minutes, puis la respiration devrait cesser (généralement autour de 5 minutes, mais le flux peut être maintenu si nécessaire). Confirmez le décès avant de passer à l’étape suivante.
2. Rasez le thorax, l’abdomen et le dos de la souris avec la tondeuse à cheveux et désinfectez avec de l’éthanol à 70%. Le rasage réduit considérablement le nombre d’artefacts en raison de la présence de poils sur des échantillons pour l’imagerie ou l’analyse biochimique.
3. Épinglez la souris à un plateau en polystyrène, en étendant ses membres antérieurs et postérieurs, ainsi que sa tête et sa queue. Placez-le sous le microscope de microchirurgie.
4. À l’aide d’un motif droit Mayo, les ciseaux établissent un accès chirurgical avec une incision cutanée allant de la région sous-maxillaire au bas-ventre et dissèquent par voie sous-cutanée pour exposer la paroi thoracique et le péritoine.
5. À l’aide de ciseaux microchirurgicaux, coupez les muscles pectoraux majeurs et pectoraux mineurs le long du sixième espace intercostal des deux côtés de la paroi thoracique.
6. À l’aide de ciseaux à motif droit, coupez le sternum le long des incisions précédentes, puis complétez une sternotomie en coupant le sternum le long de son long axe, puis élevez et épinglez les deux côtés de la paroi thoracique pour exposer le complexe cardiopulmonaire.
7. À l’aide de micro-pinces à pointe ronde (ou micro-pinces Demont), excisez le thymus et le tissu adipeux environnant en les retirant délicatement de leurs attaches. Cela révélera les principaux navires.
8. À l’aide de la cautérisation, cautériser la veine cava descendante et, à l’aide de ciseaux à motif droit, couper l’œsophage.
9. À l’aide de micro-pinces pointues, séparez les veines brachiocéphales et les artères carotides communes gauches et sous-clavières brachiocéphales du tissu sous-jacent pour faciliter la ligature et la cautérisation.
10. À l’aide d’un porte-micro-aiguille, de micro-pinces pointues et d’une suture 9-0 placent les points de suture au-dessus de l’émergence des artères brachiocéphales, carotides communes gauches et sous-clavières gauches.
11. Cautériser les veines brachiocéphales.
12. Séparez les glandes salivaires sous-maxillaires le long de la ligne médiane pour exposer les muscles du cou et la trachée. Séparez les muscles pour exposer le ligament cricothyroïdien. À l’aide de micro-ciseaux, ouvrez une entrée en sectionnant le ligament.
13. Introduire un cathéter de 27 G dans la trachée et pousser délicatement jusqu’à ce que la trachée se ramifie dans les bronches (c.-à-d. jusqu’à ce que la résistance au cathéter soit rencontrée, puis reculez de 3 mm). Attention à ne pas perturber les bronches. À l’aide d’une suture 6-0, placez 3 points de suture autour de la trachée pour fixer le cathéter.
14. Sectionnez la souris à la hauteur de la 12e vertèbre thoracique. L’aorte descendante s’étend antérieurement à la colonne vertébrale et doit être sectionnée ici avec la colonne vertébrale. Séparez la moitié inférieure.
15. Cathétériser rétrogradement l’aorte et pousser le cathéter jusqu’à ce qu’il atteigne l’arc aortique. À l’aide d’une suture 9-0, placez 4 points de suture autour de l’aorte, en commençant à 5 mm sous la pointe du cathéter.

