Preparación de muestras de plantas para la medición del contenido de nucleósidos/nucleótidos con una HPLC-MS/MS

Resumen

Un método preciso y reproducible para la cuantificación in vivo de nucleósidos/nucleótidos en plantas se describe aquí. Este método emplea una HPLC-MS/MS.

Resumen

Los nucleósidos/nucleótidos son bloques de construcción de ácidos nucleicos, partes de cosubstratos y coenzimas, moléculas de señalización celular y portadores de energía, que están involucrados en muchas actividades celulares. Aquí, describimos un método rápido y confiable para la calificación absoluta del contenido de nucleósidos / nucleótidos en plantas. Brevemente, se extrajeron 100 mg de material vegetal homogeneizado con 1 mL de tampón de extracción (metanol, acetonitrilo y agua en una proporción de 2:2:1). Más tarde, la muestra se concentró cinco veces en un liofilizador y luego se inyectó en una HPLC-MS / MS. Los nucleótidos se separaron en una columna de carbono grafítico poroso (PGC) y los nucleósidos se separaron en una columna C18. Las transiciones de masa de cada nucleósido y nucleótido fueron monitoreadas por espectrometría de masas. El contenido de los nucleósidos y nucleótidos se cuantificó contra sus estándares externos (ESTDs). Usando este método, por lo tanto, los investigadores pueden cuantificar fácilmente nucleósidos/nucleótidos en diferentes plantas.

Introducción

Los nucleósidos/nucleótidos son componentes metabólicos centrales en todos los organismos vivos, que son los precursores de los ácidos nucleicos y muchas coenzimas, como el dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD), e importantes en la síntesis de macromoléculas como fosfolípidos, glicolípidos y polisacáridos. Estructuralmente, el nucleósido contiene una nucleobase, que puede ser una adenina, guanina, uracilo, citosina o timina, y una mitad de azúcar, que puede ser una ribosa o una desoxirribosa^1,2. Los nucleótidos tienen hasta tres grupos fosfato que se une a la posición de 5 carbonos de la mitad azucarada de los nucleósidos³. El metabolismo de los nucleótidos en las plantas es esencial para la germinación de las semillas y el crecimiento^{de las hojas 4,5,6.} Para comprender mejor sus funciones fisiológicas en el desarrollo de las plantas, deben establecerse los métodos para la cuantificación absoluta de diferentes nucleósidos/nucleótidos in vivo.

Uno de los enfoques más comúnmente utilizados para medir nucleósidos /nucleótidos emplea una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) junto con un detector ultravioleta-visible (UV-VIS)^{4,7,8,9,10,11.} En 2013, utilizando HPLC, Dahncke y Witte cuantificaron varios tipos de nucleósidos en Arabidopsis thaliana^7. Identificaron un contenido mejorado de guanosina en un mutante de inserción de ADN T dirigido en el gen de la guanosina desaminasa en comparación con la planta de tipo salvaje. Otro nucleósido de pirimidina, la citidina, también se detectó cuantitativamente en plantas que empleaban este método, lo que resultó en la identificación de un gen de buena fe de la citidina desaminasa^4. Basado en el detector UV, este método, sin embargo, no puede distinguir fácilmente los nucleósidos que tienen espectros y tiempos de retención similares, por ejemplo, guanosina o xantosina. El límite de detección del método de HPLC es relativamente alto, por lo tanto, se utiliza con frecuencia para la medición del alto contenido de nucleósidos in vivo, como citidina, uridina y guanosina.

