JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويرد هنا وصف لطريقة دقيقة وقابلة للاستنساخ في النيوكليوسيدات الحية/النيوكليوتيدات في النباتات. يستخدم هذا الأسلوب HPLC-MS/MS.

Abstract

النيوكليوسيدات / النيوكليوتيدات هي لبنات بناء الأحماض النووية ، وأجزاء من الكوسوبسترات والإنزيمات ، وجزيئات إشارات الخلايا ، وحاملات الطاقة ، والتي تشارك في العديد من أنشطة الخلايا. هنا، ونحن نصف طريقة سريعة وموثوق بها للتأهيل المطلق لمحتويات النيوكليوسيد / النيوكليوتيدات في النباتات. لفترة وجيزة، تم استخراج 100 ملغ من المواد النباتية المتجانسة مع 1 مل من العازلة استخراج (الميثانول، أسيتونيتريل، والمياه بنسبة 2:2:1). وفي وقت لاحق، تركزت العينة خمس مرات في مجفف تجميد ثم حقنت في أحد أعمدة النيوكليوتيدات HPLC-MS/MS. وتم فصلها على عمود كربون جرافيتي مسامي (PGC) وتم فصل النيوكليوسيدات على عمود C18. ورصدت التحولات الجماعية لكل نيوكليوسيد ونوكليوتيد عن طريق قياس الطيف الكتلي. تم قياس محتويات النيوكليوسيدات والنيوكليوتيدات كميا وفقا لمعاييرها الخارجية (ESTDs). باستخدام هذه الطريقة، لذلك، يمكن للباحثين بسهولة قياس النيوكليوسيدات / النيوكليوتيدات في النباتات المختلفة.

Introduction

النيوكليوسيدات/ النيوكليوتيدات هي مكونات التمثيل الغذائي المركزية في جميع الكائنات الحية، والتي هي سلائف للأحماض النووية والعديد من الأنزيمات، مثل النيكوتيناميد أدينين دينوكليوتيد (NAD)، ومهمة في تركيب الجزيئات الكبيرة مثل فوسفوليبيدس، الجليكوليبيدات، والسكريات. هيكليا، النيوكليوسيد يحتوي على نواة، والتي يمكن أن تكون أدينين، جوانين، أوراسيل، السيتوزين، أو الثيمين، وموسيتي السكر، والتي يمكن أن تكون الريبوز أو ديوكسيريبوز1،2. النيوكليوتيدات لديها ما يصل إلى ثلاث مجموعات فوسفات ملزمة لموقف 5 الكربون من moiety السكر من النيوكليوسيدات3. التمثيل الغذائي للنيوكليوتيدات في النباتات أمر ضروري لإنبات البذور ونمو الأوراق4،5،6. لفهم أفضل أدوارها الفسيولوجية في تطوير النبات، ينبغي أن تنشأ أساليب القياس الكمي المطلق للنيوكليوسيدات المختلفة / النيوكليوتيدات في الجسم الحي.

واحدة من النهج الأكثر استخداما لقياس النيوكليوسيدات / النيوكليوتيدات توظف الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) إلى جانب الأشعة فوق البنفسجية مرئية (الأشعة فوق البنفسجية-VIS) كاشف4،7،8،9،10،11. في عام 2013، باستخدام HPLC، Dahncke وويت كميا عدة أنواع من النيوكليوسيدات في Arabidopsis thaliana7. وحددوا محتوى معززا من الجوانوزين في عملية استهداف متحولة لإدراج الحمض النووي في جين جوانوسين ديموناسي مقارنة بالنبات البري. كما تم الكشف عن نواة بيريميدين أخرى، وهي السيتيدين، كميا في النباتات التي تستخدم هذه الطريقة، مما أدى إلى تحديد جين الدياميناسي السيتيدين حسن النية 4. واستنادا إلى كاشف الأشعة فوق البنفسجية، لا يمكن لهذه الطريقة أن تميز بسهولة بين النيوكليوسيدات التي لها أطياف وأوقات استبقاء مماثلة، مثل الجوانوزين أو زانثوسين. الحد الأقصى للكشف عن طريقة HPLC مرتفع نسبيا ، لذلك ، فإنه يستخدم بشكل متكرر لقياس المحتوى العالي من النيوكليوسيدات في الجسم الحي ، مثل السيتيدين ، أوريدين ، وغوانوزين.

وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدام كروماتوغرافيا الغاز إلى جانب قياس الطيف الكتلي (GC-MS) في قياس النيوكليوسيد. الاستفادة منه، هاك وآخرون. al. اكتشف بنجاح uridine وحمض اليوريك، وهو المستقلب المصب من مسار تقويضي نيوكليوسيد، في بذور A. الثاليانا12. ومع ذلك، يستخدم عادة GC لفصل المركبات المتطايرة ولكن ليست مناسبة للمواد labile حراريا. لذلك ، فإن الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي (LC-MS / MS) هي على الأرجح تقنية تحليلية أكثر ملاءمة ودقة لتحديد النيوكليوسيدات / النيوكليوتيدات13،14. وأفادت عدة دراسات سابقة أن عمود HILIC يمكن استخدامها لفصل النيوكليوسيدات والنيوكليوتيدات15،16 والمعايير الداخلية وصفت نظائرها استخدمت للقياس الكمي المركب17. ومع ذلك، فإن كلا العنصرين مكلفان نسبيا، ولا سيما المعايير التجارية المسماة بالنظائر. هنا، نبلغ عن نهج LC-MS/MS القابل للتطبيق اقتصاديا لقياس النيوكليوسيدات/النيوكليوتيدات. وقد تم بالفعل استخدام هذه الطريقة بنجاح لكمية من النيوكليوسيدات المتنوعة / النيوكليوتيدات، بما في ذلك ATP، N6-ميثيل أمبير، AMP، GMP، uridine، السيتيدين، وswswuridine1،5،6،18، في النباتات وDrosophila. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الطريقة التي نبلغ عنها هنا في كائنات حية أخرى أيضا.

Protocol

1 نمو النبات وجمع المواد

  1. تأكد من تعقيم بذور الأرابيدوس في الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 10 دقائق وزرعها على أطباق أجار ، والتي تم إعدادها مع نصف قوة موراشيج والمواد المغذية سكوغ.
  2. احتضان لوحات تحتوي على بذور Arabidopsis تحت الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 48 ساعة، ومن ثم نقلها إلى غرفة النمو التي تسيطر عليها تحت ضوء 16 ساعة من 55 ميكرومول م-2 ق-1 في 22 درجة مئوية و 8 ساعة الظلام في 20 درجة مئوية.
  3. حصاد 100 ملغ من الشتلات لمدة أسبوعين (الوزن الطازج) وتجميد النيتروجين السائل لاستخراج الأيض.
    تنبيه: يجب على الباحثين ارتداء القفازات والنظارات الواقية ومعطف المختبر بشكل مناسب لتجنب تلوث الأنسجة البشرية أثناء جمع المواد.

2 استخراج النيوكليوسيدات/النيوكليوتيدات

  1. الأرض 100 ملغ من الأنسجة النباتية المجمدة مع 7-8 حبات الصلب في مطحنة خلاط ما قبل الباردة لمدة 5 دقائق على تردد 60 هرتز.
  2. إعداد محلول الاستخراج، الذي يحتوي على الميثانول، أسيتونيتريل، والماء في نسبة 2:2:1.
  3. Resuspend المواد المتجانسة (بما في ذلك معظم الأيض ولكن ليس البروتينات) مع 1 مل من محلول الاستخراج.
  4. الطرد المركزي الحل الناتج في 12،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  5. نقل 0.5 مل من التعليق إلى أنبوب جديد 1.5 مل وتجميد في النيتروجين السائل.
  6. تتبخر العينة المجمدة في داير تجميد وإعادة الإنفاق في 0.1 مل من 5٪ أسيتونيتريل و 95٪ من الماء.
  7. طرد مركزي الحل الناتج (0.1 مل) في 40،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. قم بتحميل النافورة في قارورة لقياس LC-MS/MS.

قياس 3 LC-MS/MS

  1. إعداد خلات الأمونيوم العازلة 10 mM عن طريق حل 1.1 غرام من خلات الأمونيوم في 2 لتر من الماء المزدوج deionized (المرحلة المتنقلة A). ضبط درجة الحموضة إلى 9.5 في 10٪ حمض الأمونيوم وخلات.
  2. إعداد 2 لتر من الميثانول فائقة 100٪ (المرحلة المتنقلة B1) لقياس النيوكليوسيدات. أيضا، وإعداد 2 لتر من أسيتونيتريل فائقة 100٪ (المرحلة المتنقلة B2) لقياس النيوكليوتيدات.
  3. حقن 0.02 مل من الأيض المعالجة مسبقا استخراج كل عينة من الخطوة 2.7 في نظام HPLC مع مضخات ثنائية (LC) إلى جانب مطياف كتلة رباعية الثلاثي (MS).
    تنبيه: يستخدم نظام HPLC عمود C18 (50 × 4.6 مم، حجم الجسيمات 5 ميكرومتر؛ العمل عند 25 درجة مئوية) التخزين المؤقت مع المرحلة المتنقلة A و B1(الشكل 1A)لفصل النيوكليوسيدات واستخدام الكربون الجرافيتي مسامية (PGC) العمود (50 × 4.6 ملم، حجم الجسيمات 5 ميكرومتر؛ العمل في 25 درجة مئوية) مع المرحلة المتنقلة A و B2 (الشكل 1B) لفصل النيوكليوتيدات. تم حقن كل عينة ثلاث مرات للنسخ المتماثل التقني.
  4. برمجة الأسلوب كما هو موضح في الجدول 1 للعمود C18، والأسلوب كما هو موضح في الجدول 2 لعمود PGC. حدد معدل تدفق قدره 0.65 مل دقيقة-1.
    ملاحظة: رصد مطياف الكتلة(الجدول 3)التحولات الكتلية. وترد في الجدول 3 شروط تحليل الطيف الكتلي لثمانية نوكليوسيدات وخمسة نويدات تحتوي على نويدات قانونية وأخرى معدلة.
  5. سجل مناطق الذروة لكل مركب مستهدف (الشكل 1).

