HPLC-MS/MS ile Nükleozid/Nükleotid İçerik Ölçümü için Bitki Numunesi Hazırlama

Özet

Bitkilerde in vivo nükleozidler/nükleotidler nicelemesi için kesin ve tekrarlanabilir bir yöntem burada açıklanmıştır. Bu yöntem bir HPLC-MS/MS kullanmaktadır.

Özet

Nükleozidler/nükleotitler, nükleik asitlerin yapı taşları, kosubstratların ve koenzimlerin parçaları, hücre sinyal molekülleri ve birçok hücre faaliyetinde yer alan enerji taşıyıcılarıdır. Burada, bitkilerdeki nükleozid/ nükleotid içeriğinin mutlak kalifikasyon için hızlı ve güvenilir bir yöntem açıklıyoruz. Kısaca, 100 mg homojenize bitki materyali 1 mL ekstraksiyon tamponu (metanol, asetonitril ve su 2:2:1 oranında) ile çıkarıldı. Daha sonra, örnek bir dondurarak kurutucuda beş kez yoğunlaştı ve daha sonra bir HPLC-MS/MS'e enjekte edildi. Her nükleozid ve nükleotitin kütle geçişleri kütle spektrometresi ile izlendi. Nükleozidlerin ve nükleotitlerin içeriği dış standartlarına (ESTD' ler) göre ölçüldür. Bu nedenle, araştırmacılar bu yöntemi kullanarak farklı bitkilerdeki nükleozidleri / nükleotitleri kolayca ölçebilirler.

Giriş

Nükleozidler/Nükleotitler, nükleik asitlerin ve nikotinamid adenin dinükleotid (NAD) gibi birçok koenzim için öncü olan ve fosfolipidler, glikolipidler ve polisakkaritler gibi makromoleküllerin sentezinde önemli olan tüm canlı organizmalarda merkezi metabolik bileşenlerdir. Yapısal olarak, nükleozid, adenin, guanin, urasil, sitozin veya timin olabilen bir nükleobase ve riboz veya deoksiriboz^1,2olabilen bir şeker moiety içerir. Nükleotitler, nükleozidlerin şeker moietysinin 5 karbon pozisyonuna bağlı en fazla üç fosfat grubuna sahiptir³. Bitkilerdeki nükleotitlerin metabolizması tohum çimlenmesi ve yaprak büyümesi için gereklidir^4,5,6. Bitki gelişimindeki fizyolojik rollerini daha iyi anlamak için, vivo olarak farklı nükleozidlerin / nükleotitlerin mutlak nicelemesi için yöntemler oluşturulmalıdır.

Nükleozidleri/nükleotidleri ölçmek için en sık kullanılan yaklaşımlardan biri, ultraviyole görünür (UV-VIS) dedektör 4 ,⁷,⁸,^9,10^,11ile birlikte yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi (HPLC) kullanmaktadır. 2013 yılında, HPLC, Dahncke ve Witte kullanarak Arabidopsis thaliana^7'dekinükleozidlerin çeşitli türlerini ölçtü. Vahşi tip bitkiye kıyasla guanosin deaminaz geninde hedef alan bir T-DNA ekleme mutantında gelişmiş bir guanosin içeriği tespit ettiler. Başka bir pirimidin nükleozid, sitidin, bu yöntemi kullanan bitkilerde nicel olarak tespit edildi, bu da iyi niyetli bir sitidin deaminaz geninin tanımlanmasıyla sonuçlandı⁴. Bununla birlikte, UV dedektörüne dayanarak, bu yöntem, guanosin veya ksantozin gibi benzer spektrumlara ve tutma sürelerine sahip nükleozidleri kolayca ayırt edemez. HPLC yönteminin algılama sınırı nispeten yüksektir, bu nedenle, sitidin, uridin ve guanosin gibi yüksek miktarda nükleozid in vivo ölçümü için sıklıkla kullanılır.

