Descelularização do Complexo Cardiopulmonar Murine

Resumo

Este protocolo visa descelularizar o coração e os pulmões dos ratos. Os andaimes de matriz extracelular resultante (ECM) podem ser imunossuados e imagens para mapear a localização e topologia de seus componentes.

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo de descelularização para coração e pulmões de rato. Produz andaimes estruturais de ECM que podem ser usados para analisar topologia e composição de ECM. Baseia-se em um procedimento microcirúrgico projetado para cateterizar a traqueia e a aorta de um rato eutanizado para perfundir o coração e os pulmões com agentes descelularizantes. O complexo cardiopulmonar descelularizado pode, posteriormente, ser imunossuperado para revelar a localização de proteínas estruturais de ECM. Todo o procedimento pode ser concluído em 4 dias.

Os andaimes ECM resultantes deste protocolo estão livres de distorções dimensionais. A ausência de células permite o exame estrutural das estruturas de ECM até a resolução de submicron em 3D. Este protocolo pode ser aplicado a tecidos saudáveis e doentes de camundongos com até 4 semanas de idade, incluindo modelos de camundongos de fibrose e câncer, abrindo caminho para determinar a remodelação do ECM associada à doença cardiopulmonar.

Introdução

O ECM é uma rede tridimensional feita de proteínas e glicanos que acomoda todas as células em um organismo multicelular, dando aos órgãos sua forma e regulando o comportamento celular ao longo da ^vida1. A partir da fertilização dos óvulos em diante, as células constroem e remodelam o ECM, e por sua vez são estritamente controladas por ele. O objetivo deste protocolo é abrir uma maneira de analisar e mapear o ECM do rato, já que os camundongos são o organismo modelo mais utilizado na fisiopatologia mamífera.

O desenvolvimento deste método foi impulsionado pela necessidade de caracterizar e isolar o ^ECM2 nativo associado à metástase. Como os tumores não possuem vascularização anatômica adequada e os camundongos são organismos relativamente pequenos, procedimentos microcirúrgicos foram projetados para cateterizar retrogrademente a aorta, isolando a circulação do vaso principal que leva a um tumor (por exemplo, as veias pulmonares), focando assim o fluxo de reagentes e permitindo a descelularização tumoral. Este método produz andaimes ECM com uma estrutura ^conservada2 que podem ser imunossuídas e imagens, permitindo o mapeamento da estrutura ECM em detalhes de submicron. Para realizar esse protocolo, é necessário adquirir habilidades cirúrgicas e microcirúrgicas (dissecção, microsutura e cateterismo) que possam representar uma potencial limitação ao seu uso. Para nosso conhecimento, este método representa o estado da arte para análise de imagem de estrutura ecm ^nativa2,3.

Protocolo

Todos os procedimentos aqui incluídos foram revisados e aprovados pelo comitê de ética que regula a medicina experimental na Universidade de Copenhague e concordam com a legislação dinamarquesa e europeia. Para demonstrar este protocolo, usamos camundongos BALB/cJ fêmeas de 8-12 semanas de idade e um rato fêmea MMTV-PyMT de 11 semanas de idade.

NOTA: Evitar a contaminação bacteriana do andaime ECM descelularizado dá o melhor resultado de imagem e permite o armazenamento de amostras a longo prazo. Por isso, é importante manter todos os passos estéreis. Assim, todos os instrumentos e materiais cirúrgicos, incluindo sutura, microssutura, soluções, tubos, conectores Luer e cateteres, devem ser estéreis. As superfícies, incluindo uma bandeja de poliestireno, devem ser desinfetadas com 70% de etanol, e a perfusão deve ser realizada preferencialmente sob uma coifa de fluxo laminar. Todos os procedimentos ocorrem à temperatura ambiente, a menos que seja indicado de outra forma.

