Заводская пробоподготовка для измерения содержания нуклеозидов/нуклеотидов с помощью ВЭЖХ-MS/MS

Резюме

Здесь описан точный и воспроизводимый метод количественного определения in vivo нуклеозидов/нуклеотидов в растениях. Этот метод использует ВЭЖХ-МС/МС.

Аннотация

Нуклеозиды / нуклеотиды являются строительными блоками нуклеиновых кислот, частей косубстратов и коферментов, клеточных сигнальных молекул и энергоносителей, которые участвуют во многих клеточных действиях. Здесь мы описываем быстрый и надежный метод абсолютной квалификации содержания нуклеозидов/нуклеотидов в растениях. Вкратце, 100 мг гомогенизированного растительного материала экстрагировали с помощью 1 мл экстракционного буфера (метанол, ацетонитрил и вода в соотношении 2:2:1). Позже образец концентрировали пять раз в сублимационной сушилке, а затем вводили в ВЭЖХ-MS/MS. Нуклеотиды отделяли на пористой графитовой углеродной (PGC) колонке, а нуклеозиды отделяли на колонке C18. Массовые переходы каждого нуклеозида и нуклеотида контролировались масс-спектрометрией. Содержание нуклеозидов и нуклеотидов было количественно определено в сопоставлении с их внешними стандартами (ESTD). Поэтому, используя этот метод, исследователи могут легко количественно оценить нуклеозиды / нуклеотиды в разных растениях.

Введение

Нуклеозиды / нуклеотиды являются центральными метаболическими компонентами во всех живых организмах, которые являются предшественниками нуклеиновых кислот и многих коферментов, таких как никотинамидадениндинуклеотид (NAD), и важны в синтезе макромолекул, таких как фосфолипиды, гликолипиды и полисахариды. Структурно нуклеозид содержит нуклеоосно, которое может быть аденином, гуанином, урацилом, цитозином или тимином, и сахарный мутик, который может представлять собой рибозу или дезоксирибозу^1,2. Нуклеотиды имеют до трех фосфатных групп, связывающихся с 5-углеродным положением сахарного муля нуклеозидов^3. Метаболизм нуклеотидов в растениях необходим для прорастания семян и роста листьев^4,5,6. Чтобы лучше понять их физиологическую роль в развитии растений, следует установить методы абсолютной количественной оценки различных нуклеозидов/нуклеотидов in vivo.

Один из наиболее часто используемых подходов к измерению нуклеозидов /нуклеотидов использует высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) в сочетании с ультрафиолетовым (UV-VIS) детектором^{4,7,8,9,10,11.} В 2013 году, используя ВЭЖХ, Данке и Витте количественно оценили несколько типов нуклеозидов в Arabidopsis thaliana^7. Они идентифицировали повышенное содержание гуанозина в мутанте, нацеленном на вставку Т-ДНК в гене гуанозиндезаминазы по сравнению с растением дикого типа. Другой пиримидин нуклеозид, цитидин, также был количественно обнаружен в растениях, использующих этот метод, что привелок идентификации гена 4 добросовестной цитидиндеаминазы. Однако, основанный на УФ-детекторе, этот метод не может легко отличить нуклеозиды, которые имеют сходные спектры и время удержания, например, гуанозин или ксантозин. Предел обнаружения метода ВЭЖХ относительно высок, поэтому его часто используют для измерения высокого содержания нуклеозидов in vivo, таких как цитидин, уридин и гуанозин.

Кроме того, газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (GC-MS) также может быть использована в измерении нуклеозидов. Извлекая из этого выгоду, Хаук и др. al. успешно обнаружены уридин и мочевая кислота, которая является последующим метаболитом нуклеозидного катаболического пути, в семенах A. thaliana^12. Однако ГК обычно используется для разделения летучих соединений, но не подходит для термически лабильных веществ. Поэтому жидкостная хроматография, связанная с масс-спектрометрией (LC-MS/MS), вероятно, является более подходящим и точным аналитическим методом для идентификации, разделения и количественного определения нуклеозидов/нуклеотидов in vivo^13,14. В нескольких предыдущих исследованиях сообщалось, что колонка HILIC может быть использована для разделения нуклеозидов и нуклеотидов^15,16 и изотопно меченые внутренние стандарты были использованы для количественной оценки соединения^17. Тем не менее, оба компонента являются относительно дорогими, особенно коммерческие стандарты, маркированные изотопами. Здесь мы сообщаем об экономически применимом подходе LC-MS/MS для измерения нуклеозидов/нуклеотидов. Этот метод уже успешно используется для количественного определения различных нуклеозидов/нуклеотидов, включая АТФ,^{N6-метил-АМФ,}АМФ, GMP, уридин, цитидин и псевдоуридин^1,5,6,18,у растений и дрозофилы. Более того, метод, о который мы здесь сообщаем, может быть использован и в других организмах.

протокол

1 Рост растений и сбор материалов

1. Убедитесь, что семена Arabidopsis стерилизованы в 70% этаноле в течение 10 минут и посеяны на агаровых пластинах, которые были приготовлены из питательных веществ Мурашиге и Скуга половинной силы.
2. Инкубировать пластины, содержащие семена арабидопсиса, в темноте при 4 °C в течение 48 ч, а затем перенести их в контролируемую камеру роста при 16 ч при свете 55 мкмоль^{м-2 с-1} при 22 °C и 8 ч темной при 20 °C.
3. Соберите 100 мг 2-недельной рассады (свежий вес) и заморозьте в жидком азоте для экстракции метаболитов.
   ВНИМАНИЕ: Исследователи должны надлежащим образом носить перчатки, защитные очки и лабораторный халат, чтобы избежать загрязнения тканей человека во время сбора материалов.

