JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שיטה מדויקת הניתנת לשחזור לכימות נוקלאוזידים/נוקלאוטידים בצמחים מתוארת כאן. שיטה זו משתמשת ב- HPLC-MS/MS.

Abstract

נוקלאוזידים/נוקלאוטידים הם אבני בניין של חומצות גרעין, חלקים של cosubstrates וקואנזימים, מולקולות איתות תאים, נשאי אנרגיה, אשר מעורבים בפעילויות תאים רבות. כאן, אנו מתארים שיטה מהירה ואמינה להסמכה מוחלטת של תכולת נוקליאוסיד/נוקלאוטידים בצמחים. בקצרה, 100 מ"ג של חומר צמחי הומוגני הוצא עם 1 מ"ל של חיץ מיצוי (מתנול, אצטוניטריל, ומים ביחס של 2:2:1). מאוחר יותר, המדגם התרכז חמש פעמים במייבש הקפאה ולאחר מכן הוזרק לתוך HPLC-MS / MS. נוקלאוטידים הופרדו על עמוד פחמן גרפי נקבובי (PGC) ונוקליאוסידים הופרדו בעמודה C18. המעברים ההמוניים של כל גרעין ונוקלאוטידים היו במעקב על ידי ספקטרומטריית מסה. התוכן של הנוקלאוזידים והנוקלאוטידים התכמת כנגד הסטנדרטים החיצוניים שלהם (ESTDs). לפיכך, בשיטה זו יכולים החוקרים לכמת בקלות נוקלאוזידים/נוקלאוטידים בצמחים שונים.

Introduction

נוקלאוזידים/נוקלאוטידים הם מרכיבים מטבוליים מרכזיים בכל האורגניזמים החיים, שהם סימנים מקדימים לחומצות גרעין וקואנזימים רבים, כגון ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד (NAD), וחשובים בסינתזה של מקרומולקולטים כגון פוספוליפידים, גליקוליפידים ופוליסכרידים. מבחינה מבנית, נוקליאוסיד מכיל גרעין, אשר יכול להיות אדנין, גואנין, uracil, ציטוצין, או תימינה, ו moiety סוכר, אשר יכול להיות ריבוז או deoxyribose1,2. נוקלאוטידים יש עד שלוש קבוצות פוספט מחייב את המיקום 5 פחמן של moiety הסוכר של נוקלאוזידים3. חילוף החומרים של נוקלאוטידים בצמחים חיוני לנביטת זרעים וצמיחת עלים4,5,6. כדי להבין טוב יותר את תפקידם הפיזיולוגי בהתפתחות הצמח, יש לקבוע את השיטות לכימות מוחלט של נוקלאוזידים/נוקלאוטידים שונים ב- vivo.

אחת הגישות הנפוצות ביותר למדידת נוקלאוזידים /נוקלאוטידים מעסיקה כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) בשילוב עם גלאי אולטרה סגול גלוי (UV-VIS)4,7,8,9,10,11. בשנת 2013, באמצעות HPLC, Dahncke ו- Witte כימתו מספר סוגים של גרעינים ב- Arabidopsis thaliana7. הם זיהו תכולת גואנוסין משופרת במוטנט החדרת T-DNA מיקוד בגן deaminase guanosine בהשוואה לצמח מסוג בר. נוקלאוזיד פירמידין נוסף, ציטידין, זוהה גם הוא כמותית בצמחים המשתמשים בשיטה זו, מה שהביא לזיהוי של גן דימינאז ציטידין בתום לב 4. בהתבסס על גלאי UV, שיטה זו, עם זאת, לא יכול להבחין בקלות את הגרעינים אשר יש ספקטרום דומה וזמני שמירה, למשל, גואנוסין או קסנטוסין. מגבלת הגילוי של שיטת HPLC היא גבוהה יחסית, ולכן, הוא משמש לעתים קרובות למדידת תוכן גבוה של נוקלאוזידים ב vivo, כגון ציטידין, uridine, ו guanosine.