2. Décellularisation

1. Connectez la souris à un système de pompe à l’aide de tubes en silicone et de connecteurs Luer. Perfuser avec de l’eau désionisée à 200 μL/min pendant 15 min. Maintenir ce débit pendant la décellularisation.
2. Changer l’agent de perfusion à 0,5% de désoxycholate de sodium (DOC) dilué dans de l’eau désionisée et perfuser pendant la nuit.
3. Changer l’agent de perfusion en sulfate de dodécyle de sodium (SDS) à 0,1% dilué dans de l’eau désionisée et perfuser pendant 8 heures.
4. Perfuser avec de l’eau désionisée pendant la nuit pour laver les FDS et les DOC pendant 24 h.
5. Réséquez le cœur et les poumons décellularisés en sectionnant ses attaches au thorax à l’aide d’un ciseau incurvé et stockez-le dans un cryotube stérile avec de l’eau désionisée contenant 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine et 0,3 μM d’azoture de sodium à 4 °C. Les échafaudages ECM peuvent être conservés pendant au moins 12 ^semaines1. Si l’échafaudage est utilisé pour l’analyse biochimique (p. ex., spectrométrie de masse), congelez-le dans de l’azote liquide.

3. Immunocoloration

1. Planifiez l’imagerie : déterminez l’anticorps primaire (ou les anticorps) et la combinaison d’anticorps secondaires conjugués par fluorescence pour qu’ils correspondent les uns aux autres et s’adaptent aux lignes laser du microscope à fluorescence.
2. Bloquez l’échantillon en l’immergeant dans un cryotube contenant 6% (v/v) de sérum d’âne - 3% (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) pendant la nuit.
3. Incuber avec des anticorps primaires (ou des anticorps) dans du sérum d’âne à 3% dans le PBS pendant 24 h.
4. Laver 5 fois pendant 1 h à chaque fois à 0,05% entre 20 dans PBS (PBST).
5. Incuber l’échantillon avec des anticorps secondaires (ou anticorps) conjugués par fluorescence dans du sérum d’âne à 3% dans du PBS pendant 24 h.
6. Laver 5 fois pendant 1 heure à 0,05% (PBST). Attendez 1 h entre chaque lavage.
7. Ajouter l’eau désionisée et conserver à 4 °C à l’abri de la lumière directe. À ce stade, l’échafaudage est prêt à imager.

4. Imagerie

1. Placez l’échantillon dans un plat à fond de verre et humidifiez-le avec deux gouttelettes de solution de stockage (PBS ou eau désionisée).
2. Préparez l’objectif. Nous vous recommandons d’utiliser un objectif d’immersion dans l’eau.
3. Inspectez l’échantillon à l’aide d’une lumière de fluorescence.
4. Passez au contrôle de l’ordinateur. Allumez les lasers et ajustez l’intensité du laser, l’ouverture du sténopé, les longueurs d’onde des détecteurs, le gain, la résolution et le zoom. Définissez le nombre et la taille de l’étape pour z-stack et commencez l’acquisition. Nous recommandons d’utiliser l’excitation laser multiphotonique pour augmenter la pénétration des tissus et minimiser la diffusion de la lumière, le blanchiment et les dommages tissulaires.

5. Coloration à l’hématoxyline-éosine

1. Excise 1 lobe pulmonaire d’une souris euthanasiée.
2. Placer dans un cryomoulage de 10 mm x 10 mm x 5 mm et le recouvrir d’environ 500 μL de composé OCT.
3. Congeler sur de la glace carbonique (-70 °C) et maintenir l’échantillon à cette température.
4. Exciser un lobe pulmonaire décellularisé d’une souris traitée conformément à l’étape 2.5.
5. Placez dans un cryomoulage avec la plus grande surface vers le bas et recouvrez-le de composé OCT comme spécifié à l’étape 5.2.
6. Lyophiliser sur de la glace carbonique (-70 °C) et maintenir l’échantillon à cette température jusqu’à ce qu’il en soit autrement. L’échantillon peut être conservé pendant au moins 12 semaines.
7. Couper les blocs de tissu congelé à -20 °C dans un cryostat de 5 μm d’épaisseur et placer des sections sur des lames de verre adhésif et les stocker à -80 °C.
8. Porter les lames à température ambiante jusqu’à séchage à l’air (environ 20 min).
9. Immergez-vous rapidement dans pbS et fixez en immergeant les lames dans 4% de paraformaldéhyde dans pbS pendant 15 min. Laver une fois dans du PBS pendant 5 min, puis deux fois dans de l’eau distillée pendant 5 min.
10. Plonger dans la solution d’hématoxyline de Mayer pendant 10 min. Ce temps peut être optimisé en fonction de la source tissulaire et de la préparation des taches.
11. Laver dans un pot Coplin sous eau distillée courante pendant 10 min.
12. Immerger dans une solution d’éosine pendant 7 min. Ce temps peut être optimisé en fonction de la source tissulaire et de la préparation des taches.
13. Tremper dans 50% d’éthanol pour éliminer l’excès d’éosine et déshydrater en trempant rapidement dans 70% d’éthanol, et dans 96% et 100% d’éthanol pendant 30 secondes. Tremper dans le xylène plusieurs fois.
14. Appliquez quelques gouttes de support de montage DPX et placez un couvercle en verre.
15. Laissez sécher les lames pendant la nuit sous une hotte chimique.
16. Numérisez des diapositives dans un scanner de diapositives.