1. Microcirurgia pós-morte

1. Eutanize o rato usando uma câmara _{de CO2} .
   1. Coloque o mouse em uma câmara de 4 L, e comece a encher com 100% de _CO2, começando em 0,2 L/min por 2 min, aumentando até atingir um fluxo de 0,8 L/min após 3 min. O rato deve cair inconsciente durante os primeiros 2 minutos, e então a respiração deve cessar (geralmente em torno de 5 minutos, mas o fluxo pode ser mantido conforme necessário). Confirme a morte antes de prosseguir para o próximo passo.
2. Raspe o tórax, o abdômen e a parte de trás do rato com o cortador de cabelo e desinfete com 70% de etanol. A depilação reduz consideravelmente o número de artefatos devido à presença de cabelos em amostras para análise de imagem ou bioquímica.
3. Fixe o mouse em uma bandeja de poliestireno, estendendo seus dentes e traseiros, bem como sua cabeça e cauda. Coloque-o sob o microscópio de microcirurgia.
4. O uso de uma tesoura de padrão reto mayo estabelece o acesso cirúrgico com uma incisão cutânea que vai da região submandibular até o abdômen inferior e disseco subcutânea para expor a parede torácica e o peritônio.
5. Usando tesoura microcirúrgica, corte os músculos peitoralis maiores e peitoral ao longo do sexto espaço intercostal em ambos os lados da parede torácica.
6. Usando uma tesoura de padrão reto, corte o esterno ao longo das incisões anteriores e, em seguida, complete uma esterno cortando o esterno ao longo de seu eixo longo, em seguida, eleve e fixe ambos os lados da parede torácica para expor o complexo cardiopulmonar.
7. Usando micro-fórceps de ponta redonda (ou micro-fórceps Dumont), extirpo o timo e o tecido adiposo circundante, retirando-os delicadamente de seus acessórios. Isso revelará as principais naves.
8. Usando o cautery, cauterize a veia cava descendente e, usando uma tesoura de padrão reto, corte o esôfago.
9. Usando micro-fórceps afiados, separe as veias braquiocefálicas e as braquiocefálicas, deixaram as artérias subcláusicas comuns e esquerda do tecido subjacente para facilitar a ligadura e a cauterização.
10. Utilizando suporte de micropeça, micro-fórceps afiados e pontos de sutura 9-0 acima do surgimento do braquiocefálico, deixado carótida comum e artérias subclávias esquerdas.
11. Cauterize as veias braquiocefálicas.
12. Separe as glândulas salivares submandibulares ao longo da linha média para expor os músculos do pescoço e a traqueia. Separe os músculos para expor o ligamento cricothiroide. Usando micro-tesoura, abra uma entrada seccionando o ligamento.
13. Introduza um cateter de 27 G na traqueia e empurre delicadamente até que a traqueia se esque no brônquio (ou seja, até que a resistência ao cateter seja atendida, depois retire 3 mm). Tenha cuidado para não interromper os brônquios. Usando uma sutura 6-0, coloque 3 pontos ao redor da traqueia para fixar o cateter.
14. Seção o rato na altura da 12ª vértebra torácica. A aorta descendente corre anteriormente até a coluna vertebral e deve ser seccionada aqui junto com a coluna. Desmonte a metade inferior.
15. Cateterize retrógradamente a aorta e empurre o cateterismo até atingir o arco aórtico. Com sutura 9-0, coloque 4 pontos ao redor da aorta, começando 5 mm abaixo da ponta do cateter.

2. Descelularização

1. Conecte o mouse a um sistema de bomba usando tubos de silicone e conectores Luer. Perfuuse com água deionizada a 200 μL/min por 15 min. Mantenha essa taxa de fluxo durante a descelularização.
2. Mude o agente de perfusão para 0,5% de desoxicolato de sódio (DOC) diluído em água deionizada e perfuuse durante a noite.
3. Mude o agente de perfusão para sulfato de dodecyl de sódio de 0,1% de sódio (SDS) diluído em água desionizada e perfuuse por 8 horas.
4. Perfume com água desionizada durante a noite para lavar SDS e DOC por 24 horas.
5. Ressecize o coração e os pulmões descelularizados, seccionando seus acessórios ao tórax usando uma tesoura curvada e armazenar em um tubo criogênico estéril com água desionizada com penicilina-estreptomicina de 1% (v/v) e 0,3 μM de azida de sódio a 4 °C. Os andaimes ECM podem ser armazenados por pelo menos por pelo menos 12 ^semanas1. Se o andaime for usado para análise bioquímica (por exemplo, espectrometria de massa), estote o congelamento em nitrogênio líquido.