Además, la cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas (GC-MS) también se puede utilizar en la medición de nucleósidos. Beneficiándose de ella, Hauck et al. al. detectaron con éxito uridina y ácido úrico, que es un metabolito aguas abajo de la vía catabólica de nucleósidos, en las semillas de A. thaliana¹². Sin embargo, gc se utiliza normalmente para separar compuestos volátiles, pero no es adecuado para las sustancias térmicamente lábiles. Por lo tanto, una cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS) es probablemente una técnica analítica más adecuada y precisa para la identificación in vivo, separación y cuantificación de los nucleósidos/nucleótidos^13,14. Varios estudios previos informaron que una columna HILIC puede ser utilizada para la separación de nucleósidos y nucleótidos^15,16 y se emplearon estándares internos marcados isotópicamente para la cuantificación de compuestos^17. Sin embargo, ambos componentes son relativamente caros, especialmente los estándares comerciales etiquetados con isótopos. Aquí, se presenta un enfoque de LC-MS / MS económicamente aplicable para la medición de nucleósidos / nucleótidos. Este método ya se ha utilizado con éxito para la cuantificación de diversos nucleósidos / nucleótidos, incluyendo ATP, N⁶-metil-AMP, AMP, GMP, uridina, citidina y pseudouridina^1,5,6,18,en plantas y Drosophila. Por otra parte, el método que divulgamos aquí se puede utilizar en otros organismos también.

Protocolo

1 Crecimiento de planta y colección de materiales

1. Asegúrese de que las semillas de Arabidopsis se esterilizan en etanol al 70% durante 10 min y se siembran en las placas de agar, que se prepararon con nutrientes Murashige y Skoog de media fuerza.
2. Incubar las placas que contienen semillas de Arabidopsis bajo la oscuridad a 4 °C durante 48 h, y luego transferirlas a una cámara de crecimiento controlado bajo 16 h de luz de 55 μmol m^-2 s^-1 a 22 °C y 8 h de oscuridad a 20 °C.
3. Cosechar 100 mg de plántulas de 2 semanas (peso fresco) y congelar nitrógeno líquido para la extracción de metabolitos.
   PRECAUCIÓN: Los investigadores deben usar apropiadamente guantes, gafas protectoras y una bata de laboratorio para evitar la contaminación de tejido humano durante la recolección de materiales.

2 Extracción de nucleósidos/nucleótidos

1. Molido 100 mg de tejidos vegetales congelados con 7-8 perlas de acero en un molino mezclador pre-frío durante 5 min a una frecuencia de 60 Hz.
2. Prepare la solución de extracción, que contiene metanol, acetonitrilo y agua en una proporción de 2:2:1.
3. Resuspend los materiales homogeneizados (incluyendo la mayoría de los metabolitos pero no las proteínas) con 1 mL de solución de extracción.
4. Centrifugar la solución resultante a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
5. Transferir 0,5 mL de la suspensión a un nuevo tubo de 1,5 mL y congelar el nitrógeno líquido.
6. Evaporar la muestra congelada en un congelador y resuspend en 0,1 mL de acetonitrilo al 5% y 95% de agua.
7. Centrifugar la solución resultante (0,1 mL) a 40.000 x g durante 10 min a 4 °C. Cargue el sobrenadante en un vial para la medición de LC-MS/MS.

3 Medición LC-MS/MS

1. Preparar un tampón de acetato de amonio de 10 mM disolviendo 1,1 g de acetato de amonio en 2 L de agua doblemente desionizada (fase móvil A). Ajuste el pH a 9.5 por 10% de ácido de amonio y acetato.
2. Preparar 2 L de ultrapuro 100% metanol (Fase móvil B1) para la medición de nucleósidos. Además, prepare 2 L de ultrapuro 100% acetonitrilo (fase móvil B2) para la medición de nucleótidos.
3. Inyecte 0,02 mL de extracción de metabolitos pre-tratados de cada muestra del paso 2,7 en un sistema de HPLC con bombas binarias (LC) junto con un espectrómetro de masas triple cuadrupolo (MS).
   PRECAUCIÓN: El sistema hplc emplea una columna C18 (50 x 4,6 mm, tamaño de partícula 5 μm; trabajando a 25 °C) buffering con fase móvil A y B1 (Figura 1A) para la separación de nucleósidos y utilizar una columna de carbono grafítico poroso (PGC) (50 x 4,6 mm, tamaño de partícula 5 μm; trabajando a 25 °C) con fase móvil A y B2 (Figura 1B) para la separación de nucleótidos. Cada muestra fue inyectada tres veces para la replicación técnica.
4. Programe el método como se muestra en la tabla 1 para la columna C18, y el método como se muestra en la tabla 2 para la columna PGC. Establecer un caudal de 0,65 mL min^-1.
   NOTA: Las transiciones de masa (Tabla 3) fueron monitoreadas por espectrómetro de masas. Las condiciones de análisis del espectro de masas de ocho nucleósidos y cinco nucleótidos que contienen canónicos y modificados se enumeran en la Tabla 3.
5. Registrar las áreas máximas de cada compuesto objetivo (Figura 1).