בנוסף, כרומטוגרפיה גז בשילוב ספקטרומטריית מסה (GC-MS) יכול לשמש גם במדידת נוקליאוסיד. מרוויח מזה, האק et. AL. זוהה בהצלחה uridine וחומצת שתן, שהוא מטבוליט במורד הזרם של מסלול קטבולי נוקליאוסיד, בזרעים של A. thaliana12. עם זאת, GC משמש בדרך כלל כדי להפריד תרכובות נדיפות אבל לא מתאים לחומרים labile תרמית. לכן, כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) היא כנראה טכניקה אנליטית מתאימה ומדויקת יותר לזיהוי, הפרדה וכימות של הנוקלאוזידים / נוקלאוטידים13,14. מספר מחקרים קודמים דיווחו כי עמודת HILIC יכולה לשמש עבור נוקלאוזידים ונוקלאוטידיםהפרדת 15,16 ו איסוטופי שכותרתו סטנדרטים פנימיים הועסקו עבור כימות מורכב17. עם זאת, שני הרכיבים יקרים יחסית, במיוחד הסטנדרטים המסחריים עם תווית איזוטופ. כאן, אנו מדווחים על גישה רלוונטית מבחינה כלכלית LC-MS / MS למדידת נוקלאוזידים / נוקלאוטידים. שיטה זו כבר שימשה בהצלחה לכימות של נוקלאוזידים / נוקלאוטידים מגוונים, כולל ATP, N6- מתיל-AMP, AMP, GMP, uridine, ציטידין, פסאודורידין1,5,6,18, בצמחים ו Drosophila. יתר על כן, השיטה שאנו מדווחים כאן ניתן להשתמש אורגניזמים אחרים גם כן.

Protocol

1 גידול צמחים ואיסוף חומרים

  1. ודא כי זרעי Arabidopsis מעוקרים ב 70% אתנול במשך 10 דקות וזרעו על צלחות אגר, אשר הוכנו עם חצי כוח Murashige וחומרים מזינים Skoog.
  2. דגירה הצלחות המכילות זרעי Arabidopsis תחת כהה ב 4 °C (60 °F) עבור 48 שעות, ולאחר מכן להעביר אותם לתוך תא צמיחה מבוקר תחת 16 שעות אור של 55 μmol m-2 s-1 ב 22 °C (60 °F) ו 8 שעות כהה ב 20 °C (60 °F).
  3. קציר 100 מ"ג של שתילים 2 שבועות (משקל טרי) להקפיא חנקן נוזלי עבור מיצוי מטבוליטים.
    התראה: החוקרים צריכים ללבוש כראוי כפפות, משקפי מגן, וחלוק מעבדה כדי למנוע זיהום רקמת אדם במהלך איסוף החומרים.

2 נוקלאוזידים/מיצוי נוקלאוטידים

  1. קרקע 100 מ"ג של רקמות צמחיות קפואות עם 7-8 חרוזי פלדה בטחנת מיקסר טרום קר במשך 5 דקות בתדר של 60 הרץ.
  2. הכן את פתרון החילוץ, המכיל מתנול, אצטוניטריל ומים ביחס של 2:2:1.
  3. Resuspend החומרים הומוגניים (כולל רוב מטבוליטים אבל לא חלבונים) עם 1 מ"ל של פתרון מיצוי.
  4. צנטריפוגה הפתרון וכתוצאה מכך ב 12,000 x g במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. להעביר 0.5 מ"ל של ההשעיה לצינור חדש 1.5 מ"ל להקפיא את החנקן הנוזלי.
  6. לאדות את המדגם הקפוא במייבש להקפיא resuspend ב 0.1 מ"ל של 5% אצטוניטריל ו 95% מים.
  7. צנטריפוגה הפתרון וכתוצאה מכך (0.1 מ"ל) ב 40,000 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. טען את ה- supernatant בבקבוקון למדידת LC-MS/MS.

מדידת LC-MS/MS

  1. הכן חיץ אמוניום אצטט 10 מ"מ על ידי המסת 1.1 גרם של אמוניום אצטט ב 2 L של מים כפולים deionized (שלב נייד A). כוונן את ה- pH ל- 9.5 על-ידי 10% אמוניום וחומצת אצטט.
  2. הכן 2 L של מתנול 100% אולטרה-דק (שלב נייד B1) למדידת נוקלאוזידים. כמו כן, הכן 2 L של אצטוניטריל אולטרה-סגול 100% (שלב נייד B2) למדידת נוקלאוטידים.
  3. הזרק 0.02 מ"ל של מיצוי מטבוליטים שטופלו מראש של כל דגימה משלב 2.7 למערכת HPLC עם משאבות בינאריות (LC) בשילוב עם ספקטרומטר מסה מרובע משולש (MS).
    התראה: מערכת HPLC משתמשת בעמודת C18 (50 x 4.6 מ"מ, גודל חלקיקים 5 מיקרומטר; עבודה ב-25 °C (25 °C) אגירה עם שלב נייד A ו- B1 (איור 1A) להפרדת נוקלאוזידים ולהשתמש בעמודת פחמן גרפיטי נקבובי (PGC) (50 x 4.6 מ"מ, גודל חלקיקים 5 מיקרומטר; עבודה ב 25 °C (70 °F) עם שלב נייד A ו- B2 (איור 1B) עבור הפרדה גרעינית. כל דגימה הוזרקה שלוש פעמים עבור השכפול הטכני.
  4. תכנן את השיטה כפי שמוצג בטבלה 1 עבור העמודה C18 ואת השיטה כפי שמוצג בטבלה 2 עבור העמודה PGC. הגדר קצב זרימה של 0.65 מ"ל מינימום-1.
    הערה: המעברים ההמוניים (טבלה 3) היו במעקב על ידי ספקטרומטר מסה. תנאי ניתוח ספקטרום המסה של שמונה נוקלאוזידים וחמישה נוקלאוטידים המכילים נוקלאוטידים קנוניים ונודים רשומים בטבלה 3.
  5. רשום את אזורי השיא של כל מתחם יעד (איור 1).