4 جيل من منحنيات المعايرة القياسية

  1. تجمع ستة استخراج عينة معا، والتي تم إنتاجها بعد الوصف في القسم 2، ودوامة ذلك. ثم، aliquot إلى ستة استخراج (نفس الحجم) مرة أخرى للحصول على كل خلفية.
  2. إضافة ستة تركيزات مختلفة من كل معيار لهذه الاستخراجات الستة، على التوالي، وحقنها واحدا تلو الآخر بعد الخطوة 3.3.
  3. سجل مناطق الذروة لكل معيار بتركيزات مختلفة عبر التحولات الجماعية كما هو موضح في الخطوتين 3.4 و3.5.
  4. رسم منطقة الذروة مقابل التركيز الاسمي لكل معيار لتوليد منحنى من ست نقاط.
    ملاحظة: ينبغي أن تقع مناطق الذروة للنيوكليوسيدات/النيوكليوتيدات المسجلة في الخطوة 3-5 في نطاق منحنيات المعايرة القياسية.
  5. حساب معادلة خط مستقيم لكل مركب قياسي: Y = aX + b

5 الأيض 'القياس الكمي

  1. حساب محتويات الأيض باستخدام منطقة الذروة المسجلة في الخطوة 3.5 والمعادلة من الخطوة 4.5.

النتائج

هنا، نعرض تحديد وتحديد كمي من N1-methyladenosine، وهو نوكليوسيد معدلة معروفة، في نوع البرية Arabidopsis 2-old (كول-0) الشتلات كمثال. يشير ملف قياس الطيف الكتلي إلى أن أيونات المنتج المتولدة من معيار N1-methyladenosine هي 150 م/ض و 133 م/ض(الشكل 2A)،ويلاحظ نفس الملف الشخص...

Discussion

تحتوي الكائنات الحية على العديد من النيوكليوسيدات / النيوكليوتيدات ، بما في ذلك تلك الكنسية والانحرافات. ومع ذلك ، فإن أصلها ونقاط النهاية الأيضية منها ، وخاصة النيوكليوسيدات المعدلة ، لا تزال غامضة. وعلاوة على ذلك، فإن الفهم الحالي لوظيفة وهوتوستاسيس من التمثيل الغذائي للنيوكليوسيدات/ا...

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل ماليا من قبل صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (KJQN202060)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31900907)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (BK20190528)، والمركز الدولي للهندسة الوراثية والتكنولوجيا الحيوية (CRP/CHN20-04_EC) إلى M.C، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (LGZD202004) إلى X.L.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
acetonitrileSigma-Aldrich1000291000
adenosineSigma-AldrichA9251-1G
ammonium acetateSigma-Aldrich73594-100G-F
AMPSigma-Aldrich01930-5G
CMPSigma-AldrichC1006-500MG
cytidineSigma-AldrichC122106-1G
GMPSigma-AldrichG8377-500MG
guanosineSigma-AldrichG6752-1G
Hypercarb columnThermo Fisher Scientific GmbH35005-054630
IMPSigma-Aldrich57510-5G
inosineSigma-AldrichI4125-1G
methanolSigma-Aldrich34860-1L-R
N1-methyladenosineCarbosynthNM03697
O6-methylguanosineCarbosynthNM02922
Murashige and Skoog MediumDuchefa BiochemieM0255.005
Polaris 5 C18A columnAgilent TechnologiesA2000050X046
pseudouridineCarbosynthNP11297
UMPSigma-AldrichU6375-1G
uridineSigma-AldrichU3750-1G

References

  1. Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -. P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
  2. Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
  3. Witte, C. -. P., Herde, M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).
  4. Chen, M., Herde, M., Witte, C. -. P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
  5. Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
  6. Chen, M., Witte, C. -. P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
  7. Dahncke, K., Witte, C. -. P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
  8. Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
  9. Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
  10. Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
  11. Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
  12. Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
  13. Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
  14. Zong, S. -. Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
  15. Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
  16. Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
  17. Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
  18. Baccolini, C., Witte, C. -. P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168 HPLC MS MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved