تحضير ذكور بعوضة الزاعجة المصرية المشععة والموسومة للإفراج عنها في برنامج تقنية الحشرة العقيمة التشغيلية

Summary

تستخدم تقنية الحشرة العقيمة (SIT) للسيطرة على مجموعات محددة ومهمة طبيا من البعوض قد تكون مقاومة للمكافحة الكيميائية. هنا ، نصف طريقة للتربية الجماعية وإعداد ذكور البعوض العقيمة للإفراج عنها في برنامج تشغيلي لتقنية الحشرة العقيمة يستهدف بعوضة الزاعجة المصرية .

Abstract

تعتمد مكافحة الأمراض البشرية مثل حمى الضنك وزيكا والشيكونغونيا على مكافحة نواقل الأمراض ، بعوضة الزاعجة المصرية ، لأنه لا توجد وقاية. ويمكن أن تعتمد مكافحة البعوض الناقل على المواد الكيميائية المطبقة على المراحل غير الناضجة ومرحلة البلوغ، والتي يمكن أن تسهم في وفيات غير المستهدفين، والأهم من ذلك، أن تؤدي إلى مقاومة المبيدات الحشرية في النواقل. تقنية الحشرة العقيمة (SIT) هي طريقة للسيطرة على مجموعات الآفات من خلال إطلاق الذكور البالغين المعقمة التي تتزاوج مع الإناث البرية لإنتاج ذرية غير قابلة للحياة. تصف هذه الورقة عملية إنتاج ذكور عقيمة لاستخدامها في برنامج تشغيلي لمكافحة بعوض الزاعجة المصرية . فيما يلي الخطوات المستخدمة في البرنامج بما في ذلك تربية مستعمرة والحفاظ عليها ، وفصل الشرانق من الذكور والإناث ، وتشعيع الذكور البالغين ووضع علامات عليها ، وشحن ذكور الزاعجة المصرية إلى موقع الإطلاق. كما تمت مناقشة المحاذير الإجرائية وقيود البرنامج والأهداف المستقبلية.

Introduction

يتسبب انتقال مسببات الأمراض التي ينقلها البعوض إلى البشر في ملايين حالات المرض والوفيات كل عام في جميع أنحاء العالم. وفي غياب لقاحات فعالة ومعتمدة للأمراض التي ينقلها البعوض، مثل زيكا أو حمى الضنك، فإن إحدى أكثر الطرق فعالية للحد من انتقال العدوى هي الحد من أسراب البعوض الناقل للأمراض. ومن المثير للقلق أن عددا متزايدا من أنواع البعوض، التي تستهدفها تقليديا مبيدات الآفات، تظهر مستويات متزايدة من مقاومة مبيدات الآفات¹. في الوقت نفسه ، قامت الوكالات الحكومية بإلغاء تسجيل أو حظر مبيدات الآفات المعتمدة سابقا ، ويتم تطوير عدد قليل من تدابير المكافحة الكيميائية الجديدة والفعالة ^2,3. وقد حفزت هذه المجموعة من العقبات التي تعترض مكافحة البعوض على استكشاف تقنيات غير كيميائية بديلة للحد من أعداد البعوض.

تمثل بعض أنواع البعوض تحديات لمكافحة قضايا المقاومة وتسجيل مبيدات الآفات. Aedes aegypti (L.) هو بعوضة بارزة ناقلة للأمراض يصعب للغاية مكافحتها من خلال الإدارة التقليدية المتكاملة للناقلات بسبب الموائل المحيطة بالمنزل الغامضة التي يستغلها هذا النوع للنمو غير الناضج والراحة البالغة ^4,5. وتشمل التحديات المتعلقة باستغلال الموائل الخفية حول المساكن صعوبة الوصول إلى هذه المواقع باستخدام تقنيات رش مبيدات الآفات، فضلا عن احتمال عدم قبول الجمهور للوصول المتكرر إلى الممتلكات الخاصة لوكالات مكافحة ناقلات الأمراض في مجال الصحة العامة لإجراء أنشطة المراقبة والمكافحة المكثفة الحاسمة للإدارة المتكاملة الفعالة للنواقل لهذا النوع.