Ayrıca çekirdek ölçümünde kütle spektrometresi (GC-MS) ile birleştirilmiş gaz kromatografisi de kullanılabilir. Bundan faydalanmak, Hauck ve diğerleri. al. A. thaliana¹²tohumlarında nükleozid katabolik yolun aşağı akış metabolit olan uridin ve ürik asit başarıyla tespit edildi. Bununla birlikte, GC normalde uçucu bileşikleri ayırmak için kullanılır, ancak termal olarak labile maddeler için uygun değildir. Bu nedenle, kütle spektrometresi (LC-MS/ MS) ile birleştirilmiş bir sıvı kromatografisi muhtemelen nükleozidlerin / nükleotitlerin^13,14'ünin vivo tanımlanması, ayrılması ve nicelleştirilmesi için daha uygun ve doğru bir analitik tekniktir. Daha önceki birkaç çalışmada, nükleozidler ve nükleotidler ayrımı için bir HILIC sütununun kullanılabileceği bildirilmiştir^15,16 ve izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar bileşik niceleme için^{kullanılmıştır 17}. Bununla birlikte, her iki bileşen de nispeten pahalıdır, özellikle ticari izotop etiketli standartlar. Burada nükleozidler/nükleotidler ölçümü için ekonomik olarak uygulanabilir bir LC-MS/MS yaklaşımı rapor ediyoruz. Bu yöntem, atp, N 6 -metil-AMP, AMP, GMP, üridin, sittin ve psödouridine 1 ,⁵,^6,18, bitkilerde ve Drosophiladahil olmak üzere çeşitli nükleozidlerin / nükleotidlerin niceliği için zaten başarıyla kullanılmıştır. Ayrıca, burada rapor ettiğimiz yöntem diğer organizmalarda da kullanılabilir.

Protokol

1 Bitki büyümesi ve malzeme toplama

1. Arabidopsis tohumlarının 10 dakika boyunca% 70 etanolde sterilize edildiğinden ve yarı mukavemetli Murashige ve Skoog besinleri ile hazırlanan agar plakalarına ekilmesinden emin olun.
2. Arabidopsis tohumlarını 4 °C'de 48 saat boyunca karanlık altında kuluçkaya yatırın ve ardından 22 °C'de 55 μmol m^{-2 s -1 ve 20} °C'de 8 saat karanlık olan¹⁶ saat ışığı altında kontrollü bir büyüme odasına aktarın.
3. 100 mg 2 haftalık fide (taze ağırlık) hasat edin ve metabolit ekstraksiyonu için sıvı nitrojende dondurun.
   DİkKAT: Araştırmacılar, malzeme toplama sırasında insan dokusu kirlenmesini önlemek için uygun şekilde eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü giymelidir.

2 Nükleozid/Nükleotid ekstraksiyonu

1. 100 mg dondurulmuş bitki dokusunu 7-8 çelik boncuk ile soğuk öncesi bir karıştırıcı değirmeninde 60 Hz frekansta 5 dakika öğütin.
2. Metanol, asetonitril ve su içeren ekstraksiyon çözeltisini 2:2:1 oranında hazırlayın.
3. Homojenize malzemeleri (çoğu metabolit dahil ancak proteinler dahil) 1 mL ekstraksiyon çözeltisi ile yeniden kullanın.
4. Elde ettiği çözeltiyi 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj edin.
5. Süspansiyonun 0,5 mL'lik kısmını yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve sıvı nitrojende dondurun.
6. Donmuş numuneyi donmuş bir boyada buharlaştırın ve % 5 asetonitril ve% 95 su ile 0,1 mL'de yeniden depolayın.
7. Elde eden çözeltiyi (0,1 mL) 40.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin. LC-MS/MS ölçümü için süpernatant'ı bir şişeye yükleyin.

3 LC-MS/MS ölçümü

1. 2 L çift deiyonize suda (Mobil faz A) 1,1 g amonyum asetat eriterek 10 mM amonyum asetat tamponu hazırlayın. pH'ı %10 amonyum ve asetat asit ile 9,5'e ayarlayın.
2. Nükleozid ölçümü için 2 L ultra saf %100 metanol (Mobil faz B1) hazırlayın. Ayrıca nükleotid ölçümü için 2 L ultra saf %100 asetonitril (Mobil faz B2) hazırlayın.
3. Adım 2.7'den her numunenin önceden işlenmiş metabolit ekstraksiyonunun 0.02 mL'lik kısmını, üçlü dörtlü kütle spektrometresi (MS) ile birleştirilmiş ikili pompalar (LC) ile bir HPLC sistemine enjekte edin.
   DİkKAT: HPLC sisteminde C18 sütunu (50 x 4,6 mm, parçacık boyutu 5 μm; çekirdek ayrımı için mobil faz A ve B1 (Şekil 1A) ile 25 °C'de tamponlamada çalışmak ve çekirdeğe ayrılması için mobil faz A ve B2(Şekil 1B)ile gözenekli bir grafitik karbon (PGC) sütunu (50 x 4.6 mm, partikül boyutu 5 μm; 25 °C'de çalışmak) kullanın. Her örnek teknik çoğaltma için üç kez enjekte edildi.
4. Yöntemi C18 sütunu için Tablo 1'de gösterildiği gibi ve PGC sütunu için Tablo 2'de gösterildiği gibi programlayın. 0,65 mL min^-1akış hızı ayarlayın.
   NOT: Kütle geçişleri (Tablo 3) kütle spektrometresi ile izlendi. Sekiz nükleozid ve kanonik olanları ve değiştirilmiş olanları içeren beş nükleotitlerin kütle spektrum analiz koşulları Tablo 3'telistelenmiştir.
5. Her hedef bileşiğin tepe alanlarını kaydedin (Şekil 1).

4 Standart kalibrasyon eğrilerinin üretimi

1. Bölüm 2'deki açıklamanın ardından üretilen havuz altı örnek ekstraksiyonu ve girdap. Sonra, her arka planı almak için tekrar altı ekstraksiyona (aynı hacim) aliquot.
2. Bu altı ekstraksiyona sırasıyla her standartın altı farklı konsantrasyonu ekleyin ve 3.3 adımını takiben bunları tek tek enjekte edin.
3. 3.4 ve 3.5. adımlarda açıklandığı gibi kütle geçişleri yoluyla her standardın en yüksek alanlarını farklı konsantrasyonlarda kaydedin.
4. Altı noktalı bir eğri oluşturmak için tepe alanını her standardın nominal konsantrasyonuna göre çizin.
   NOT: 3.5 adımında kaydedilen nükleozidlerin/nükleotitlerin tepe alanları standart kalibrasyon eğrileri aralığına düşmelidir.
5. Her standart bileşik için düz bir çizgi denklemini hesaplayın: Y = aX + b

5 Metabolitlerin nicelemesi

1. 3.5 adımında kaydedilen tepe alanını ve 4.5 adımındaki denklemi kullanarak metabolitlerin içeriğini hesaplayın.

Sonuçlar

Burada, 2 haftalık Arabidopsis vahşi tip (Col-0) fidanlarında bilinen bir modifiye nükleozid olan N¹-metildenozinin tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini örnek olarak gösteriyoruz. Kütle spektrometresi profili, N¹-metildenozin standardından üretilen ürün iyonlarının 150 m/z ve 133 m/z (Şekil 2A) olduğunu ve aynı profilin Col-0 ekstraksiyonunda da gözlendiğini gösterir (Şekil 2B

Tartışmalar

Organizmalar, kanonik ve sapkın olanlar da dahil olmak üzere çeşitli nükleozidler / nükleotitler içerir. Bununla birlikte, bunların kökeni ve metabolik uç noktaları, özellikle modifiye nükleozidler, hala belirsizdir. Ayrıca, nükleozidler/ nükleotid metabolizmasının fonksiyonu ve homeostazının mevcut anlayışı araştırılmak ve genişletilmeye devam etmektedir. Bunları araştırmak için, bu metabolitlerin tanımlanması ve nicelleştirilmesi için kesin ve altın standartlı bir yöntemin kullanı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
acetonitrile	Sigma-Aldrich	1000291000
adenosine	Sigma-Aldrich	A9251-1G
ammonium acetate	Sigma-Aldrich	73594-100G-F
AMP	Sigma-Aldrich	01930-5G
CMP	Sigma-Aldrich	C1006-500MG
cytidine	Sigma-Aldrich	C122106-1G
GMP	Sigma-Aldrich	G8377-500MG
guanosine	Sigma-Aldrich	G6752-1G
Hypercarb column	Thermo Fisher Scientific GmbH	35005-054630
IMP	Sigma-Aldrich	57510-5G
inosine	Sigma-Aldrich	I4125-1G
methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
N1-methyladenosine	Carbosynth	NM03697
O6-methylguanosine	Carbosynth	NM02922
Murashige and Skoog Medium	Duchefa Biochemie	M0255.005
Polaris 5 C18A column	Agilent Technologies	A2000050X046
pseudouridine	Carbosynth	NP11297
UMP	Sigma-Aldrich	U6375-1G
uridine	Sigma-Aldrich	U3750-1G