Pflanzenprobenvorbereitung zur Messung des Nukleosid-/Nukleotidgehalts mit EINER HPLC-MS/MS

Zusammenfassung

Eine präzise und reproduzierbare Methode zur in vivo Nukleoside/Nukleotidquantifizierung in Pflanzen wird hier beschrieben. Diese Methode verwendet eine HPLC-MS/MS.

Zusammenfassung

Nukleoside/Nukleotide sind Bausteine von Nukleinsäuren, Teilen von Cosubstraten und Coenzymen, Zellsignalmolekülen und Energieträgern, die an vielen Zellaktivitäten beteiligt sind. Hier beschreiben wir eine schnelle und zuverlässige Methode zur absoluten Qualifizierung von Nukleosid-/Nukleotidgehalten in Pflanzen. Kurz gesagt, 100 mg homogenisiertes Pflanzenmaterial wurden mit 1 ml Extraktionspuffer (Methanol, Acetonitril und Wasser im Verhältnis 2:2:1) extrahiert. Später wurde die Probe fünfmal in einem Gefriertrockner konzentriert und dann in eine HPLC-MS/MS injiziert. Nukleotide wurden auf einer porösen Graphitkohlenstoffsäule (PGC) und Nukleoside auf einer C18-Säule getrennt. Die Massenübergänge jedes Nukleosids und Nukleotids wurden massenspektrometisch überwacht. Die Gehalte der Nukleoside und Nukleotide wurden anhand ihrer externen Standards (ESTDs) quantifiziert. Mit dieser Methode können Forscher daher Nukleoside/Nukleotide in verschiedenen Pflanzen leicht quantifizieren.

Einleitung

Nukleoside/ Nukleotide sind zentrale Stoffwechselkomponenten in allen lebenden Organismen, die die Vorläufer für Nukleinsäuren und viele Coenzyme wie Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) sind und wichtig für die Synthese von Makromolekülen wie Phospholipiden, Glykolipiden und Polysacchariden sind. Strukturell enthält Nukleosid eine Nukleobase, die ein Adenin, Guanin, Uracil, Cytosin oder Thymin sein kann, und einen Zuckerteil, der eine Ribose oder eine Desoxyribose^1,2sein kann. Nukleotide haben bis zu drei Phosphatgruppen, die an die 5-Kohlenstoff-Position des Zuckerteils der Nukleoside^{binden 3}. Der Stoffwechsel von Nukleotiden in Pflanzen ist essentiell für die Samenkeimung und das Blattwachstum^4,5,6. Um ihre physiologische Rolle in der Pflanzenentwicklung besser zu verstehen, sollten die Methoden zur absoluten Quantifizierung verschiedener Nukleoside/Nukleotide in vivo etabliert werden.

Einer der am häufigsten verwendeten Ansätze zur Messung von Nukleosiden/ Nukleotiden verwendet eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) in Verbindung mit einem ultraviolett-sichtbaren (UV-VIS)^{Detektor 4,7,8,9,10,11}. Im Jahr 2013 quantifizierten Dahncke und Witte mit HPLC verschiedene Arten der Nukleoside in Arabidopsis thaliana⁷. Sie identifizierten einen erhöhten Guanosingehalt in einer T-DNA-Insertionsmutante, die auf das Guanosin-Deaminase-Gen abzielt, verglichen mit der Wildtyppflanze. Ein weiteres Pyrimidinnukleosid, Cytidin, wurde ebenfalls quantitativ in Pflanzen nachgewiesen, die diese Methode anwenden, was zur Identifizierung eines echten Cytidin-Deaminase-Gens⁴führte. Basierend auf dem UV-Detektor kann diese Methode jedoch nicht leicht die Nukleoside unterscheiden, die ähnliche Spektren und Retentionszeiten aufweisen, z. B. Guanosin oder Xanthosin. Die Nachweisgrenze der HPLC-Methode ist relativ hoch, daher wird sie häufig für die Messung eines hohen Gehalts an Nukleosiden in vivo wie Cytidin, Uridin und Guanosin verwendet.