لحسن الحظ ، يتم تطبيق SIT ، وهو نهج أثبت نجاحه في السيطرة الدائمة على أنواع الحشرات الأخرى الصعبة^{للغاية 6} ، على مشكلة Aedes aegypti في سلسلة رائدة من التجارب والتجارب التشغيلية في سانت أوغسطين ، فلوريدا (KJL ، RLA ، SCB بيانات غير منشورة). تم تطبيق تقنية الحشرة العقيمة على مجموعة من أنواع الحشرات ، بما في ذلك البعوض ، وتم استعراضها بعمق ^7,8. تستفيد تقنية الحشرة العقيمة من الإطلاق الجماعي للذكور التي تربى في مستعمرات والتي يتم تعقيمها ، على سبيل المثال ، عن طريق التعرض للإشعاع المؤين أو المواد الكيميائية للتغلب على اختيار الشريك للسكان الطبيعيين للإناث. الذكور المعقمة التي تتزاوج مع الإناث البرية تجعل البيض عقيما بسبب الأضرار التي لحقت بالأمشاج الذكور ، وإذا كانت موجودة بأعداد كافية ، يمكن نظريا تحطم الزاعجة المصرية الطبيعية.

بدأ برنامج تقنية الحشرة العقيمة لمحاولة الحد من أعداد الزاعجة المصرية في منطقة حضرية في ساحل المحيط الأطلسي في فلوريدا حيث أعيد استعمار هذا النوع مؤخرا ويتوسع ويشكل خطرا على الصحة العامة لانتقال فيروسات مثل زيكا أو حمى الضنك أو الشيكونغونيا. لتعظيم إمكانية التوافق مع الإناث البرية ، تم إنشاء مستعمرة جديدة باستخدام الزاعجة المصرية التي يتم صيدها من السكان المستهدفين لإنتاج الذكور للبرنامج⁹. استند هذا إلى فرضية أن الذكور المشتقة محليا والتي يتم تربيتها في المستعمرات ستكون أكثر عرضة للتنافس مع الذكور البرية المحلية للتزاوج مع الإناث البرية المحلية. ولكي تكون تقنية الحشرة العقيمة فعالة، لا يلزم فقط وجود أعداد هائلة من الذكور العقيمة في المنطقة المستهدفة، ولكن يجب أن تكون أيضا قادرة على مغازلة إناث البعوض البرية المحلية والتزاوج معها بشكل فعال.

تم إجراء سلسلة من التجارب لتحديد العدد الأمثل للذكور العقيمة التي يجب إطلاقها (KJL ، RLA ، SCB البيانات غير المنشورة) بالإضافة إلى الجرعات المثلى من الإشعاع التي من شأنها أن تجعل الذكور عقيما دون التدخل في البقاء على قيد الحياة أو السلوك أو القبول من قبل الإناث البرية (KJL ، RLA ، SCB البيانات غير المنشورة). هذه البيانات قادمة في منشورات الحلفاء من هذه المجموعة ، ولكن يتم التقاط بعض هذه النتائج في هذا البروتوكول أيضا ويمكن استخدامها كنقطة انطلاق لبرامج مكافحة SIT Aedes aegypti الجديدة في أماكن أخرى. تعمل هذه الأنواع باستمرار على توسيع نطاقها ، وتظهر برامج SIT وعدا كبيرا بأن تكون حلولا فعالة من حيث التكلفة وطويلة الأجل للسيطرة على هذه المجموعة. الهدف من هذا البروتوكول هو إنتاج بعوضة الزاعجة المصرية المعقمة والذكور والمرباة في المستعمرات لإطلاقها بشكل منهجي في المناطق الخارجية لتعطيل دورات التكاثر الطبيعية لمجموعات الزاعجة المصرية المحلية في برنامج تشغيلي لمكافحة ناقلات الصحة العامة.

في حين تم نشر بروتوكولات وتدفقات عمل مماثلة لإنتاج ذكور Aedes aegypti المعدلة وراثيا وسير عمل الإنتاج ل Aedes SIT ، أو تم نشر برامج عدم التوافق القائمة على Wolbachia في مكان آخر ، يوضح هذا البروتوكول كيف تم تكييف البروتوكولات الحالية لإنتاج Aedes aegypti ، وفصل وتشعيع الشرانق الذكور ، ووضع علامات على الذكور البالغين وتعبئتها ، وشحنها إلى موقع الإصدار لهذا البرنامج ^{9 ،} 10،^11،12،13،14،15،¹⁶،^17،18. قد لا يكون عنصر الوسم في هذا البروتوكول مطلوبا في برنامج SIT التشغيلي الناضج ؛ ومع ذلك ، فقد تم تضمينه هنا لأنه طريقة واحدة لمراقبة فعالية ومراقبة جودة العملية برمتها في السنوات الأولى من إنشاء برنامج SIT. عادة ما يتم تشغيل برامج مكافحة البعوض من قبل السلطات المحلية ، لذلك يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا في العديد من جوانب تنظيمها من الحجم وقاعدة التمويل إلى ضبط تكتيكات المكافحة لتحقيق أقصى قدر من النجاح المحلي. وبالتالي ، ينبغي تقييم البروتوكول الموصوف هنا للتأكد من توافقه مع الموارد المتاحة.

