使用 HPLC-MS/MS 进行核苷/核苷酸含量测量的工厂样品制备

摘要

此处描述了植物体内核苷酸/核苷酸定量的精确和可重复的方法。此方法采用 HPLC-MS/MS。

摘要

核苷酸/核苷酸是核酸、糖体和酶、细胞信号分子和能量载体的构建基块，它们参与许多细胞活动。在这里，我们描述了一种快速可靠的方法，在植物核苷酸/核苷酸含量的绝对资格。简言之，用1mL的萃取缓冲液（甲醇、乙酮三酯和水的比例为2:2:1）提取了100毫克的均质植物材料。后来，样品被浓缩在冷冻干燥机中五次，然后注射到HPLC-MS/MS中。 核苷酸在多孔的石墨碳（PGC）柱上分离，核苷酸在C18柱上分离。每个核苷酸和核苷酸的质量转换都由质谱法监测。核苷酸和核苷酸的内容是根据其外部标准（ESTD）进行量化的。因此，使用这种方法，研究人员可以很容易地量化不同植物中的核苷酸/核苷酸。

引言

核苷酸/核苷酸是所有生物体中的核心代谢成分，核酸和许多凝血素（如烟酰胺腺苷二聚氰胺）的前体，在磷脂、甘油脂和多糖等大分子的合成中非常重要。从结构上讲，核苷酸包含一个核碱基，它可以是腺苷、瓜宁、尿素、细胞氨酸或胸腺素，以及糖莫伊蒂，它可以是核糖或脱氧核糖酶^1，2。核苷酸有多达三个磷酸盐组结合到核苷酸³的糖雾的5碳位置。植物中核苷酸的新陈代谢对种子发芽和叶生长^{至关重要。}为了更好地了解它们在植物发育中的生理作用，应建立体内不同核苷酸/核苷酸的绝对定量方法。

测量核苷酸/核苷酸的最常用方法之一采用高性能液相色谱 （HPLC） 和紫外可见 （UV-VIS） 探测器 4、7、8、9、10、11。2013年，使用HPLC，达恩克和维特量化了几种类型的核苷酸在阿拉伯多普西萨利亚纳^7。与野生类植物相比，他们在瓜诺辛脱氨酶基因的T-DNA插入突变体中发现了增强的瓜诺辛含量。另一种丙酰胺核苷，环丙胺，也定量检测在植物使用这种方法，这导致鉴定一个真正的赛迪丁脱氨酶基因^4。然而，基于紫外线探测器，这种方法不能轻易区分具有相似光谱和保留时间的核苷，例如瓜诺辛或异种氨酸。HPLC方法的检测极限相对较高，因此，它常用于测量体内核苷含量高，如青氨酸、尿氨酸、瓜诺辛等。

此外，气相色谱与质谱学（GC-MS）相结合，也可用于核苷测量。受益于它，哈克等。在A.thaliana¹²的种子中成功检测出尿素和尿酸，这是核苷代谢通路的下游代谢物。然而，GC通常用于分离挥发性化合物，但不适合热阴唇物质。因此，液相色谱与质谱学（LC-MS/MS）相结合可能是一种更合适、更准确的分析技术，用于内在识别、分离和定量核苷酸/核苷酸^13、14。先前的几项研究报告说，HILIC列可用于核苷酸和核苷酸分离^15，16和同位素标记的内部标准被用于化合物定量^17。但是，这两个组件都相对昂贵，尤其是商业同位素标记标准。在这里，我们报告一种经济适用的LC-MS/MS方法，用于核苷酸/核苷酸测量。这种方法已经成功地用于不同核苷酸/核苷酸的量定量，包括ATP，N^6-甲基-AMP，AMP，GMP，尿丁，青氨酸，和伪尿素1，5，6，18，在植物和德罗索菲拉。此外，我们在这里报告的方法也可以用于其他生物体。

研究方案

1 植物生长和材料收集

1. 确保 阿拉伯多普西斯 种子在70%乙醇中消毒10分钟，并在用半强度的穆拉希格和Skoog营养物质制备的阿加板上播种。
2. 在 4 °C 的黑暗下孵育含有 阿拉伯多虫 种子的板，持续 48 小时，然后在 22 °C 和 8 h 20 °C 的 16 h 光下将其转移到受控生长室中， 55 微米^-2 s^-1 下。
3. 收获100毫克2周幼苗（新鲜重量），并冷冻在液氮中，用于代谢物提取。
   注意:研究人员应适当佩戴手套、防护眼镜和实验室外套，以避免材料收集过程中的人体组织污染。