Résultats

Décellularisation cardiopulmonaire
Après avoir terminé avec succès le protocole, le cœur et les poumons, ainsi que le tissu annexe tel que l’arc aortique, seront exempts de cellules. La décellularisation peut être validée par coloration à l’hématoxyline-éosine (Figure 1) des échafaudages ECM montrant l’élimination des noyaux par rapport au tissu natif. Ces échafaudages conservent les dimensions des organes frais et sa s...

Discussion

Les techniques de décellularisation basées sur l’agitation tissulaire modifient la structure de l’ECM, ce qui les rend impropres à l’analyse de la structure de ^l’ECM4. La décellularisation par perfusion, utilisant une voie anatomique telle que l’aorte de la trachée, permet d’atteindre le lit capillaire, ou alvéole terminale, et facilite l’administration d’agents décellularisants dans tout l’organe. L’utilisation de détergents zwittérioniques, anioniques et non ioniques...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)	Ethicon	6301124
9-0 micro-suture (Safil)	B Braun	G1048611
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12
Adson forceps with teeth	Fine Science Tools	11027-12
Castroviejo microneedle holder	Fine Science Tools	no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)	Leica	S6 D
Double-ended microspatula	Fine Science Tools	10091-12
Dumont microforceps (two)	Fine Science Tools	11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two)	Fine Science Tools	11251-35
Hair clippers	Oster	76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)	Fine Science Tools	12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)	BD	381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight)	Fine Science Tools	14110-15
Microforceps with ringed tips (two)	Aesculap	FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved)	Fine Science Tools	15001-08
Minicutter	KLS Martin	80-008-03-04
Molt Periostotome	Aesculap	D0543R
Needles (27 gauge; Microlance)	BD	21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin
Serrated scissors (CeramaCut, straight)	Fine Science Tools	14958-09
Spatula (Freer-Yasargil)	Aesculap	OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak)	BD	3021001
Syringes (10 mL; Plastipak)	BD	3021110
Tendon scissors (Walton)	Fine Science Tools	14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)	Serva	11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)	Millipore	AB756P	Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)			Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)	VWR	233-5364)
Serum (normal donkey serum)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
IMAGING
Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )	Leica
Fluorescence light source	Leica	EL6000
Microscope (inverted multiphoton microscope)	Leica	SP5-X MP
Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)	Leica	HCX PL APO
Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)
White-light laser (WLL)	Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water	Plum	1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)	World Precision Instruments	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Peristaltic pump (with 12 channels)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)	Ole Dich	31399
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate	Sigma-Aldrich	L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA	Fisher Scientific	15434389
96% Ethanol	Plum	201446-5L
Absolute ethanol	Plum	201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)	Hounisen	422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)	Tissue-Tek	4566
Cryostat	Leica	CM3050S
DPX mounting medium	Hounisen	1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5%	Sigma	1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)	Pfm medical	207500003
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)	Thermofisher	6319483
Mayers hematoxylin	Sigma	MHS32-1L
OCT compound	VWR	361603E
Slide scanner (Nanozoomer)	Hamamatsu Photonics
Xylene	Sigma	534056-4L