Protocol

ملاحظة: هذا البروتوكول خاص بمناولة الزاعجة المصرية ولكن يمكن تعديله ليكون فعالا بالنسبة لأنواع البعوض الأخرى.

1. إنتاج وصيانة مستعمرة الزاعجة المصرية

1. الزاعجة الخلفية الكبار aegypti وإنتاج البيض.
   1. قم بإعداد إطار من الألومنيوم قابل للطي مقاس 0.6 م × 0.6 م × 0.6 م ، وقفص تربية كبير مع غربلة شبكية من الألياف الزجاجية 20 × 20 وغطاء مخزون يمكن الوصول إليه على جدار عمودي واحد.
   2. ضع حوضا بلاستيكيا سعة 1900 مل مع عذارى الزاعجة المصرية (نسبة 1: 1 بين الجنسين) في كل قفص تربية ، واربط الكم مغلقا ، واترك الأكواب في مكانها للإغلاق حتى لا يظهر المزيد من البالغين (أي حوالي 4 أيام). في هذا الوقت ، قم بإزالة الأكواب ، وحافظ على أقفاص تربية البالغين عند 28-30 درجة مئوية ، ورطوبة نسبية >50٪ (Rh) ، ودورة 12:12 أو 14:10 ضوء: مظلم (L: D).
      ملاحظة: يرد وصف لإنتاج عذارى الزاعجة المصرية في القسم 1.2. يجب أن تكون كثافة الشرانق في حوض 1900 مل بحيث يكون هناك مساحة كافية لجميع الشرانق للخروج للهواء في وقت واحد.
   3. بعد أربع وعشرين ساعة من وضع الشرانق في أقفاص التربية ، ضع وعاءا يحتوي على محلول سكروز بنسبة 10٪ مع فتيل إسفنجي ، وقم بتعليق إسفنجة مقاس 10 سم × 2 سم مبللة بالعسل من خطاف سلكي في كل قفص لتوفير مصادر منفصلة للترطيب والتغذية للبعوض البالغ. راقب الإسفنج وحاوية السكروز بحثا عن الجفاف أو نمو العفن ، وقم بتجديدها أو تغييرها حسب الحاجة.
      ملاحظة: استخدم كوبا بلاستيكيا سعة 120 مل مع فتيل إسفنجي مقاس 10 سم × 2 سم مثبت من خلال فتحة في الغطاء في أقفاص تربية صغيرة وكوب بلاستيكي سعة 460 مل مع فتيل إسفنجي مقاس 12 سم × 8 سم في أقفاص كبيرة.
   4. توفير وجبة دم لكل قفص تربية بعد 48-72 ساعة من ظهور غالبية البالغين وكل 2-3 أيام بعد ذلك للحفاظ على أعداد كبيرة من الإناث التي تتغذى على الدم لزيادة محصول البيض. املأ الواقي الذكري من جلد الخروف ب 50-100 مل من دم البقر المنزوع ، وقم بتسخينه إلى حوالي 37 درجة مئوية في حمام ماء ساخن. بعد ذلك ، استخدم قطعة قماش أو منشفة ورقية لتربيت الواقي الذكري وتجفيفه جزئيا قبل وضعه على طبق بتري مبطن بالورق داخل القفص لمدة 30-60 دقيقة.
      ملاحظة: قبل الاستخدام ، اشطف الجزء الداخلي والخارجي من كل واقي ذكري بالماء 2-3x لإزالة مواد التشحيم أو الركائز الأخرى ، وتحقق من وجود ثقوب. يمكن إعادة استخدام الواقي الذكري لمدة 3-5 وجبات عن طريق شطف الدم وتخزينه في كوب من الماء البارد. نظرا لأن بعض المستعمرات قد تعاني من تفشي النمل ، فقد يلزم تعليق الواقي الذكري للحد من الوصول.
   5. انتظر 48-72 ساعة بعد كل إرضاعة دم ، ثم أدخل كوب وضع البيض في كل قفص تربية بالغ. قم بإعداد أكواب وضع البيض عن طريق إضافة 200 مل من ماء العذراء المصفى (أي تم تربية يرقات الماء والشرانق) في كوب بلاستيكي سعة 460 مل مزود بورقة إنبات البذور بارتفاع 8-10 سم × 30 سم (ورق وضع البيض) المجهز على طول المحيط الداخلي للكوب. تحقق من أوراق وضع البيض يوميا ، واستبدلها كل 2-4 أيام ، وقم بتخزين أوراق وضع البيض المحملة بالبيض بعناية عن طريق تركها تجف لمدة 24-48 ساعة عند >50٪ Rh¹⁹.
      ملاحظة: اترك أكواب وضع البيض في أقفاص التربية لمدة لا تزيد عن 72 ساعة لمنع البيض من الفقس.
   6. حافظ على أقفاص تربية البالغين لمدة تصل إلى 3-4 أسابيع قبل تكسيرها وإنشاء أقفاص تربية جديدة للبالغين.
      1. لتحطيم قفص التربية ، قم بإزالة وتنظيف كوب وضع البيض ، وتخزين ورق وضع البيض المحمل بالبيض ، وإزالة وتنظيف حاوية محلول السكروز وإسفنجة العسل ، وتجميد القفص لقتل جميع البعوض.
      2. قم بإزالة جميع أجسام البعوض ، ونظف جيدا داخل وخارج كل قفص بالماء والصابون المخفف باستخدام مناشف ورقية ومنصات جلي بالإسفنج. اترك القفص النظيف يجف لمدة 24 ساعة على الأقل قبل استخدامه في دورة التربية التالية.
         ملاحظة: استخدم معدات تفريغ مزودة بترشيح عالي الكفاءة لإزالة الجسيمات التي يمكن أن تؤدي إلى الحساسية. يمكن تنظيف حاويات محلول السكروز وإعادة استخدامها 3-5x.
2. تربية يرقات الزاعجة المصرية من البيض
   1. تحضير مخزون من الملاط الغذائي اليرقات عن طريق خلط 80 جم من نسبة 3: 2 من مسحوق الكبد البقري: خميرة البيرة في 2200 مل من ماء الصنبور. تحضير طعام السمك المسحوق. صب رقائق السمك في مطحنة التوابل وطحنها حتى يصبح مسحوقا ناعما.
      ملاحظة: تم تعيين هذا الطين باللون البني في هذا المختبر .
   2. باستخدام ورق وضع البيض المحمل بالبيض (5000-10000 بيضة) من الخطوة 1.1.5 ، قم بقطع جزء 3-7 سم من ورق البيض بشكل عمودي على خط وضع البيض ، وضعه في وعاء سعة 460 مل نصف مملوء بماء الصنبور مع قليل من رقائق طعام السمك المسحوق. يغطى ويحرك بقوة لمدة 1 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: يجب تخزين ورق البيض لمدة 7 أيام على الأقل (ولكن ليس أكثر من 90 يوما ، مما قد يقلل من الفقس) بعد وضع البيض قبل بدء عملية الفقس للسماح بالجنين. تعمل البكتيريا والطحالب الموجودة في طعام الأسماك على إزالة الأكسجين من الماء بسرعة ، مما يؤدي إلى نمو اليرقات.
   3. صب محتويات الحاوية بالكامل من الخطوة 1.2.2 في مقلاة تربية اليرقات المحضرة ب 3 لتر من ماء الصنبور و 50 مل من الملاط البني . ضع علامة على المقلاة بتاريخ البدء ومعلومات السلالة وجدول التغذية لكل جدول 1 ، وقم بتخزينها في درجة حرارة 28-30 درجة مئوية ، ورطوبة نسبية >50٪ ، و 12:12 أو 14:10 لتر: D دور.
      ملاحظة: تعتمد نسبة 3 لتر من الماء إلى 50 مل من اللون البني على عمق الماء في أحواض اليرقات المعينة المذكورة في جدول المواد. ستدعم المقالي ذات الأحجام المختلفة كثافات العذراء المختلفة وبالتالي تتطلب كميات مختلفة من الماء والطين البني . وترد معدلات تغذية اليرقات في الجدول 1 كنطاق؛ يعتمد اختيار الكمية المستخدمة على الخبرة وتحديد الصحة العامة لليرقات النامية باستخدام متغيرات مثل تعكر الماء واللون والرائحة ؛ وجود فيلم بكتيري على الماء ؛ عدد أو نسبة اليرقات الحية والميتة ؛ وحركة اليرقات. في الأيام من 3 إلى 6 ، قم بإطعام البعوض غير الناضج طعام السمك المسحوق وفقا للجدول 1. إن إضافة الماء وتقليل الطعام وإنشاء 2-3 أحواض إضافية مما يتطلبه المشروع هي طرق لإدارة أحواض اليرقات غير الصحية.

يوم	تمت إضافة حجم الملاط الغذائي	حجم المياه المضافة	الاجراءات
1	50 مل (ملاط)	3000 مل
2	(لا طعام)	(لا ماء)
3	1/4 - 1/2 ملعقة صغيرة (طعام السمك المسحوق)	500-1000 مل
4	1/2 - 3/4 ملعقة صغيرة (طعام السمك المسحوق)	500-1000 مل
5	1/2 - 3/4 ملعقة صغيرة (طعام السمك المسحوق)	500-1000 مل
6	1/4 - 1/2 ملعقة صغيرة (طعام السمك المسحوق)	500-1000 مل
7	(لا طعام)	(لا ماء)	سلالة الشرانق واليرقات

الجدول 1: جدول التغذية للتربية الجماعية ليرقات الزاعجة المصرية.

2. فصل ذكور الزاعجة المصرية الشرانق

1. تركيز الشرانق من أحواض اليرقات. بمجرد الوصول إلى نسبة العتبة التقريبية للعذارى ، صب محتويات كل مقلاة من خلال غربال (حجم 20-40). استخدم زجاجة ضغط من ماء الصنبور لغسل الشرانق واليرقات من الغربال إلى دورق بلاستيكي مدرج سعة 3000 مل.
   ملاحظة: يجب نقل 2-3 أحواض يرقات فقط إلى كل دورق سعة 3000 مل لتجنب الاكتظاظ حتى تصل الشرانق إلى السطح بشكل مريح. من المتوقع أن تتطور الشرانق بين 130-140 ساعة بعد فقس البيض تحت ظروف درجة الحرارة والإضاءة المذكورة في الخطوة 1.2.3. توقع فقس البيض الملحوظ في نفس اليوم الذي يتم فيه إعداد البيض. اعتمادا على الظروف البيئية ، فإن ما يقرب من 20-70 ٪ من اليرقات سوف تكون تشرنق وتكون جاهزة للغربلة في غضون 6 أيام. يضمن تقسيم الشرانق عبر أكواب زجاجية متعددة سعة 3000 مل أحجام يمكن التحكم فيها لتصب في الفاصل.
2. فصل الشرانق الذكور عن اليرقات والشرانق الإناث.
   ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة بواسطة مشغل واحد أو عاملين.
   1. لعامل واحد يفصل بين الشرانق الذكور:
      1. قسم محتويات كل دورق سعة 3000 مل تم إنشاؤه في الخطوة 2.1 إلى حاويات بلاستيكية متعددة سعة 1900 مل لتقليل الانسكاب وإثقال كاهل الفاصل. قم بإعداد فاصل اللوحة عن طريق وضع حاوية تجميع ضحلة صلبة سعة 4000 مل أسفل السد عند قاعدة الفاصل (الشكل 1). املأ كأسين زجاجيتين مدرجتين سعة 3000 مل مملوءتين بماء الصنبور.
         ملاحظة: استخدم خرطوم الحوض كبديل للأكواب البلاستيكية المتدرجة سعة 3000 مل. خلاف ذلك ، ستحتاج الكئوس الزجاجية إلى إعادة تعبئتها باستمرار طوال عملية الفصل. يمكن العثور على تفاصيل إضافية لتشغيل فاصل العذراء في المراجع^12،20.
      2. صب الماء عبر الفراغ بين الألواح الزجاجية واضبط المقابض العلوية والسفلية في اتجاه عقارب الساعة أو عكس اتجاه عقارب الساعة للسماح للمياه بالتدفق باستمرار مع توليد المياه الراكدة في نفس الوقت على ارتفاع حوالي 1.25 سم من قاعدة الألواح. ضع علامة على مواضع البداية للمقابض السفلية بشريط. بمجرد توزيع المياه الراكدة بالتساوي عبر قاعدة الألواح الزجاجية بارتفاع ومعدل تصريف متساويين ، ابدأ في صب محتويات حاويات الشرانق واليرقات عبر الفراغ بين الألواح.
         ملاحظة: يجب أن يكون هناك فصل واضح بين الشرانق الصغيرة (الذكور) والكبيرة (الأنثوية) ؛ خلاف ذلك ، اغسل هذه الدفعة من خلالها ، واضبط المقابض العلوية لتقليل المسافة بين الألواح.