2 Экстракция нуклеозидов/нуклеотидов

1. Измельчают 100 мг замороженных растительных тканей с 7-8 стальными шариками в предварительно холодном смесительном стане в течение 5 мин с частотой 60 Гц.
2. Готовят экстракционный раствор, который содержит метанол, ацетонитрил и воду в соотношении 2:2:1.
3. Повторное суспендирование гомогенизированных материалов (включая большинство метаболитов, но не белков) 1 мл экстракционного раствора.
4. Центрифугируют полученный раствор при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °С.
5. Переложите 0,5 мл суспензии в новую трубку объемом 1,5 мл и заморозьте в жидком азоте.
6. Выпарить замороженный образец в морозильных красителях и повторно суспендировать в 0,1 мл 5% ацетонитрила и 95% воды.
7. Центрифугируют полученный раствор (0,1 мл) при 40 000 х г в течение 10 мин при 4 °С. Загрузите супернатант во флакон для измерения LC-MS/MS.

3 измерения LC-MS/MS

1. Готовят буфер ацетата аммония 10 мМ, растворяя 1,1 г ацетата аммония в 2 л двойной деионизированной воды (подвижная фаза А). Отрегулируйте рН до 9,5 на 10% аммония и ацетатной кислоты.
2. Готовят 2 л сверхчистого 100% метанола (подвижная фаза В1) для измерения нуклеозидов. Кроме того, приготовьте 2 л сверхчистого 100% ацетонитрила (подвижная фаза B2) для измерения нуклеотидов.
3. Вводят 0,02 мл предварительно обработанного экстракции метаболитов каждого образца со этапа 2.7 в систему ВЭЖХ с бинарными насосами (LC) в сочетании с трехквадрупольных масс-спектрометром (MS).
   ВНИМАНИЕ: Система ВЭЖХ использует колонну C18 (50 x 4,6 мм, размер частиц 5 мкм; работает при 25 °C), буферизующую подвижной фазой A и B1(рисунок 1A)для разделения нуклеозидов и использует столб пористого графитового углерода (PGC) (50 x 4,6 мм, размер частиц 5 мкм; работает при 25 °C) с подвижной фазой A и B2(рисунок 1B)для разделения нуклеотидов. Каждый образец вводили три раза для технической репликации.
4. Запрограммировать метод, как показано в таблице 1 для столбца C18, и метод, как показано в таблице 2 для столбца PGC. Установите расход 0,65 мл^мин-1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Массовые переходы(таблица 3)контролировались масс-спектрометром. Условия анализа масс-спектра восьми нуклеозидов и пяти нуклеотидов, содержащих канонические и модифицированные, приведены в таблице 3.
5. Запишите пиковые области каждого целевого соединения(рисунок 1).

4 Генерация стандартных калибровочных кривых

1. Пул шесть образцов экстракции вместе, которые были получены в соответствии с описанием в разделе 2, и вихревые его. Затем снова переотсутите его на шесть извлечений (тот же объем), чтобы получить каждый фон.
2. Добавьте шесть различных концентраций каждого стандарта к этим шести экстракциям, соответственно, и вводите их одну за другой после шага 3.3.
3. Регистрируйте пиковые области каждого стандарта при различных концентрациях посредством переходов массы, как описано на этапах 3.4 и 3.5.
4. Постройте пиковую область по отношению к номинальной концентрации каждого стандарта, чтобы создать шеститочечную кривую.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пиковые области нуклеозидов/нуклеотидов, зарегистрированные на шаге 3.5, должны находиться в диапазоне стандартных калибровочных кривых.
5. Вычисление уравнения прямой для каждого стандартного соединения: Y = aX + b

5 Количественная оценка метаболитов

1. Рассчитайте содержание метаболитов, используя пиковую область, зарегистрированную на шаге 3.5, и уравнение из шага 4.5.

Результаты

Здесь мы показываем идентификацию и количественную оценку N1-метиладенозина, известного модифицированного нуклеозида, в 2-недельных саженцах дикого типа Arabidopsis (Col-0) в качестве примера. Профиль масс-спектрометрии указывает, что ионыпродукта, образующи?...

Обсуждение

Организмы содержат различные нуклеозиды/нуклеотиды, в том числе канонические и аберрантные. Однако происхождение и метаболические конечные точки их, особенно модифицированных нуклеозидов, все еще неясны. Кроме того, современное понимание функции и гомеостаза метаболизма нуклеозидов...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
acetonitrile	Sigma-Aldrich	1000291000
adenosine	Sigma-Aldrich	A9251-1G
ammonium acetate	Sigma-Aldrich	73594-100G-F
AMP	Sigma-Aldrich	01930-5G
CMP	Sigma-Aldrich	C1006-500MG
cytidine	Sigma-Aldrich	C122106-1G
GMP	Sigma-Aldrich	G8377-500MG
guanosine	Sigma-Aldrich	G6752-1G
Hypercarb column	Thermo Fisher Scientific GmbH	35005-054630
IMP	Sigma-Aldrich	57510-5G
inosine	Sigma-Aldrich	I4125-1G
methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
N1-methyladenosine	Carbosynth	NM03697
O6-methylguanosine	Carbosynth	NM02922
Murashige and Skoog Medium	Duchefa Biochemie	M0255.005
Polaris 5 C18A column	Agilent Technologies	A2000050X046
pseudouridine	Carbosynth	NP11297
UMP	Sigma-Aldrich	U6375-1G
uridine	Sigma-Aldrich	U3750-1G