Preparação da amostra de plantas para medição de conteúdo nucleoídeo/nucleotídeo com hplc-MS/MS

Resumo

Um método preciso e reprodutível para quantificação de nucleosídeos/nucleotídeos in vivo nas plantas é descrito aqui. Este método emprega um HPLC-MS/MS.

Resumo

Nucleosídeos/nucleotídeos são blocos de construção de ácidos nucleicos, partes de cosubstrates e coenzimas, moléculas de sinalização celular e portadores de energia, que estão envolvidos em muitas atividades celulares. Aqui, descrevemos um método rápido e confiável para a qualificação absoluta do conteúdo nucleosídeo/nucleotídeo nas plantas. Resumidamente, 100 mg de material vegetal homogeneizado foram extraídos com 1 mL de tampão de extração (metanol, acetonitrilo e água a uma razão de 2:2:1). Mais tarde, a amostra foi concentrada cinco vezes em um secador congelado e, em seguida, injetada em um HPLC-MS/MS. Nucleotídeos foram separados em uma coluna de carbono grafitado poroso (PGC) e nucleosídeos foram separados em uma coluna C18. As transições em massa de cada nucleosídeo e nucleotídeo foram monitoradas pela espectrometria de massa. O conteúdo dos nucleosídeos e nucleotídeos foram quantificados em relação aos seus padrões externos (ESTDs). Usando este método, portanto, os pesquisadores podem facilmente quantificar nucleosídeos/nucleotídeos em diferentes plantas.

Introdução

Nucleosídeos/Nucleotídeos são componentes metabólicos centrais em todos os organismos vivos, que são os precursores de ácidos nucleicos e muitos coenzymes, como nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD), e importante na síntese de macromoléculas como fosfolipídios, glicólipídios e polissacarídeos. Estruturalmente, o nucleosídeo contém uma nucleobase, que pode ser uma adenina, guanina, uracil, citosina ou timina, e um moiety de açúcar, que pode ser uma ribose ou uma desoxiribose^1,2. Os nucleotídeos têm até três grupos fosfatos ligados à posição de 5 carbonos da moiety açucarada dos nucleosídeos³. O metabolismo dos nucleotídeos nas plantas é essencial para a germinação de sementes e o crescimento da folha^4,5,6. Para entender melhor seus papéis fisiológicos no desenvolvimento das plantas, devem ser estabelecidos os métodos para a quantificação absoluta de diferentes nucleosídeos/nucleotídeos in vivo.

Uma das abordagens mais utilizadas para medir nucleosídeos/nucleotídeos emprega uma cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) juntamente com um detector ultravioleta visível (UV-VIS)^{detector 4,7,8,9,10,11}. Em 2013, usando HPLC, Dahncke e Witte quantificaram vários tipos de nucleosídeos em Arabidopsis thaliana⁷. Eles identificaram um conteúdo melhorado de guanosina em um mutante de inserção T-DNA no gene guanosina deaminase em comparação com a planta do tipo selvagem. Outro nucleosídeo pirimidina, o citidina, também foi detectado quantitativamente nas plantas que empregam esse método, o que resultou na identificação de um gene deaminase de citidina de boa fé ⁴. Com base no detector UV, este método, no entanto, não pode distinguir facilmente os nucleosídeos que têm espectros e tempos de retenção semelhantes, por exemplo, guanosina ou xanthosina. O limite de detecção do método HPLC é relativamente alto, portanto, é frequentemente utilizado para a medição de alto teor de nucleosídeos in vivo, como citidina, uridina e guanosina.