      3. أثناء صب الماء ببطء من خلال الفاصل ، قم بتدوير المقابض السفلية باستمرار كزوج بطريقة عكس اتجاه عقارب الساعة ~ 1-2 سم من موضع البدء المحدد بالشريط حتى تغسل معظم اليرقات أو جميعها وتنزلق أسفل السد في حاوية التجميع.
         ملاحظة: نظرا لاستخدام يد واحدة لصب الماء ، تقوم اليد الأخرى بتدوير المقابض واحدة تلو الأخرى ، ولكن بشكل متساو وبزيادات صغيرة ، لفتح الألواح ببطء. يتم غسل معظم اليرقات بسرعة ، ولكن سيكون هناك بعض اليرقات التي يتم اصطيادها مع الشرانق الذكرية. سيتم تشعيع هذه اليرقات المتشابكة ولكنها ستتأخر في النمو ولن تقترب من البالغين مع الفوج البؤري من الشرانق.
      4. تخلص من اليرقات أو أعد تدويرها مرة أخرى إلى المستعمرة ، ولكن في كلتا الحالتين ، قم بإزالتها من حاوية التجميع قبل أن تبدأ الشرانق الذكور في الغسيل من خلال الفاصل. أوقف العملية مؤقتا عن طريق إيقاف تدفق المياه بينما يتم تنظيف حاوية التجميع الموجودة في قاعدة السد من اليرقات عن طريق سكبها من خلال غربال # 30 ، والذي يتم غسله عكسيا في حاوية منفصلة.
         ملاحظة: تتدفق اليرقات أولا ، تليها ذكور الشرانق ، وأخيرا الإناث (الشكل 1).
      5. استمر في صب الماء وتدوير المقابض السفلية حتى يتم غسل اليرقات الذكرية وفصلها في حاوية التجميع. أوقف العملية مؤقتا للتحقق من اليرقات وإزالتها من حاوية التجميع قبل نقل الشرانق الذكور في الخطوة التالية.
         ملاحظة: يعتمد عدد الهبات اللازمة لفصل الذكور على وتيرة صب الماء والسرعة التي يتم بها تدوير المقابض. عادة ما يستغرق الأمر 2000-2500 مل من الماء لطرد اليرقات ، و 1000-1500 مل لطرد الشرانق الذكور ، و 200-400 مل لطرد الشرانق الأنثوية.
      6. صب الشرانق الذكور من حاوية التجميع من خلال غربال # 20 فوق الحوض. استخدم زجاجة ضغط سعة 1000 مل من ماء الصنبور لغسل الشرانق الذكور من الغربال أثناء صبها في وعاء منفصل سعة 1900 مل.
      7. بمجرد فصل جميع الشرانق الذكور ، استمر في صب الماء من خلال الفاصل ، واضبط المقابض السفلية لتتدفق عبر الشرانق الأنثوية. انقل الإناث باستخدام عملية الغربال الموضحة في الخطوة 2.2.1.6 إلى حاوية منفصلة حتى يتم طرد جميع البعوض غير الناضج من الفاصل. تجاهل الشرانق الإناث. بمجرد معالجة الدفعة ، أعد المقابض إلى مواضع البداية الأصلية ، وكرر العملية مع الدفعة التالية. بمجرد معالجة جميع الدفعات ، اترك الألواح مفتوحة حتى يجف الفاصل.
         ملاحظة: لا يوجد فصل مثالي باستخدام هذا الجهاز ، الأمر الذي يتطلب الصبر والممارسة. يمكن إزاحة الشرانق أو اليرقات العنيدة بتدفق كثيف للمياه ، ولكن ليس إلى الحد الذي يدفعها إلى الجانبين ، مما قد يلوث الفيضانات في المستقبل.
   2. بالنسبة لعاملين يفصلان بين الشرانق الذكرية، تعدل المادة 2-2-1 على النحو التالي.
      1. المشغل الأول: صب الماء من خلال الفاصل ، وقم بتدوير المقابض بشكل تدريجي لفصل اليرقات والشرانق الذكور والشرانق الأنثوية.
      2. المشغل الثاني: بمجرد جمع كل مرحلة في حاوية السد ، قم بغربلة محتويات حاوية السد لتقسيم اليرقات والشرانق الذكور والشرانق الأنثوية إلى حاويات متعددة ومنفصلة لجمع السدود. احتفظ بالأكواب الكبيرة مملوءة بالماء في حالة عدم توفر خرطوم الحوض.

