Préparation d’échantillons de plantes pour la mesure de la teneur en nucléosides/nucléotides avec une CLHP-MS/MS

Résumé

Une méthode précise et reproductible pour la quantification in vivo des nucléosides/nucléotides dans les plantes est décrite ici. Cette méthode utilise une CLHP-MS/MS.

Résumé

Les nucléosides/nucléotides sont des blocs de construction d’acides nucléiques, de parties de cosubstrates et de coenzymes, de molécules de signalisation cellulaire et de vecteurs d’énergie, qui sont impliqués dans de nombreuses activités cellulaires. Ici, nous décrivons une méthode rapide et fiable pour la qualification absolue des teneurs en nucléosides / nucléotides dans les plantes. En bref, 100 mg de matériel végétal homogénéisé ont été extraits avec 1 mL de tampon d’extraction (méthanol, acétonitrile et eau dans un rapport de 2:2:1). Plus tard, l’échantillon a été concentré cinq fois dans un lyophilisateur, puis injecté dans une CLHP-MS/MS. Les nucléotides ont été séparés sur une colonne poreuse de carbone graphitique (PGC) et les nucléosides ont été séparés sur une colonne C18. Les transitions de masse de chaque nucléoside et nucléotide ont été surveillées par spectrométrie de masse. Les teneurs des nucléosides et des nucléotides ont été quantifiées par rapport à leurs étalons externes (ESTD). En utilisant cette méthode, les chercheurs peuvent donc facilement quantifier les nucléosides / nucléotides dans différentes plantes.

Introduction

Les nucléosides/nucléotides sont des composants métaboliques centraux dans tous les organismes vivants, qui sont les précurseurs des acides nucléiques et de nombreux coenzymes, tels que le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), et importants dans la synthèse des macromolécules telles que les phospholipides, les glycolipides et les polysaccharides. Structurellement, le nucléoside contient une nucléobase, qui peut être une adénine, une guanine, un uracile, une cytosine ou une thymine, et une fraction sucrée, qui peut être un ribose ou un désoxyribose^1,2. Les nucléotides ont jusqu’à trois groupes phosphates se liant à la position 5-carbone de la fraction sucre des nucléosides^3. Le métabolisme des nucléotides chez les plantes est essentiel à la germination des graines et à la croissance des feuilles^4,5,6. Pour mieux comprendre leurs rôles physiologiques dans le développement des plantes, il convient d’établir les méthodes de quantification absolue des différents nucléosides/nucléotides in vivo.

L’une des approches les plus couramment utilisées pour mesurer les nucléosides/nucléotides utilise une chromatographie liquide haute performance (CLHP) couplée à un détecteur ultraviolet-visible (UV-VIS)^{4,7,8,9,10,11.} En 2013, à l’aide de la CLHP, Dahncke et Witte ont quantifié plusieurs types de nucléosides chez Arabidopsis thaliana⁷. Ils ont identifié une teneur améliorée en guanosine dans un mutant d’insertion d’ADN-T ciblant le gène de la guanosine désaminase par rapport à la plante de type sauvage. Un autre nucléoside de pyrimidine, la cytidine, a également été détecté quantitativement dans les plantes utilisant cette méthode, ce qui a entraîné l’identification d’un gène de la cytidine déaminase de bonne foi ^4. Basée sur le détecteur UV, cette méthode, cependant, ne peut pas facilement distinguer les nucléosides qui ont des spectres et des temps de rétention similaires, par exemple, la guanosine ou la xanthosine. La limite de détection de la méthode HPLC est relativement élevée, par conséquent, elle est fréquemment utilisée pour la mesure de la teneur élevée en nucléosides in vivo, tels que la cytidine, l’uridine et la guanosine.

