HPLC-MS/MSによるヌクレオシド/ヌクレオチド含有量測定のための植物サンプル調製

要約

インビボヌクレオシド/ヌクレオチドの植物定量の正確かつ再現可能な方法をここに記載する。この方法では、HPLC-MS/MS を採用しています。

要約

ヌクレオシド/ヌクレオチドは、核酸、共基質および補酵素の一部、細胞シグナル伝達分子、およびエネルギーキャリアの構成要素であり、多くの細胞活動に関与している。ここでは、植物におけるヌクレオシド/ヌクレオチド含量の絶対修飾のための迅速かつ信頼性の高い方法について述べます。簡単に言えば、100mgの均質化植物材料を1mLの抽出緩衝液(メタノール、アセトニトリル、及び水の比率2:2:1)で抽出した。その後、試料を凍結乾燥機に5回濃縮し、HPLC-MS/MSに注入し、多孔質黒鉛炭素(PGC)カラム上でヌクレオチドを分離し、ヌクレオシドをC18カラム上で分離した。各ヌクレオシドおよびヌクレオチドの質量遷移を質量分析法によりモニタリングした。ヌクレオシドおよびヌクレオチドの内容物を、その外部標準(ESTD)に対して定量した。したがって、この方法を使用すると、研究者は異なる植物のヌクレオシド/ヌクレオチドを簡単に定量することができます。

概要

ヌクレオシド/ヌクレオチドは、すべての生物の中心的な代謝成分であり、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)などの核酸および多くの補酵素の前駆体であり、リン脂質、糖脂質、多糖類などの高分子の合成において重要です。構造的には、ヌクレオシドは、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、またはチミンであり得るヌクレオベースと、リボースまたはデオキシリボース^1、2であり得る糖部分を含む。ヌクレオチドは、ヌクレオシド3の糖部分の5炭素位に結合する最大³つのリン酸基を有する。植物のヌクレオチドの代謝は、種子の発芽と葉の成長^4、5、6に不可欠です。植物の開発における生理学的役割をよりよく理解するために、生体内の異なるヌクレオシド/ヌクレオチドの絶対定量化方法を確立する必要があります。

ヌクレオシド/ヌクレオチドを測定するための最も一般的に使用されるアプローチの1つは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて、紫外線可視(UV-VIS)検出器4、7、8、9、10、11を用いる。2013年、HPLCを用いて、ダーンケとウィッテは、シロイヌナズナのヌクレオシドの数種類を定量化^した7.彼らは、野生型植物と比較して、グアノシン・デアミネーゼ遺伝子におけるT-DNA挿入変異体標的化におけるグアノシン含有量の増強を同定した。別のピリミジンヌクレオシド、シチジン、また、この方法を採用した植物において定量的に検出され、その結果、ボナフィデスシチジンデアミネーザーゼ遺伝子⁴の同定を行った。しかし、UV検出器に基づいて、この方法は、類似スペクトルおよび保持時間を有するヌクレオシドを容易に区別することができない、例えば、グアノシンまたはキサントシン。HPLC法の検出限界は比較的高く、従って、シチジン、ウリジン、グアノシンなどの生体内のヌクレオシドの高含量の測定に頻繁に使用される。

また、質量分析(GC-MS)に結合したガスクロマトグラフィーもヌクレオシド測定に使用できる。それから恩恵を受け、ハウクら。Al. A. thaliana¹²の種子中で、ヌクレオシドの同化経路の下流代謝産物であるウリジンおよび尿酸を正常に検出した。しかし、GCは通常、揮発性化合物を分離するために使用されるが、熱不安定な物質には適していない。したがって、質量分析(LC-MS/MS)に結合した液体クロマトグラフィーは、ヌクレオシド/ヌクレオチド^13,14のインビボ同定、分離、定量化に対して、より適した正確な分析技術である可能性が高^い。いくつかの以前の研究では、HILICカラムがヌクレオシドおよびヌクレオチド分離に使用され得る^{、15、16および}同位体標識内部標準が化合物定量¹⁷のために採用されたことを報告した。しかし、両方のコンポーネントは比較的高価であり、特に商業的同位体標識規格である。ここでは、ヌクレオシド/ヌクレオチド測定に経済的に適用可能なLC-MS/MSアプローチについて報告する。この方法は、ATP、N^6-メチル AMP、AMP、GMP、ウリジン、シチジン、および植物およびショウジョウバエにおけるシュードリジン^{1、5、6、18}を含む多様なヌクレオシド/ヌクレオチドの定量に既に成功して使用されています。また、ここで報告する方法は、他の生物でも使用できます。

プロトコル

1 植物の成長と材料の収集

1. シロイヌナズナの種子を70%エタノールで10分間殺菌し、半強のムラシゲとスクーグの栄養素で調製した寒天プレートに播種することを確認してください。
2. 4°Cで48時間暗い下で シロイヌナズナの 種子を含むプレートをインキュベートし、22°Cで55 μmol^m-2 s^-1 の16時間光の下で制御された成長室に移し、20°Cで8時間暗くします。
3. 2週間の苗(新鮮な重量)の100mgを収穫し、代謝物抽出のために液体窒素中で凍結する。
   注意:研究者は、材料収集中の人体組織汚染を避けるために、手袋、保護眼鏡、ラボコートを適切に着用する必要があります。