الشكل 1: فاصل العذراء يحتوي على دفعة من الزاعجة المصرية غير الناضجة. يبدأ الفصل بصب الماء من خلال الفاصل أثناء تدوير المقابض السفلية 1-2 سم عكس اتجاه عقارب الساعة حتى يتم عزل المجموعة المستهدفة ، أي اليرقات أو الشرانق الذكور أو الشرانق الأنثوية ، قدر الإمكان من المجموعات المتبقية (الصورة اليسرى). تظهر الصورة اليمنى انفصال اليرقات (الشريط السفلي) والشرانق الذكور (الشريط الأوسط) والشرانق الأنثوية (النطاق العلوي). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. تحضير ذكور الزاعجة المصرية للإشعاع

1. قسم الشرانق الذكور إلى أطباق بتري بلاستيكية 60 مم.
   ملاحظة: يعتمد عدد أطباق بتري المطلوبة على عدد ذكور الشرانق المتاحة للتشعيع: سوف تملأ مقلاة تربية اليرقات من الخطوة 1.2 حوالي 1.5 طبق بتري. يتراوح عمر الشرانق من 1 إلى 40 ساعة. في هذا البروتوكول ، يسمى النصف الأعمق ذو القطر الأصغر من طبق بتري بالقاع ، والنصف الضحل ذو القطر الأكبر يسمى الجزء العلوي.
   1. قم بإعداد أقراص مقطوعة مسبقا من ورق الترشيح لتناسب القطر الداخلي لقاع طبق بتري. ضع قرصا واحدا من ورق الترشيح المبلل بالماء في كل من قيعان أطباق بتري للحفاظ على رطوبة الشرانق طوال فترة النقل وعملية التشعيع.
   2. نقل الشرانق إلى أطباق بتري. صفي الشرانق الذكور التي تم جمعها في الخطوة 2.2.1.6 بغربال واغسل الشرانق في كأس زجاجية مدرجة سعة 1000 مل بأقل قدر ممكن من الماء. صب الشرانق بعناية في أطباق بتري حتى يتم تغطية كل قرص ورق ترشيح بالتساوي بطبقة واحدة من الشرانق (الشكل 2 أ - ج). رتب أطباق بتري على حافة طاولة متتالية لتسهيل صبها.
      ملاحظة: بديل لإجهاد الشرانق هو قص طرف ماصة باستور بلاستيكية سعة 3 مل إلى قطر كبير بما يكفي لاستيعاب الشرانق. استخدم الماصة لنقل الشرانق من الحاوية المنتجة في الخطوة 2.2.1.6 مباشرة إلى أقراص ورق الترشيح بحيث توجد طبقة واحدة معبأة بشكل وثيق من الشرانق في كل طبق بتري. هذا عملي فقط للدفعات الصغيرة.
   3. استخدم ماصة باستور سعة 3 مل غير معدلة لإزالة المياه الراكدة من قاع طبق بتري لمنع حركة العذراء أثناء خطوة الجنس (3.2) والنقل.

الشكل 2: نقل الشرانق إلى أطباق بتري للتشعيع . (أ) تسكب الشرانق المنخلة وتغسل عكسيا في كأس زجاجية بلاستيكية سعة 1000 مل. (ب) يحتفظ بأقل قدر من الماء في الكأس الزجاجية لتسهيل صبها في أطباق بتري. (ج) تصطف أطباق بتري على طول حافة السطح لتسهيل صبها في طبقة واحدة من الشرانق. (د) يتم تكديس أطباق بتري المحملة بالشرانق وتأمينها لتسليمها إلى مرفق التشعيع. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. ممارسة الجنس الشرانق للتحقق من التلوث مع الإناث. تحت نطاق التشريح ، استخدم المجسات لتدوير كل خادرة لفحص السطح البطني بحثا عن فص تناسلي كبير الحجم (الشكل 3) يشير إلى جنس الذكور. قم بإزالة وتجاهل الشرانق ذات الفصوص التناسلية الصغيرة أو الصغيرة التي تشير إلى الإناث واستبدلها بعدد متساو من الشرانق الذكور للحفاظ على العدد الصحيح.
   ملاحظة: في برنامج تشغيلي ، هذه الخطوة ليست عملية بسبب الأعداد الكبيرة من البعوض ، وحقيقة أن الفصل والنقل والإشعاع وإعداد الأقفاص بعد التشعيع تتم جميعها في يوم واحد مع وقت محدود. يمكن إجراء فحص جودة عينة من أطباق بتري المختارة ، خاصة في المراحل المبكرة من تطوير برنامج تقنية الحشرة العقيمة.

الشكل 3: جنس الشرانق باستخدام الفص التناسلي. (أ) المناظر البطنية و (ب) الجانبية للإناث () والذكور (♀ ♂) الزاعجة المصرية الشرانق ، مع الإشارة إلى الفصوص التناسلية لإظهار إزدواج الشكل الجنسي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. قم بتغطية القيعان بأسطح أطباق بتري ، وقم بتأمينها بشريط مختبري. قم بتجميع أطباق بتري المسجلة بأشرطة مرنة في أكوام بحجم يتناسب مع غرفة التشعيع ، وأغلقها داخل كيس قابل لإعادة الإغلاق سعة 3.8 لتر (الشكل 2 د). لا تسمح للعذارى بالبقاء مكشوفة لمدة >1 ساعة.