Darüber hinaus kann die gaschromatographische gekoppelte Massenspektrometrie (GC-MS) auch in der Nukleosidmessung eingesetzt werden. Davon profitieren Hauck et. al. erfolgreich Uridin und Harnsäure, die ein nachgeschalteter Metabolit des Nukleosid-Katabolweges ist, in den Samen von A. thaliana¹²nachgewiesen wurden. GC wird jedoch normalerweise zur Trennung flüchtiger Verbindungen verwendet, ist jedoch nicht für die thermisch labilen Substanzen geeignet. Daher ist eine mit der Massenspektrometrie gekoppelte Flüssigkeitschromatographie (LC-MS/MS) wahrscheinlich eine geeignetere und genauere Analysetechnik zur In-vivo-Identifizierung, Trennung und Quantifizierung der Nukleoside/Nukleotide^13,14. Mehrere frühere Studien berichteten, dass eine HILIC-Säule für Nukleoside und Nukleotide-Trennung^15,16 verwendet werden kann und isotopisch markierte interne Standards für die Compound-Quantifizierung¹⁷verwendet wurden. Beide Komponenten sind jedoch relativ teuer, insbesondere die kommerziellen isotopenmarkierten Standards. Hier berichten wir über einen wirtschaftlich anwendbaren LC-MS/MS-Ansatz zur Nukleoside/Nukleotid-Messung. Diese Methode wurde bereits erfolgreich zur Quantifizierung verschiedener Nukleoside/Nukleotide, einschließlich ATP, N6-Methyl-AMP, AMP, GMP, Uridin, Cytidin und Pseudouridin¹, 5^,6,18, in Pflanzen und Drosophilaeingesetzt. Darüber hinaus kann die Methode, über die wir hier berichten, auch in anderen Organismen angewendet werden.

Protokoll

1 Pflanzenwachstum und Materialsammlung

1. Stellen Sie sicher, dass Arabidopsis-Samen für 10 Minuten in 70% Ethanol sterilisiert und auf die Agarplatten gesät werden, die mit halbstarken Murashige- und Skoog-Nährstoffen zubereitet wurden.
2. Die Platten, die Arabidopsis-Samen enthalten, werden 48 h lang unter Dunkel bei 4 °C inkubiert und dann in eine kontrollierte Wachstumskammer unter 16 h Licht von 55 μmol^m-2 s^-1 bei 22 °C und 8 h dunkel bei 20 °C überführen.
3. Ernten Sie 100 mg 2-wöchige Sämlinge (Frischgewicht) und frieren Sie in flüssigem Stickstoff für die Metabolitenextraktion ein.
   VORSICHT: Forscher sollten handschuhe, schutzbrillen und einen Laborkittel angemessen tragen, um die Kontamination des menschlichen Gewebes während der Materialsammlung zu vermeiden.

2 Nukleoside/Nukleotidextraktion

1. 100 mg gefrorenes Pflanzengewebe mit 7-8 Stahlperlen in einer vorkalten Mischermühle für 5 min bei einer Frequenz von 60 Hz gemahlen.
2. Bereiten Sie die Extraktionslösung vor, die Methanol, Acetonitril und Wasser im Verhältnis 2:2:1 enthält.
3. Die homogenisierten Materialien (einschließlich der meisten Metaboliten, aber nicht der Proteine) werden mit 1 ml Extraktionslösung resuspendiert.
4. Zentrifugieren Sie die resultierende Lösung bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C.
5. 0,5 ml der Suspension in ein neues 1,5 ml Röhrchen geben und im flüssigen Stickstoff einfrieren.
6. Die gefrorene Probe in einem Gefrierfärber verdampfen und in 0,1 ml 5% Acetonitril und 95% Wasser wieder auffüllen.
7. Zentrifugieren Sie die resultierende Lösung (0,1 ml) bei 40.000 x g für 10 min bei 4 °C. Laden Sie den Überstand zur LC-MS/MS-Messung in eine Durchstechflasche.

3 LC-MS/MS Messung

1. Bereiten Sie einen 10 mM Ammoniumacetatpuffer vor, indem Sie 1,1 g Ammoniumacetat in 2 L doppelt deionisiertem Wasser (mobile Phase A) auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 9,5 x 10% Ammonium- und Acetatsäure ein.
2. Bereiten Sie 2 L hochreines 100% Methanol (mobile Phase B1) für die Nukleosidemessung vor. Bereiten Sie auch 2 L hochreines 100% Acetonitril (Mobile Phase B2) für die Nukleotidmessung vor.
3. Injizieren Sie 0,02 ml vorbehandelte Metabolitenextraktion jeder Probe aus Schritt 2.7 in ein HPLC-System mit Binärenpumpen (LC) in Verbindung mit einem Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer (MS).
   ACHTUNG: Das HPLC-System verwendet eine C18-Säule (50 x 4,6 mm, Partikelgröße 5 μm; arbeitet bei 25 °C) Pufferung mit mobiler Phase A und B1 (Abbildung 1A) für die Nukleosidentrennung und verwendet eine poröse Graphitkohlenstoffsäule (PGC) (50 x 4,6 mm, Partikelgröße 5 μm; arbeitet bei 25 °C) mit mobiler Phase A und B2 (Abbildung 1B) für die Nukleotidabscheidung. Jede Probe wurde dreimal für die technische Replikation injiziert.
4. Programmieren Sie die Methode wie in Tabelle 1 für die Spalte C18 und die Methode wie in Tabelle 2 für die SPALTE PGC dargestellt. Stellen Sie eine Durchflussrate von 0,65 mL min^{-1 ein.}
   HINWEIS: Die Massenübergänge (Tabelle 3) wurden mit einem Massenspektrometer überwacht. Die Massenspektrumanalysebedingungen von acht Nukleotiden und fünf Nukleotiden, die kanonische und modifizierte Nukleoside enthalten, sind in Tabelle 3aufgeführt.
5. Erfassen Sie die Spitzenbereiche jeder Zielverbindung (Abbildung 1).