Além disso, a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS) também pode ser usada na medição nucleosídea. Beneficiando-se disso, Hauck et. al. detectou com sucesso uridina e ácido úrico, que é um metabólito a jusante da via catabólica nucleosídeo, nas sementes de A. thaliana¹². No entanto, o GC é normalmente usado para separar compostos voláteis, mas não é adequado para as substâncias termicamente labile. Portanto, uma cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS/MS) é provavelmente uma técnica analítica mais adequada e precisa para a identificação in vivo, separação e quantificação dos nucleosídeos/nucleotídeos^13,14. Vários estudos anteriores relataram que uma coluna HILIC pode ser usada para a separação de nucleosídeos e nucleotídeos^15,16 e padrões internos isotopicamente rotulados foram empregados para a quantificação composta¹⁷. No entanto, ambos os componentes são relativamente caros, especialmente os padrões comerciais rotulados de isótopos. Aqui, relatamos uma abordagem LC-MS/MS economicamente aplicável para medição de nucleosídeos/nucleotídeos. Este método já foi utilizado com sucesso para a quantitação de diversos nucleosídeos/nucleotídeos, incluindo ATP, N⁶-metil-AMP, AMP, GMP, uridina, citidina e pseudouridina^1,5,6,18, em plantas e Drosophila. Além disso, o método que relatamos aqui também pode ser usado em outros organismos.

Protocolo

1 Crescimento de plantas e coleta de materiais

1. Certifique-se de que as sementes arabidopsis sejam esterilizadas em 70% de etanol por 10 minutos e semeadas nas placas de ágar, que foram preparadas com nutrientes Murashige e Skoog de meia-resistência.
2. Incubar as placas contendo sementes arabidopsis sob escuras a 4 °C por 48 h, e depois transferi-las para uma câmara de crescimento controlada sob luz de 16 h de luz de 55 μmol m^-2 s^-1 a 22 °C e 8h escuras a 20 °C.
3. Colher 100 mg de mudas de 2 semanas (peso fresco) e congelar em nitrogênio líquido para extração de metabólitos.
   ATENÇÃO: Os pesquisadores devem usar luvas, óculos de proteção e um jaleco para evitar a contaminação do tecido humano durante a coleta de materiais.

2 Extração de nucleosídeos/nucleotídeos

1. Moído 100 mg de tecidos vegetais congelados com 7-8 contas de aço em um moinho de mistura pré-frio por 5 min a uma frequência de 60 Hz.
2. Prepare a solução de extração, que contém metanol, acetonitrila e água em uma proporção de 2:2:1.
3. Resuspengem os materiais homogeneizados (incluindo a maioria dos metabólitos, mas não proteínas) com 1 mL de solução de extração.
4. Centrifugar a solução resultante a 12.000 x g para 15 min a 4 °C.
5. Transfira 0,5 mL da suspensão para um novo tubo de 1,5 mL e congele no nitrogênio líquido.
6. Evaporar a amostra congelada em um dique congelado e resuspend em 0,1 mL de acetonitrilo de 5% e 95% de água.
7. Centrifugar a solução resultante (0,1 mL) a 40.000 x g por 10 min a 4 °C. Carregue o supernatante em um frasco para a medição LC-MS/MS.

3 medição LC-MS/MS

1. Prepare um tampão de acetato de amônio de 10 mM dissolvendo 1,1 g de acetato de amônio em 2 L de água desionizada dupla (fase móvel A). Ajuste o pH para 9,5 por 10% de amônio e ácido acetato.
2. Prepare 2 L de ultrapure 100% metanol (fase móvel B1) para medição de nucleosídeos. Além disso, prepare 2 L de ultrapure 100% acetonitrila (fase móvel B2) para medição de nucleotídeos.
3. Injete 0,02 mL de extração de metabólitos pré-tratados de cada amostra da etapa 2.7 em um sistema HPLC com bombas binárias (LC) juntamente com um espectrômetro de massa quadrupole triplo (MS).
   ATENÇÃO: O sistema HPLC emprega uma coluna C18 (50 x 4,6 mm, tamanho da partícula 5 μm; trabalhando a 25 °C) tampão com fase móvel A e B1(Figura 1A) para a separação dos nucleosídeos e usar uma coluna de carbono grafítico poroso (PGC) (50 x 4,6 mm, tamanho da partícula 5 μm; trabalhando a 25 °C) com fase móvel A e B2(Figura 1B) para a separação de nucleotídeos. Cada amostra foi injetada três vezes para a replicação técnica.
4. Programe o método conforme mostrado na Tabela 1 para a coluna C18 e o método conforme mostrado na Tabela 2 para a coluna PGC. Estabeleça uma taxa de fluxo de 0,65 mL min^-1.
   NOTA: As transições de massa(Tabela 3)foram monitoradas pelo espectrômetro de massa. As condições de análise de espectro de massa de oito nucleosídeos e cinco nucleotídeos contendo os canônicos e os modificados estão listados na Tabela 3.
5. Regissão de pico de cada composto alvo(Figura 1).