En outre, la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) peut également être utilisée dans la mesure nucléosidique. En bénéficiant, Hauck et. al. a détecté avec succès l’uridine et l’acide urique, qui est un métabolite en aval de la voie catabolique nucléosidique, dans les graines de A. thaliana¹². Cependant, gc est normalement utilisé pour séparer les composés volatils, mais ne convient pas pour les substances thermolabiles. Par conséquent, une chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS) est probablement une technique d’analyse plus appropriée et plus précise pour l’identification in vivo, la séparation et la quantification des nucléosides/nucléotides^13,14. Plusieurs études antérieures ont rapporté qu’une colonne HILIC peut être utilisée pour la séparation des nucléosides et des nucléotides^15,16 et des étalons internes marqués isotopiquement ont été utilisés pour la quantification du composé^17. Cependant, les deux composants sont relativement coûteux, en particulier les normes commerciales étiquetées isotopiques. Ici, nous rapportons une approche LC-MS/MS économiquement applicable pour la mesure des nucléosides/nucléotides. Cette méthode a déjà été utilisée avec succès pour la quantification de divers nucléosides / nucléotides, y compris l’ATP, N6-méthyl-AMP, AMP, GMP, uridine, cytidine, et pseudouridine^1,5,6,18, dans les plantes et la drosophile. D’ailleurs, la méthode que nous rapportons ici peut être employée dans d’autres organizations aussi bien.

Protocole

1 Croissance des plantes et collecte des matériaux

1. Assurez-vous que les graines d’Arabidopsis sont stérilisées dans de l’éthanol à 70% pendant 10 min et semées sur les plaques de gélose, qui ont été préparées avec des nutriments Murashige et Skoog d’une demi-force.
2. Incuber les plaques contenant des graines d’Arabidopsis sous l’obscurité à 4 °C pendant 48 h, puis les transférer dans une chambre de croissance contrôlée sous une lumière de 16 h de 55 μmol m^-2 s^-1 à 22 °C et 8 h d’obscurité à 20 °C.
3. Récolter 100 mg de semis de 2 semaines (poids frais) et congeler dans de l’azote liquide pour l’extraction des métabolites.
   ATTENTION : Les chercheurs doivent porter de façon appropriée des gants, des lunettes de protection et un sarrau de laboratoire pour éviter la contamination des tissus humains pendant la collecte des matériaux.

2 Extraction des nucléosides/nucléotides

1. Broyez 100 mg de tissus végétaux congelés avec 7-8 billes d’acier dans un broyeur de mélangeur pré-froid pendant 5 min à une fréquence de 60 Hz.
2. Préparer la solution d’extraction, qui contient du méthanol, de l’acétonitrile et de l’eau dans un rapport de 2:2:1.
3. Ressusciter les matériaux homogénéisés (y compris la plupart des métabolites mais pas les protéines) avec 1 mL de solution d’extraction.
4. Centrifuger la solution obtenue à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
5. Transférer 0,5 mL de la suspension dans un nouveau tube de 1,5 mL et congeler dans l’azote liquide.
6. Évaporer l’échantillon congelé dans un tenoir de congélation et le ressusciter dans 0,1 mL d’acétonitrile à 5 % et à 95 % d’eau.
7. Centrifuger la solution obtenue (0,1 mL) à 40 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Chargez le surnageant dans un flacon pour la mesure LC-MS/MS.

3 mesure LC-MS/MS

1. Préparer un tampon acétate d’ammonium de 10 mM en dissolvant 1,1 g d’acétate d’ammonium dans 2 L d’eau double désionisée (phase mobile A). Ajuster le pH à 9,5 par 10% d’acide d’ammonium et d’acétate.
2. Préparer 2 L de méthanol ultrapure à 100% (phase mobile B1) pour la mesure des nucléosides. En outre, préparez 2 L d’acétonitrile ultrapur à 100% (phase mobile B2) pour la mesure des nucléotides.
3. Injecter 0,02 mL d’extraction de métabolites pré-traités de chaque échantillon de l’étape 2.7 dans un système HPLC avec des pompes binaires (LC) couplées à un spectromètre de masse triple quadripôle (MS).
   ATTENTION: Le système HPLC utilise une colonne C18 (50 x 4,6 mm, granulométrie 5 μm; fonctionnant à 25 °C) tamponnant avec les phases mobiles A et B1(figure 1A)pour la séparation des nucléosides et utilise une colonne poreuse de carbone graphitique (PGC) (50 x 4,6 mm, granulométrie 5 μm; travaillant à 25 °C) avec les phases mobiles A et B2(figure 1B)pour la séparation des nucléotides. Chaque échantillon a été injecté trois fois pour la réplication technique.
4. Programmez la méthode comme indiqué dans le tableau 1 pour la colonne C18 et la méthode comme indiqué dans le tableau 2 pour la colonne PGC. Régler un débit de 0,65 mL min^-1.
   NOTA : Les transitions de masse(tableau 3)ont été surveillées par spectromètre de masse. Les conditions d’analyse du spectre de masse de huit nucléosides et de cinq nucléotides contenant des nucléotides canoniques et modifiés sont énumérées dans le tableau 3.
5. Enregistrez les zones de crête de chaque composé cible (Figure 1).

4 Génération des courbes d’étalonnage étalon

1. Regroupez six extractions d’échantillons, qui ont été produites conformément à la description de la section 2, et vortexez-les. Ensuite, aliquotez-le à six extractions (même volume) à nouveau pour obtenir chaque arrière-plan.
2. Ajoutez six concentrations différentes de chaque étalon à ces six extractions, respectivement, et injectez-les une par une à l’étape 3.3.
3. Enregistrer les zones de crête de chaque étalon à différentes concentrations au moyen des transitions massiques décrites aux étapes 3.4 et 3.5.
4. Tracer la zone de pointe par rapport à la concentration nominale de chaque étalon pour générer une courbe à six points.
   NOTA : Les zones de crête des nucléosides/nucléotides enregistrées à l’étape 3.5 devraient se situer dans la plage des courbes d’étalonnage normalisées.
5. Calculer l’équation d’une ligne droite pour chaque composé étalon : Y = aX + b

5 Quantification des métabolites

1. Calculer le contenu des métabolites à l’aide de la zone de crête enregistrée à l’étape 3.5 et de l’équation de l’étape 4.5.

Résultats

Ici, nous montrons l’identification et la quantification de N 1-méthyladénosine, un nucléoside modifié connu, dans des semis de type sauvage Arabidopsis (Col-0) âgés de 2 semaines à titre d’exemple. Le profil de spectrométrie de masse indiqueque les ions produits générés à partir de l’étalon N1-méthyladénosine sont de 150 m/z et 133 m/z(figure 2A),et le même profil est également observé dans l’extractio...

Discussion

Les organismes contiennent divers nucléosides/nucléotides, y compris des nucléotides canoniques et aberrants. Cependant, l’origine et les paramètres métaboliques de ceux-ci, en particulier les nucléosides modifiés, sont encore obscurs. En outre, la compréhension actuelle de la fonction et de l’homéostasie du métabolisme des nucléosides/nucléotides reste à explorer et à élargir. Pour les étudier, il convient d’utiliser une méthode précise et de référence pour l’identification et la quantificati...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
acetonitrile	Sigma-Aldrich	1000291000
adenosine	Sigma-Aldrich	A9251-1G
ammonium acetate	Sigma-Aldrich	73594-100G-F
AMP	Sigma-Aldrich	01930-5G
CMP	Sigma-Aldrich	C1006-500MG
cytidine	Sigma-Aldrich	C122106-1G
GMP	Sigma-Aldrich	G8377-500MG
guanosine	Sigma-Aldrich	G6752-1G
Hypercarb column	Thermo Fisher Scientific GmbH	35005-054630
IMP	Sigma-Aldrich	57510-5G
inosine	Sigma-Aldrich	I4125-1G
methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
N1-methyladenosine	Carbosynth	NM03697
O6-methylguanosine	Carbosynth	NM02922
Murashige and Skoog Medium	Duchefa Biochemie	M0255.005
Polaris 5 C18A column	Agilent Technologies	A2000050X046
pseudouridine	Carbosynth	NP11297
UMP	Sigma-Aldrich	U6375-1G
uridine	Sigma-Aldrich	U3750-1G