4 Generación de las curvas estándar de la calibración

1. Agrupar seis extracciones de muestras juntas, que se produjeron siguiendo la descripción en la sección 2, y vórtice. Luego, alícuota a seis extracciones (mismo volumen) de nuevo para obtener cada fondo.
2. Añadir seis concentraciones diferentes de cada estándar a estas seis extracciones, respectivamente, e inyectarlas una por una siguiendo el paso 3.3.
3. Registre las áreas de pico de cada estándar en diferentes concentraciones a través de las transiciones de masa como se describe en los pasos 3.4 y 3.5.
4. Trace el área de pico contra la concentración nominal de cada estándar para generar una curva de seis puntos.
   NOTA: Las áreas de pico de nucleósidos/nucleótidos registrados en el paso 3.5 deben estar dentro del rango de curvas de calibración estándar.
5. Calcular la ecuación de una línea recta para cada compuesto estándar: Y = aX + b

5 Cuantificación de metabolitos

1. Calcular el contenido de metabolitos utilizando la zona de cresta registrada en el paso 3.5 y la ecuación del paso 4.5.

Resultados

Aquí, mostramos la identificación y cuantificación de N¹-metiladenosina, un nucleósido modificado conocido, en 2 semanas de edad Arabidopsis tipo salvaje (Col-0) plántulas como un ejemplo. El perfil de espectrometría de masas indicaque los iones producto generados a partir del estándar N 1-metiladenosina son 150 m/z y 133 m/z(Figura 2A),y el mismo perfil también se observa en la extracción de Col-0(...

Discusión

Los organismos contienen varios nucleósidos/nucleótidos, incluyendo los canónicos y aberrantes. Sin embargo, el origen y los puntos finales metabólicos de ellos, especialmente nucleósidos modificados, son todavía obscuros. Además, la comprensión actual de la función y la homeostasis del metabolismo de nucleósidos/nucleótidos sigue siendo explorada y ampliada. Para investigarlos, es necesario emplear un método preciso y de referencia para la identificación y cuantificación de estos metabolitos. Aquí, se des...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
acetonitrile	Sigma-Aldrich	1000291000
adenosine	Sigma-Aldrich	A9251-1G
ammonium acetate	Sigma-Aldrich	73594-100G-F
AMP	Sigma-Aldrich	01930-5G
CMP	Sigma-Aldrich	C1006-500MG
cytidine	Sigma-Aldrich	C122106-1G
GMP	Sigma-Aldrich	G8377-500MG
guanosine	Sigma-Aldrich	G6752-1G
Hypercarb column	Thermo Fisher Scientific GmbH	35005-054630
IMP	Sigma-Aldrich	57510-5G
inosine	Sigma-Aldrich	I4125-1G
methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
N1-methyladenosine	Carbosynth	NM03697
O6-methylguanosine	Carbosynth	NM02922
Murashige and Skoog Medium	Duchefa Biochemie	M0255.005
Polaris 5 C18A column	Agilent Technologies	A2000050X046
pseudouridine	Carbosynth	NP11297
UMP	Sigma-Aldrich	U6375-1G
uridine	Sigma-Aldrich	U3750-1G