使用 HPLC-MS/MS 进行核苷/核苷酸含量测量的工厂样品制备

摘要

此处描述了植物体内核苷酸/核苷酸定量的精确和可重复的方法。此方法采用 HPLC-MS/MS。

摘要

核苷酸/核苷酸是核酸、糖体和酶、细胞信号分子和能量载体的构建基块，它们参与许多细胞活动。在这里，我们描述了一种快速可靠的方法，在植物核苷酸/核苷酸含量的绝对资格。简言之，用1mL的萃取缓冲液（甲醇、乙酮三酯和水的比例为2：2：1）提取了100毫克的均质植物材料。后来，样品被浓缩在冷冻干燥机中五次，然后注射到HPLC-MS/MS中。 核苷酸在多孔的石墨碳（PGC）柱上分离，核苷酸在C18柱上分离。每个核苷酸和核苷酸的质量转换都由质谱法监测。核苷酸和核苷酸的内容是根据其外部标准（ESTD）进行量化的。因此，使用这种方法，研究人员可以很容易地量化不同植物中的核苷酸/核苷酸。

引言

核苷酸/核苷酸是所有生物体中的核心代谢成分，核酸和许多凝血素（如烟酰胺腺苷二聚氰胺）的前体，在磷脂、甘油脂和多糖等大分子的合成中非常重要。从结构上讲，核苷酸包含一个核碱基，它可以是腺苷、瓜宁、尿素、细胞氨酸或胸腺素，以及糖莫伊蒂，它可以是核糖或脱氧核糖酶^1，2。核苷酸有多达三个磷酸盐组结合到核苷酸³的糖雾的5碳位置。植物中核苷酸的新陈代谢对种子发芽和叶生长^{至关重要。}为了更好地了解它们在植物发育中的生理作用，应建立体内不同核苷酸/核苷酸的绝对定量方法。

测量核苷酸/核苷酸的最常用方法之一采用高性能液相色谱 （HPLC） 和紫外可见 （UV-VIS） 探测器 4、7、8、9、10、11。<....

研究方案

1 植物生长和材料收集

1. 确保 阿拉伯多普西斯 种子在70%乙醇中消毒10分钟，并在用半强度的穆拉希格和Skoog营养物质制备的阿加板上播种。
2. 在 4 °C 的黑暗下孵育含有 阿拉伯多虫 种子的板，持续 48 小时，然后在 22 °C 和 8 h 20 °C 的 16 h 光下将其转移到受控生长室中， 55 微米^-2 s^-1 下。
3. 收获100毫克2周幼苗（新鲜重量），并冷冻在液氮中，用于代谢物提取。
   注意：研究人员应适当佩戴手套、防护眼镜和实验室外套，以避免材料收集过程中的人体组织污染。

2 核苷酸/核苷酸提取

1. 在冷前搅拌机磨坊中使用 7-8 个钢珠将 100 毫克冷冻植物组织磨碎 5 分钟，频率为 60 Hz。
2. 准备提取溶液，其中含有甲醇，乙酮三酯和水的比例为2：2：1。
3. 用1mL的提取溶液补充同质化材料（包括大多数代谢物，但不包括蛋白质）。
4. 在 4 °C 下，在 15 分钟内将由此产生的溶液以 12，000 x g 的速度离心。
5. 将悬浮液的0.5 mL转移到新的1.5mL管中，并冻结在液氮中。
6. 将冷冻样品蒸发在冷冻桶中，在 0.1 mL 中再喷出 5% 的甲基甲基三甲基和 95% 的....

结果

在这里，我们展示了N¹-甲基叶氨酸的识别和定量，一种已知的改性核苷，在2周大的阿拉伯多 普西斯 野生类型（Col-0）幼苗为例。质谱剖面图表明，N¹-甲基甲基诺辛标准产生的产品离子为150m/z和133m/z（图2A），在Coll-0提取（图2B）中也观察到相同的轮廓。由于产品离子的丰度高达150米/z，因此选择282.1至150?.......

讨论

生物体含有各种核苷酸/核苷酸，包括规范和异常核苷酸。然而，它们的起源和代谢端点，特别是经过修改的核苷酸，仍然模糊不清。此外，目前对核苷酸/核苷酸代谢功能和平衡的理解还有待探索和扩展。为了调查它们，需要采用精确和金标准的方法来识别和量化这些代谢物。在这里，我们描述了一个使用质量谱进行核苷酸/核苷酸检测的协议。以N¹-甲基甲基诺辛为例，该方法可检测低至0........

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
acetonitrile	Sigma-Aldrich	1000291000
adenosine	Sigma-Aldrich	A9251-1G
ammonium acetate	Sigma-Aldrich	73594-100G-F
AMP	Sigma-Aldrich	01930-5G
CMP	Sigma-Aldrich	C1006-500MG
cytidine	Sigma-Aldrich	C122106-1G
GMP	Sigma-Aldrich	G8377-500MG
guanosine	Sigma-Aldrich	G6752-1G
Hypercarb column	Thermo Fisher Scientific GmbH	35005-054630
IMP	Sigma-Aldrich	57510-5G
inosine	Sigma-Aldrich	I4125-1G
methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
N1-methyladenosine	Carbosynth	NM03697
O6-methylguanosine	Carbosynth	NM02922
Murashige and Skoog Medium	Duchefa Biochemie	M0255.005
Polaris 5 C18A column	Agilent Technologies	A2000050X046
pseudouridine	Carbosynth	NP11297
UMP	Sigma-Aldrich	U6375-1G
uridine	Sigma-Aldrich	U3750-1G