4 Generierung der Standard-Kalibrierkurven

1. Sechs Probenextraktionen, die nach der Beschreibung in Abschnitt 2 hergestellt wurden, bündeln und vortexieren. Dann aliquot es wieder auf sechs Extraktionen (gleiches Volumen), um jeden Hintergrund zu erhalten.
2. Fügen Sie diesen sechs Extraktionen jeweils sechs verschiedene Konzentrationen jedes Standards hinzu und injizieren Sie sie nach Schritt 3.3 nacheinander.
3. Erfassen Sie die Spitzenbereiche jedes Standards in unterschiedlichen Konzentrationen über die Massenübergänge, wie in den Schritten 3.4 und 3.5 beschrieben.
4. Zeichnen Sie die Peakfläche gegen die Nominalkonzentration jedes Standards auf, um eine Sechs-Punkte-Kurve zu erzeugen.
   HINWEIS: Die in Schritt 3.5 erfassten Spitzenbereiche von Nukleosiden/Nukleotiden sollten in den Bereich der Standardkalibrierungskurven fallen.
5. Berechnen Sie die Gleichung einer geraden Linie für jede Standardverbindung: Y = aX + b

5 Quantifizierung der Metaboliten

1. Berechnen Sie den Inhalt der Metaboliten anhand der in Schritt 3.5 aufgezeichneten Peakfläche und der Gleichung aus Schritt 4.5.

Ergebnisse

Hier zeigen wir beispielsweise die Identifizierungund Quantifizierung von N1-Methyladenosin, einem bekannten modifizierten Nukleosid, in 2 Wochen alten Arabidopsis Wildtyp -Sämlingen (Col-0). Das Massenspektrometrieprofil zeigt an, dass dieaus dem N1-Methyladenosin-Standard erzeugten Produktionen 150 m/z und 133 m/z betragen (Abbildung 2A), und das gleiche Profil wird auch bei der Col-0-Extraktion beobachtet (

Diskussion

Organismen enthalten verschiedene Nukleoside/ Nukleotide, einschließlich kanonischer und abweichender. Der Ursprung und die metabolischen Endpunkte von ihnen, insbesondere modifizierte Nukleoside, sind jedoch noch unklar. Darüber hinaus muss das aktuelle Verständnis der Funktion und Homöostase des Nukleoside/Nukleotidstoffwechsels noch erforscht und erweitert werden. Um sie zu untersuchen, muss eine präzise und goldstandardhafte Methode zur Identifizierung und Quantifizierung dieser Metaboliten eingesetzt werden. Hi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
acetonitrile	Sigma-Aldrich	1000291000
adenosine	Sigma-Aldrich	A9251-1G
ammonium acetate	Sigma-Aldrich	73594-100G-F
AMP	Sigma-Aldrich	01930-5G
CMP	Sigma-Aldrich	C1006-500MG
cytidine	Sigma-Aldrich	C122106-1G
GMP	Sigma-Aldrich	G8377-500MG
guanosine	Sigma-Aldrich	G6752-1G
Hypercarb column	Thermo Fisher Scientific GmbH	35005-054630
IMP	Sigma-Aldrich	57510-5G
inosine	Sigma-Aldrich	I4125-1G
methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
N1-methyladenosine	Carbosynth	NM03697
O6-methylguanosine	Carbosynth	NM02922
Murashige and Skoog Medium	Duchefa Biochemie	M0255.005
Polaris 5 C18A column	Agilent Technologies	A2000050X046
pseudouridine	Carbosynth	NP11297
UMP	Sigma-Aldrich	U6375-1G
uridine	Sigma-Aldrich	U3750-1G