3. Imunostaining

1. Planeje a imagem: determinar anticorpos primários (ou anticorpos) e a combinação de anticorpos secundários fluorescentes conjugados para combinar uns com os outros e para se encaixar nas linhas laser do microscópio de fluorescência.
2. Bloqueie a amostra imergindo-a em um criobotube contendo 6% (v/v) soro de burro - 3% (w/v) albumina de soro bovino (BSA) durante a noite.
3. Incubar com anticorpos primários (ou anticorpos) em 3% de soro de burro em PBS por 24 h.
4. Lave 5 vezes por 1h cada vez em 0,05% entre 20 em PBS (PBST).
5. Incubar a amostra com anticorpo secundário fluorescente conjugado (ou anticorpos) em 3% de soro de burro em PBS por 24 h.
6. Lave 5 vezes por 1 hora em 0,05% (PBST). Aguarde 1h entre cada lavagem.
7. Adicione água deionizada e armazene a 4 °C de distância da luz direta. Neste ponto, o andaime está pronto para a imagem.

4. Imagem

1. Coloque a amostra em um prato com fundo de vidro e umidize-a com duas gotículas de solução de armazenamento (PBS ou água deionizada).
2. Prepare o objetivo. Recomendamos o uso de um objetivo de imersão em água.
3. Inspecione a amostra usando luz de fluorescência.
4. Mude para controle de computador. Ligue lasers e ajuste a intensidade do laser, abertura do pinhole, detectores de comprimentos de onda, ganho, resolução e zoom. Defina o número e o tamanho do passo para z-stack e comece a aquisição. Recomendamos o uso de excitação a laser multifotônio para aumentar a penetração tecidual e minimizar a dispersão de luz, branqueamento e danos teciduais.

5. Mancha de hematoxilina-eosina

1. Exciso 1 lobo pulmonar de um rato eutanizado.
2. Coloque em um criomold de 10 mm x 10 mm x 5 mm e cubra-o com aproximadamente 500 μL de composto OCT.
3. Congele em gelo seco (-70 °C) e mantenha a amostra a essa temperatura.
4. Exciso um lobo pulmonar descelularizado de um rato processado de acordo com a etapa 2.5.
5. Coloque em um criomold com a maior área de superfície para baixo e cubra-a com composto OCT conforme especificado na etapa 5.2.
6. Congele em gelo seco (-70°C) e mantenha a amostra a essa temperatura até que seja necessário. A amostra pode ser armazenada por pelo menos 12 semanas.
7. Seção blocos de tecido congelado a -20 °C em um criostat com 5 μm de espessura e coloque seções em lâminas de vidro adesivos e armazene a -80 °C.
8. Leve os slides à temperatura ambiente até que o ar seque (aproximadamente 20 min).
9. Logo mergulhe no PBS e fixe imergindo os slides em 4% de paraformaldeído em PBS por 15 minutos. Lave uma vez na PBS por 5 minutos, depois duas em água destilada por 5 minutos.
10. Mergulhe na solução de hematoxilina de Mayer por 10 minutos. Este tempo pode ser otimizado de acordo com a origem do tecido e preparação de manchas.
11. Lave em um frasco de Coplin sob água destilada por 10 minutos.
12. Mergulhe na solução de eosin por 7 min. Este tempo pode ser otimizado de acordo com a origem do tecido e preparação de manchas.
13. Queda de 50% de etanol para remover o excesso de Eosin e desidratar em pouco tempo em 70% de etanol, e em 96% e 100% etanol por 30 segundos. Mergulhe em xileno várias vezes.
14. Aplique algumas gotas de meio de montagem DPX e coloque uma mancha de tampa de vidro.
15. Deixe os slides secar durante a noite sob um capô químico.
16. Digitalize slides em um scanner de slides.

Resultados

Descelularização cardiopulmonar
Após a conclusão do protocolo com sucesso, o coração e os pulmões, bem como o tecido anexo, como o arco aórtico, estarão livres de células. A descelularização pode ser validada pela coloração de hematoxilina-eosina (Figura 1) dos andaimes ECM mostrando a remoção dos núcleos comparando com o tecido nativo. Estes andaimes retêm as dimensões de órgãos frescos e sua estrutura ECM insolúvel ...