2 ヌクレオシド/ヌクレオチド抽出

1. 60 Hzの周波数で5分間、プレコールドミキサーミルに7-8スチールビーズを備えた凍結植物組織の100mgを粉砕します。
2. メタノール、アセトニトリル、水を含む抽出液を2:2:1の割合で調製します。
3. 1 mLの抽出溶液で、均質化された材料(ほとんどの代謝物を含むがタンパク質は含まない)を再懸濁させる。
4. 得られた溶液を12,000xgで4°Cで15分間遠心分離する。
5. 懸濁液の0.5mLを新しい1.5mLチューブに移し、液体窒素で凍結します。
6. 凍結したサンプルを凍結ダイアーで蒸発させ、5%アセトニトリルと95%の水の0.1mLで再懸濁します。
7. 得られた溶液(0.1 mL)を40,000 x g で4°Cで10分間遠心分離する。 LC-MS/MS測定用に上清をバイアルに積み込みます。

3 LC-MS/MS測定

1. 2Lの二重脱イオン水に1.1gの酢酸アンモニウムを溶解して10mMの酢酸アンモニウムバッファーを調製(移動相A)。pHを9.5に10%アンモニウムと酢酸に調整します。
2. ヌクレオシド測定用に2Lの超純粋な100%メタノール(移動相B1)を調製します。また、ヌクレオチド測定用に2Lの超純粋な100%アセトニトリル(移動相B2)を調製した。
3. ステップ2.7から各サンプルの前処理された代謝産物抽出の0.02 mLを、三重四極質量分析計(MS)と結合したバイナリポンプ(LC)を備えたHPLCシステムに注入します。
   注意:HPLCシステムは、C18カラム(50 x 4.6mm、粒子径5μm、25°Cで働く)を移動相AおよびB1(図1A)での緩衝処理を用いてヌクレオシド分離に使用し、多孔質黒鉛炭素(PGC)カラム(50 x 4.6mm、粒子径5μm、25°Cで働く)を用いてBB(B2)を用いた)各サンプルは、技術的なレプリケーションのために 3 回注入されました。
4. C18 列の 場合は表 1 に示すようにメソッドをプログラムし、PGC 列の 表 2 に示すようにメソッドをプログラムします。流量を 0.65 mL 分^{-1 に}設定します。
   注:質量遷移(表3)を質量分析計で監視しました。8つのヌクレオシドと5つのヌクレオチドの質量スペクトル分析条件は、カノニカルなものを含み、修飾されたものを含む、 表3に記載されている。
5. すべてのターゲット化合物のピーク領域を記録します(図1)。

4 標準キャリブレーション曲線の生成

1. 6つのサンプル抽出を一緒にプールし、セクション2の説明に従って作製し、それを渦に入れます。その後、再び6回の抽出(同じボリューム)にそれをアリコートして、各背景を取得します。
2. これらの6つの抽出にそれぞれ6つの異なる濃度の各標準を加え、ステップ3.3に続いて1つずつ注入します。
3. ステップ3.4および3.5で説明されているように、質量遷移を介して異なる濃度で各標準のピーク領域を記録します。
4. ピーク領域を各規格の公称濃度に対してプロットし、6点曲線を生成します。
   注: ステップ 3.5 で記録されたヌクレオシド/ヌクレオチドのピーク領域は、標準キャリブレーション曲線の範囲に収まらないはずです。
5. 各標準化合物の直線の方程式を計算します: Y = aX + b

5 代謝産物の定量化

1. ステップ3.5で記録されたピーク領域とステップ4.5の式を使用して代謝物の内容を計算します。

結果

ここでは、2週齢のシロイヌナズナ科野生型(Col-0)の苗木における既知の修飾ヌクレオシドである^N1-メチルアデノシンの同定と定量を例に示す。質量分析プロファイルは^、N1-メチルアデノシン標準から生成された生成イオンが150 m/zおよび133 m/z(図2A)であり、Col-0抽出においても同じプロファイルが観察されることを示す(

ディスカッション

生物には、カノニカルおよび異常なものを含む様々なヌクレオシド/ヌクレオチドが含まれています。しかし、それらの起源および代謝エンドポイント、特に修飾されたヌクレオシドは、依然として不明瞭である。さらに、ヌクレオシド/ヌクレオチド代謝の機能とホメオスタシスの現在の理解は、探求され、拡大する必要があります。それらを調査するには、これらの代謝産物の同定と定量?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
acetonitrile	Sigma-Aldrich	1000291000
adenosine	Sigma-Aldrich	A9251-1G
ammonium acetate	Sigma-Aldrich	73594-100G-F
AMP	Sigma-Aldrich	01930-5G
CMP	Sigma-Aldrich	C1006-500MG
cytidine	Sigma-Aldrich	C122106-1G
GMP	Sigma-Aldrich	G8377-500MG
guanosine	Sigma-Aldrich	G6752-1G
Hypercarb column	Thermo Fisher Scientific GmbH	35005-054630
IMP	Sigma-Aldrich	57510-5G
inosine	Sigma-Aldrich	I4125-1G
methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
N1-methyladenosine	Carbosynth	NM03697
O6-methylguanosine	Carbosynth	NM02922
Murashige and Skoog Medium	Duchefa Biochemie	M0255.005
Polaris 5 C18A column	Agilent Technologies	A2000050X046
pseudouridine	Carbosynth	NP11297
UMP	Sigma-Aldrich	U6375-1G
uridine	Sigma-Aldrich	U3750-1G