2 核苷酸/核苷酸提取

1. 在冷前搅拌机磨坊中使用 7-8 个钢珠将 100 毫克冷冻植物组织磨碎 5 分钟，频率为 60 Hz。
2. 准备提取溶液，其中含有甲醇，乙酮三酯和水的比例为2:2:1。
3. 用1mL的提取溶液补充同质化材料（包括大多数代谢物，但不包括蛋白质）。
4. 在 4 °C 下，在 15 分钟内将由此产生的溶液以 12，000 x g 的速度离心。
5. 将悬浮液的0.5 mL转移到新的1.5mL管中，并冻结在液氮中。
6. 将冷冻样品蒸发在冷冻桶中，在 0.1 mL 中再喷出 5% 的甲基甲基三甲基和 95% 的水。
7. 在 40，000 x g 下，在 4°C 下 10 分钟内将由此产生的溶液 （0.1 mL） 离心。 将超自然物装在小瓶中，用于 LC-MS/MS 测量。

3 LC-MS/MS 测量

1. 通过在2升双离子水中溶解1.1克醋酸铵（移动A阶段），准备10m醋酸铵缓冲器。将pH到9.5调整10%的铵和醋酸。
2. 准备2升超纯100%甲醇（移动阶段B1）进行核苷测量。此外，准备2升超纯100%乙酰胺（移动阶段B2）用于核苷酸测量。
3. 将从步骤 2.7 中提取的每个样本的 0.02 mL 预处理代谢物注入带有二进制泵 （LC） 的 HPLC 系统，并配以三重四足质谱仪 （MS）。
   注意:HPLC 系统采用 C18 列（50 x 4.6 mm，颗粒大小 5 μm; 在 25 °C）缓冲与移动阶段 A 和 B1 （图 1A）为核苷分离，并使用多孔图形碳 （PGC） 列 （50 x 4.6 毫米， 粒子大小 5 μm; 工作在 25 °C） 与移动阶段 A 和 B2 （图 1B）为核苷酸分离.每个样本被注射三次用于技术复制。
4. 为 C18 列的表 1 中显示的方法以及 PGC 列 表 2 中显示的方法进行编程。设定0.65 mL^min-1的流量。
   注:质量转换（表3）由质谱仪监测。包含规范核苷酸和改性核苷酸的8个核苷酸和5个核苷酸的质量谱分析条件列在 表3中。
5. 记录每个目标化合物的峰值区域（图 1）。

4 代标准校准曲线

1. 将六个样本萃取汇集在一起，这些样本是按照第 2 节的描述产生的，并漩涡。然后，再次引用它到六个提取（相同的音量），以获得每个背景。
2. 分别在这六个提取物中加入六种不同浓度的每个标准，并在步骤 3.3 之后逐一注入。
3. 通过步骤 3.4 和 3.5 中描述的质量转换，以不同浓度记录每个标准的峰值区域。
4. 绘制峰值区域与每个标准的名义浓度，以生成六点曲线。
   注:步骤 3.5 中记录的核苷酸/核苷酸的峰值区域应落在标准校准曲线范围内。
5. 计算每个标准化合物的直线方程:Y =aX + b

5 代谢物的定量

1. 使用步骤 3.5 记录的峰值区域和步骤 4.5 中的方程计算代谢物的内容。

结果

在这里，我们展示了N¹-甲基叶氨酸的识别和定量，一种已知的改性核苷，在2周大的阿拉伯多 普西斯 野生类型（Col-0）幼苗为例。质谱剖面图表明，N¹-甲基甲基诺辛标准产生的产品离子为150m/z和133m/z（图2A），在Coll-0提取（图2B）中也观察到相同的轮廓。由于产品离子的丰度高达150米/z，因此选择282.1至150?...

讨论

生物体含有各种核苷酸/核苷酸，包括规范和异常核苷酸。然而，它们的起源和代谢端点，特别是经过修改的核苷酸，仍然模糊不清。此外，目前对核苷酸/核苷酸代谢功能和平衡的理解还有待探索和扩展。为了调查它们，需要采用精确和金标准的方法来识别和量化这些代谢物。在这里，我们描述了一个使用质量谱进行核苷酸/核苷酸检测的协议。以N¹-甲基甲基诺辛为例，该方法可检测低至0....

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
acetonitrile	Sigma-Aldrich	1000291000
adenosine	Sigma-Aldrich	A9251-1G
ammonium acetate	Sigma-Aldrich	73594-100G-F
AMP	Sigma-Aldrich	01930-5G
CMP	Sigma-Aldrich	C1006-500MG
cytidine	Sigma-Aldrich	C122106-1G
GMP	Sigma-Aldrich	G8377-500MG
guanosine	Sigma-Aldrich	G6752-1G
Hypercarb column	Thermo Fisher Scientific GmbH	35005-054630
IMP	Sigma-Aldrich	57510-5G
inosine	Sigma-Aldrich	I4125-1G
methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
N1-methyladenosine	Carbosynth	NM03697
O6-methylguanosine	Carbosynth	NM02922
Murashige and Skoog Medium	Duchefa Biochemie	M0255.005
Polaris 5 C18A column	Agilent Technologies	A2000050X046
pseudouridine	Carbosynth	NP11297
UMP	Sigma-Aldrich	U6375-1G
uridine	Sigma-Aldrich	U3750-1G