Discussão

Técnicas de descelularização baseadas na agitação tecidual alteram a estrutura do ECM, tornando-as inadequadas para análise da estrutura do ^ECM4. A descelularização da perfusão, utilizando uma rota anatômica como a aorta da traqueia, permite chegar ao leito capilar, ou alvéolo terminal, e facilita a entrega de agentes descelularizantes em todo o órgão. O uso de detergentes zwitterionic, aniônicos e não iônicos para descelularizar tecidos é relatado4,5,6, no entanto, sulfato de dod...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSURGERY
6-0 suture, triangular section needle (Vicryl)	Ethicon	6301124
9-0 micro-suture (Safil)	B Braun	G1048611
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12
Adson forceps with teeth	Fine Science Tools	11027-12
Castroviejo microneedle holder	Fine Science Tools	no. 12061-01
CO2 ventilation chamber for mouse euthanasia
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Disposable polystyrene tray (~30 × 50 cm)
Dissection microscope (Greenough, with two-armed gooseneck)	Leica	S6 D
Double-ended microspatula	Fine Science Tools	10091-12
Dumont microforceps (two)	Fine Science Tools	11252-20
Dumont microforceps with 45° tips (two)	Fine Science Tools	11251-35
Hair clippers	Oster	76998-320-051
Halsey needle holder (with tungsten carbide jaws)	Fine Science Tools	12500-12
Intravenous 24-gauge catheter (Insyte)	BD	381512
Intravenous 26-gauge catheter (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Mayo scissors (tough cut, straight)	Fine Science Tools	14110-15
Microforceps with ringed tips (two)	Aesculap	FM571R
Micro-spring scissors (Vannas, curved)	Fine Science Tools	15001-08
Minicutter	KLS Martin	80-008-03-04
Molt Periostotome	Aesculap	D0543R
Needles (27 gauge; Microlance)	BD	21018
Paper towel (sterile) or surgical napkin
Serrated scissors (CeramaCut, straight)	Fine Science Tools	14958-09
Spatula (Freer-Yasargil)	Aesculap	OL166R
Syringes (1 mL; Plastipak)	BD	3021001
Syringes (10 mL; Plastipak)	BD	3021110
Tendon scissors (Walton)	Fine Science Tools	14077-09
IMMUNOSTAINING
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG	Life Technologies	A11037
BSA(albumin bovine fraction V, standard grade, lyophilized)	Serva	11930.03
Collagen IV polyclonal antibody (RRID: AB_2276457)	Millipore	AB756P	Host: rabbit
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Host: goat
Periostin polyclonal antibody (a kind gift from Manuel Koch. RRID:AB2801621)			Host: guinea pig
Scalpel disposable with blade no.11 (pcs. 10)	VWR	233-5364)
Serum (normal donkey serum)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416-50ML
IMAGING
Detectors (hybrid detector (Leica, HyD S model) and photomultiplier tubes (PMTs; )	Leica
Fluorescence light source	Leica	EL6000
Microscope (inverted multiphoton microscope)	Leica	SP5-X MP
Objective (lambda blue, 20×, 0.70 numerical aperture (NA) IMM UV)	Leica	HCX PL APO
Two-photon Ti–sapphire laser (Spectra-physics, Mai Tai DeepSee model)
White-light laser (WLL)	Leica
DECELLULARIZATION
70% Ethanol (absolute alcohol 99.9%); absolute alcohol must be adjusted to 70% (vol/vol) using deionized water	Plum	1680766
Deionized water (Milli-Q IQ 7000, Ultrapure lab water system)	Merck	ZIQ7000T0
Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)	World Precision Instruments	13158-100
PBS (pH 7.4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Scientific	70011044
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140122
Peristaltic pump (with 12 channels)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Silicone tubing (with 2-mm i.d. and 4 mm o.d.)	Ole Dich	31399
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G
Sodium Dodecyl Sulphate	Sigma-Aldrich	L3771-500G
H&E STAINING
4% PFA	Fisher Scientific	15434389
96% Ethanol	Plum	201446-5L
Absolute ethanol	Plum	201152-1L
Coverslips (24x50mm; 1000 pcs)	Hounisen	422.245
Cryomolds Intermediate (15 x 15 x 5 mm; 100 pcs)	Tissue-Tek	4566
Cryostat	Leica	CM3050S
DPX mounting medium	Hounisen	1001.0025
Eosin Y solution alcoholic 0.5%	Sigma	1024390500
Feather microtome blade stainless steel,C35 (50 pcs)	Pfm medical	207500003
Fisherbrand Superfrost Plus slides (25 x 75 mm; 144 pcs)	Thermofisher	6319483
Mayers hematoxylin	Sigma	MHS32-1L
OCT compound	VWR	361603E
Slide scanner (Nanozoomer)	Hamamatsu Photonics
Xylene	Sigma	534056-4L