4 דורות של עקומות הכיול הסטנדרטיות

  1. בריכה שש עקירות מדגם יחד, אשר יוצרו בעקבות התיאור בסעיף 2, ומערבולת אותו. לאחר מכן, aliquot אותו לשש עקירות (אותו נפח) שוב כדי לקבל כל רקע.
  2. הוסף שישה ריכוזים שונים של כל תקן אלה שש עקירות, בהתאמה, ולהזריק להם אחד אחד הבא שלב 3.3.
  3. רשום את אזורי השיא של כל תקן בריכוזים שונים באמצעות המעברים ההמוניים כמתואר בשלבים 3.4 ו- 3.5.
  4. התווה את אזור השיא כנגד הריכוז הנומינלי של כל תקן כדי ליצור עקומה של שש נקודות.
    הערה: אזורי השיא של נוקלאוזידים/נוקלאוטידים שנרשמו בשלב 3.5 צריכים ליפול בטווח של עקומות כיול סטנדרטיות.
  5. חישוב המשוואה של קו ישר עבור כל תרכובת סטנדרטית: Y = aX + b

5 כימות מטבוליטים

  1. חשב את תכולת המטבוליטים באמצעות אזור השיא שנרשם בשלב 3.5 והמשוואה משלב 4.5.

תוצאות

כאן, אנו מראים את הזיהוי וכימות של N1- מתילאדנוזין, נוקליאוסיד שונה ידוע, בסוג פראי Arabidopsis בן שבועיים (Col-0) שתילים כדוגמה. פרופיל ספקטרומטריית מסה מציין כי יוני המוצר הנוצרים מתקן N1-methyladenosine הם 150 m/z ו- 133 m/z (איור 2A),ואותו פרופיל נצפה גם בחילוץ Col...

Discussion

אורגניזמים מכילים נוקלאוזידים/נוקלאוטידים שונים, כולל נוקלאוטידים קנוניים וחורגים. עם זאת, נקודות הקצה של המקור והמטבוליות שלהם, במיוחד נוקלאוזידים ששונו, עדיין מעורפלים. יתר על כן, ההבנה הנוכחית של הפונקציה ואת הומאוסטזיס של חילוף החומרים נוקלאוזידים / נוקלאוטידים להישאר לחקור ולהרחיב....

Disclosures

המחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה כספית על ידי קרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (KJQN202060), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31900907), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'יאנגסו (BK20190528), המרכז הבינלאומי להנדסה גנטית וביוטכנולוגיה (CRP /CHN20-04_EC) ל- M.C., וקרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (LGZD202004) עד X.L.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
acetonitrileSigma-Aldrich1000291000
adenosineSigma-AldrichA9251-1G
ammonium acetateSigma-Aldrich73594-100G-F
AMPSigma-Aldrich01930-5G
CMPSigma-AldrichC1006-500MG
cytidineSigma-AldrichC122106-1G
GMPSigma-AldrichG8377-500MG
guanosineSigma-AldrichG6752-1G
Hypercarb columnThermo Fisher Scientific GmbH35005-054630
IMPSigma-Aldrich57510-5G
inosineSigma-AldrichI4125-1G
methanolSigma-Aldrich34860-1L-R
N1-methyladenosineCarbosynthNM03697
O6-methylguanosineCarbosynthNM02922
Murashige and Skoog MediumDuchefa BiochemieM0255.005
Polaris 5 C18A columnAgilent TechnologiesA2000050X046
pseudouridineCarbosynthNP11297
UMPSigma-AldrichU6375-1G
uridineSigma-AldrichU3750-1G

References

  1. Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -. P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
  2. Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
  3. Witte, C. -. P., Herde, M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).
  4. Chen, M., Herde, M., Witte, C. -. P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
  5. Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
  6. Chen, M., Witte, C. -. P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
  7. Dahncke, K., Witte, C. -. P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
  8. Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
  9. Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
  10. Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
  11. Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
  12. Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
  13. Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
  14. Zong, S. -. Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
  15. Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
  16. Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
  17. Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
  18. Baccolini, C., Witte, C. -. P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168HPLC MS MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved