HPLC-MS/MS를 사용하여 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량 측정을 위한 식물 샘플 준비

요약

식물에서 생체 내 뉴클레오시드/뉴클레오티드 정량화를 위한 정밀하고 재현 가능한 방법은 여기에 설명된다. 이 방법은 HPLC-MS/MS를 사용합니다.

초록

뉴클레오시드/뉴클레오티드는 많은 세포 활동에 관여하는 핵산, 코기타산 및 코엔자임, 세포 신호 분자 및 에너지 운반선의 구성 요소입니다. 여기서, 우리는 식물에서 뉴클레오시드/뉴클레오티드 함량의 절대적 자격을 위한 신속하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다. 간단히, 균질화된 식물 물질의 100 mg은 추출 버퍼 (메탄올, 아세토나이트 및 물의 비율로 2:2:1)로 추출되었다. 나중에, 시료는 동결 건조기에서 5회 농축된 다음 HPLC-MS/MS. 뉴클레오티드로 주입되어 다공성 흑연 탄소(PGC) 컬럼및 뉴클레오시드를 C18 컬럼상에 분리하였다. 각 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 질량 전이는 질량 분석법에 의해 모니터링되었다. 뉴클레오시드와 뉴클레오티드의 내용물은 그들의 외부 표준(ESTDs)에 대하여 정량화되었다. 따라서 이 방법을 사용하여 연구자들은 다른 식물에서 뉴클레오시드/뉴클레오티드를 쉽게 정량화할 수 있습니다.

서문

뉴클레오시드/뉴클레오티드는 모든 살아있는 유기체의 중심 대사 성분으로, 핵산과 니코티나미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD)와 같은 많은 코엔자임의 전구체이며 인지질, 글리콜리오드 및 폴리삭카라이드와 같은 거대 분자의 합성에 중요합니다. 구조적으로, 뉴클레오시드는 아데닌, 구아닌, 우라실, 시토신, 또는 티민이 될 수 있는 뉴클레오베이스를 함유하고 있으며, 리보오스 또는 데옥시리보제^1,2일수 있는 슈가 모에티가 있다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드^3의슈가 모이티의 5탄소 위치에 결합하는 최대 3개의 인산염 군을 가지고 있다. 식물에서 뉴클레오티드의 물질 대사는 종자 발아 및 잎 성장에 필수적이다^4,5,6. 식물 발달에서 그들의 생리적 역할을 더 잘 이해하기 위해 생체 내의 다른 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 절대적인 정량화를 위한 방법을 확립해야 한다.

뉴클레오시드/뉴클레오티드를 측정하는 가장 일반적으로 사용되는 접근법 중 하나는 자외선가 시동(UV-VIS) 검출기^{4,7,8,9,10,11과}결합된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 채용한다. 2013년, HPLC를 사용하여, Dahncke및 Witte는 아라비도시스 탈리아나^7에서여러 종류의 뉴클레오시드를 정량화시켰다. 그(것)들은 야생 형 식물에 비교된 과노신 deaminase 유전자에 있는 T-DNA 삽입 돌연변이 표적화에 있는 향상된 guanosine 함량을 확인했습니다. 또 다른 피리미딘 뉴클레오시드인 시티딘도 이 방법을 사용하는 식물에서 정량적으로 검출되어 보나 피데 시티딘 데아미나아제 유전자^4의식별을 초래하였다. 그러나 UV 검출기에 기초하여, 이 방법은 구아노신 또는 산토신과 같은 유사한 스펙트럼 및 보존 시간을 갖는 뉴클레오시드를 쉽게 구별할 수 없다. HPLC 방법의 검출 한계는 상대적으로 높기 때문에 시티딘, 우리딘 및 구아노신과 같은 생체 내의 핵세포의 높은 함량을 측정하는 데 자주 사용된다.

또한, 질량 분광법(GC-MS)에 결합된 가스 크로마토그래피는 또한 뉴클레오시드 측정에 사용될 수 있다. 그것에서 혜택을, Hauck et. al. 성공적으로 검출 된 uridine 및 요산, 뉴 클레 오 사이드 이화 경로의 하류 대사 산물, A. thaliana의씨앗에서^12. 그러나, GC는 일반적으로 휘발성 화합물을 분리하는 데 사용되지만 열음부 물질에는 적합하지 않다. 따라서, 질량 분광법(LC-MS/MS)에 결합된 액체 크로마토그래피는 아마도 뉴클레오시드/뉴클레오티드(13)^및14의생체 내 식별, 분리 및 정량화를 위한 보다 적합하고 정확한 분석 기술일 것이다. 여러 이전 연구는 HILIC 컬럼이 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드^{분리(15,16)} 및 동위원소 표지된 내부 표준에 사용될 수 있다고 보고하여 화합물 정량화(17)를 위해 사용되었다. 그러나 두 구성 요소는 상대적으로 비싸며 특히 상업용 동위원소 라벨 표준이 있습니다. 여기서는 뉴클레오시드/뉴클레오티드 측정을 위한 경제적으로 적용되는 LC-MS/MS 접근법을 보고합니다. 이 방법은 이미 ATP, N-6-메틸 AMP, AMP, GMP,우리딘, 시티딘, 및 의사요양1,^5,6,18,식물 및 드로소필라를포함한 다양한 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 양에 성공적으로 사용되어 왔다. 더욱이, 여기에서 보고하는 방법은 그밖 유기체에서또한 이용될 수 있습니다.

프로토콜

1 식물 성장 및 재료 수집

1. 아라비도시스 씨앗을 70% 에탄올로 살균하고 1반강도 무라시게와 스쿠그 영양소로 제조된 한천 접시에 뿌려야 합니다.
2. 48h에 대해 4°C에서 어둡게 아라비도시스 씨앗을 함유한 플레이트를 배양한 다음, 22°C에서 55 μmol^{m-2 s-1의} 16h 빛 아래 제어된 성장 챔버로 옮기고 20°C에서 8시간 어둡게 옮깁니다.
3. 2주 묘목 100mg(신선한 체중)을 수확하고 대사 산물 추출을 위해 액체 질소를 동결하십시오.
   주의: 연구원은 재료 수집 중에 인간 조직 오염을 피하기 위해 장갑, 보호 안경 및 실험실 코트를 적절하게 착용해야합니다.

2 뉴클레오시드/뉴클레오티드 추출

1. 60Hz 의 주파수에서 5 분 동안 사전 차가운 믹서 밀에 7-8 강철 구슬이있는 냉동 식물 조직 100 mg을 접지하십시오.
2. 메탄올, 아세토닐릴 및 물을 포함하는 추출 용액을 2:2:1의 비율로 준비한다.
3. 1mL의 추출 용액으로 균질화된 물질(대부분의 대사산물포함하지만 단백질은 포함되지 않음)을 다시 중단합니다.
4. 4°C에서 15분 동안 12,000 x g의 결과 용액원심분리기.
5. 서스펜션의 0.5mL를 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고 액체 질소에서 동결한다.
6. 냉동 다이어에서 냉동 샘플을 증발시키고 5 % 아세토나이트와 95 %의 물0.1 mL로 재주중지하십시오.
7. 원심분리기 40,000 x g에서 4°C에서 10분 동안 생성된 용액(0.1 mL)을 원심분리합니다. LC-MS/MS 측정을 위해 상체를 유리병에 적재합니다.

3 LC-MS/MS 측정

1. 이중 증분 수(Mobile phase A)의 2L에서 1.1 g의 암모늄 아세테이트를 용해시켜 10mM 암모늄 아세테이트 버퍼를 준비한다. pH를 9.5% 암모늄 및 아세테이트산으로 조정합니다.
2. 뉴클레오시드 측정을 위해 초순수 100% 메탄올(모바일 상 B1)의 2L를 준비한다. 또한 뉴클레오티드 측정을 위해 초순수 100% 아세토닐릴(Mobile phase B2)의 2L을 준비한다.
3. 3중 사중대 질량 분광계(MS)와 결합된 이진 펌프(LC)를 가진 HPLC 시스템에 각 샘플의 전처리 된 대사 산물 추출0.02 mL을 주입한다.
   주의: HPLC 시스템은 C18 컬럼(50 x 4.6mm)을 사용합니다. 입자 크기 5 μm; 25°C에서 작동) 뉴클레오시드 분리를 위한 이동상 A 및 B1(도1A)로완충하고 핵조류 분리를 위한 다공성 흑연 탄소(PGC) 컬럼(50 x 4.6mm, 입자 크기 5 μm; 25°C에서 작동)을 뉴클레오타이드 분리용 이동상 A 및 B2(도1B)로사용한다. 각 샘플은 기술 복제를 위해 세 번 주입되었다.
4. C18 열에 대한 표 1에 도시된 메서드와 PGC 열에 대한 표 2에 표시된 메서드를 프로그래밍합니다. 0.65mL min^-1의유량을 설정합니다.
   참고: 질량전환(표 3)은질량 분광계에 의해 모니터링되었다. 8개의 뉴클레오시드및 5개의 뉴클레오티드의 질량 스펙트럼 분석 조건은 표준화 및 변형된 것들을 포함하는 표 3에열거된다.
5. 모든 표적 화합물의 피크 영역을 기록합니다(그림1).

표준 교정 곡선 4세대

1. 풀 6 샘플 추출, 섹션 2의 설명에 따라 생산 된, 그리고 소용돌이. 그런 다음 각 배경을 얻기 위해 6 개의 추출 (동일한 볼륨)에 다시 알리쿼트합니다.
2. 각 표준의 6가지 농도를 각각 6개의 추출에 추가하고 다음 단계 3.3을 하나씩 주입합니다.
3. 3.4 단계 및 3.5 단계에 설명된 바와 같이 질량 전이를 통해 각 표준의 피크 영역을 다른 농도로 기록한다.
4. 각 표준의 명목 농도에 대해 피크 영역을 플롯하여 6점 곡선을 생성합니다.
   참고: 단계 3.5에 기록된 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 피크 영역은 표준 교정 곡선의 범위에 속한다.
5. 각 표준 화합물에 대해 직선 방정식을 계산합니다: Y = aX + b

5 대사 산물의 정량화

1. 3.5단계에서 기록된 피크 영역과 4.5단계에서의 방정식을 사용하여 대사 산물의 내용을 계산합니다.

결과

여기서, 우리는 2주 된 아라비도시스 야생 형 (Col-0) 모종에서 알려진 수정 된 뉴클레오시드 인 N¹-메틸라데로신의 식별 및 정량화를 예로 들 수 있습니다. 질량 분석 프로파일은 N 1-메틸라데로신 표준으로부터 생성된 제품 이온이 150m/z 및 133m/z(도2A)이며동일한 프로파일도 Col-0 추출(도2B)에서관찰된다는 것을 나타?...

토론

유기체는 정경및 비정상적인 것들을 포함하는 각종 뉴클레오시드/뉴클레오티드를 포함합니다. 그러나, 그(것)들의 기원 그리고 신진 대사 끝점, 특히 수정된 뉴클레오시드는 아직도 모호합니다. 더욱이, 뉴클레오시드/뉴클레오티드 대사의 기능및 항상성에 대한 현재의 이해는 탐구되고 확장되어야 한다. 이를 조사하기 위해서는 이러한 대사 산물 식별 및 정량화를 위한 정밀하고 금본적인 방법?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
acetonitrile	Sigma-Aldrich	1000291000
adenosine	Sigma-Aldrich	A9251-1G
ammonium acetate	Sigma-Aldrich	73594-100G-F
AMP	Sigma-Aldrich	01930-5G
CMP	Sigma-Aldrich	C1006-500MG
cytidine	Sigma-Aldrich	C122106-1G
GMP	Sigma-Aldrich	G8377-500MG
guanosine	Sigma-Aldrich	G6752-1G
Hypercarb column	Thermo Fisher Scientific GmbH	35005-054630
IMP	Sigma-Aldrich	57510-5G
inosine	Sigma-Aldrich	I4125-1G
methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
N1-methyladenosine	Carbosynth	NM03697
O6-methylguanosine	Carbosynth	NM02922
Murashige and Skoog Medium	Duchefa Biochemie	M0255.005
Polaris 5 C18A column	Agilent Technologies	A2000050X046
pseudouridine	Carbosynth	NP11297
UMP	Sigma-Aldrich	U6375-1G
uridine	Sigma-Aldrich	U3750-1G