4 Geração das curvas de calibração padrão

1. Agrupar seis extrações de amostras juntas, que foram produzidas seguindo a descrição na seção 2, e vórtice. Em seguida, aliquot-lo a seis extrações (mesmo volume) novamente para obter cada fundo.
2. Adicione seis concentrações diferentes de cada padrão a essas seis extrações, respectivamente, e injete-as uma a uma etapa seguinte 3.3.
3. Regissão das áreas de pico de cada padrão em diferentes concentrações através das transições em massa, conforme descrito nas etapas 3.4 e 3.5.
4. Plote a área de pico contra a concentração nominal de cada padrão para gerar uma curva de seis pontos.
   NOTA: As áreas de pico de nucleosídeos/nucleotídeos registradas na etapa 3.5 devem cair na faixa das curvas de calibração padrão.
5. Calcule a equação de uma linha reta para cada composto padrão: Y = aX + b

5 Quantificação de Metabólitos

1. Calcule o conteúdo dos metabólitos utilizando a área de pico registrada na etapa 3.5 e a equação da etapa 4.5.

Resultados

Aqui, mostramos a identificação e quantificação da N¹-metiladenosina, um nucleosídeo modificado conhecido, em mudas silvestres arabidopsis de 2 semanas de idade (Col-0) como exemplo. O perfil de espectrometria de massa indica que os íons do produto gerados a partir do padrão N¹-metiladenosina são de 150 m/z e 133 m/z (Figura 2A),e o mesmo perfil também é observado na extração Col-0(Figura 2B

Discussão

Os organismos contêm vários nucleosídeos/nucleotídeos, incluindo os canônicos e aberrantes. No entanto, a origem e os pontos finais metabólicos deles, especialmente os nucleosídeos modificados, ainda são obscuros. Além disso, o entendimento atual da função e da homeostase do metabolismo nucleosídeos/nucleotídeos continua a ser explorado e expandido. Para investigá-los, é necessário utilizar um método preciso e padrão-ouro para esses metabólitos de identificação e quantificação. Aqui, descrevemos um...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
acetonitrile	Sigma-Aldrich	1000291000
adenosine	Sigma-Aldrich	A9251-1G
ammonium acetate	Sigma-Aldrich	73594-100G-F
AMP	Sigma-Aldrich	01930-5G
CMP	Sigma-Aldrich	C1006-500MG
cytidine	Sigma-Aldrich	C122106-1G
GMP	Sigma-Aldrich	G8377-500MG
guanosine	Sigma-Aldrich	G6752-1G
Hypercarb column	Thermo Fisher Scientific GmbH	35005-054630
IMP	Sigma-Aldrich	57510-5G
inosine	Sigma-Aldrich	I4125-1G
methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
N1-methyladenosine	Carbosynth	NM03697
O6-methylguanosine	Carbosynth	NM02922
Murashige and Skoog Medium	Duchefa Biochemie	M0255.005
Polaris 5 C18A column	Agilent Technologies	A2000050X046
pseudouridine	Carbosynth	NP11297
UMP	Sigma-Aldrich	U6375-1G
uridine	Sigma-Aldrich	U3750-1G