4. تشعيع ذكور الزاعجة المصرية الشرانق

1. قم بإعداد فيلم قياس الجرعات من نفس المجموعة عن طريق قطع مربعات 1 سم² من الأفلام ووضع كل مربع في مظروفه الفردي.
   ملاحظة: يتم قطع جميع الأفلام المستخدمة في كل يوم في نفس الوقت. هذا يقلل من كمية صغيرة من الاختلاف الناجم عن التخزين. عدد المربعات اللازمة لكل مكدس هو 1 + (عدد أطباق بتري).
2. قم بإعداد مجموعة لأخذها إلى مرفق التشعيع ، والتي يجب أن تتضمن مؤقتا للمختبر ، وشريطا مختبريا ، وعلامة دائمة ، ومظاريف معدة لفيلم قياس الجرعات ، وشارة قياس الجرعات ، وورقة ملاحظات مختبرية مع قوائم مرجعية لتتبع المعلومات الأساسية (الشكل 4).

الشكل 4: مخطط كتاب المختبر - ورقة الأشعة تحت الحمراء مكتملة لمجموعة استجابة الجرعة. تشير مربعات النص الموضحة باللون الأحمر (المميزة بأسهم حمراء) إلى ملاحظات مفيدة حول الأقسام المختلفة وتكرر المعلومات الأساسية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. نقل الشرانق إلى مرفق التشعيع. ضع أطباق بتري من ذكور الشرانق من الخطوة 3.3 في حاويات معزولة وخزنها بعيدا عن أشعة الشمس المباشرة ومع تكييف الهواء أثناء النقل.
4. تحضير أكوام من أطباق بتري للإشعاع في جهاز التشعيع. قم بتكديس العدد المناسب من أطباق بتري لتناسب غرفة التشعيع مع مغلف فيلم قياس الجرعات في المنتصف بين كل طبق وفي أعلى وأسفل المكدس. قم بتأمين الأظرف والمكدس بالكامل بشريط مختبر لمنع الانسكابات وتسهيل وضع المكدس في الغرفة.
5. تشعيع أطباق بتري من الشرانق الذكور. ضع كومة أطباق بتري على شبكة معدنية صلبة في الحجرة لوضعها على الارتفاع الصحيح للحصول على مخروط التعرض الأمثل بناء على رسم خرائط الجرعة السابقة لوحدة التشعيع المحددة²¹. قم بتنشيط القرص الدوار على جهاز التشعيع وتشعيعه ، مع بدء مؤقت المختبر في نفس الوقت. تشعيع للفاصل الزمني المناسب لإنجاز الجرعة المطلوبة (الأمثلة موضحة في الجدول 2).
   ملاحظة: يعتمد هذا البروتوكول على جهاز تشعيع السيزيوم 137 (انظر جدول المواد) وجرعة مستهدفة تبلغ 50 غراي. نظرا لأن Cs-137 يتحلل بمرور الوقت ، يتم ضبط معدل الجرعة كل عام عن طريق إجراء سلسلة استجابة للجرعة باستخدام مقاييس جرعات ألانين ، مكملة بفيلم راديوي كرومي لقياس الجرعات الروتيني والألانين في حوالي 10٪ من العينات المشععة. بالنظر إلى معدل الجرعة الحالي البالغ 8.8 غراي / دقيقة ، فإن تحقيق الجرعة المستهدفة البالغة 50 جراي يتطلب 5 دقائق و 41 ثانية من التعرض. يحدث قياس جرعات الفيلم الروتيني كما هو موضح في الخطوة 4.7. يتم إجراء قياس جرعات حبيبات الألانين إما في المركز الوطني لأبحاث شعاع الإلكترون في جامعة تكساس إيه آند إم أو في المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا في غايثرسبيرغ ، ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية.

الجرعة (غراي)	الوقت (على أساس 8.8 غراي / دقيقة)
0	غير متوفر
10	1 دقيقة 8 ث
30	3 دقائق و 24 ثانية
50	5 دقائق و 41 ثانية
65	7 دقائق و 23 ثانية
85	9 دقائق و 39 ثانية
100	11 دقيقة 22 ثانية
110	12 دقيقة 30 ثانية

الجدول 2: مثال على أوقات الجرعة لإشعاع السيزيوم 137.

6. بمجرد انقضاء الوقت المحدد ، قم بإزالة أطباق بتري من جهاز التشعيع ، وقم بتفكيك المكدس بعناية. قم بتسمية جميع أطباق بتري ومظاريف الأفلام بالتاريخ والموقع في المكدس. أغلق الأظرف وخزنها لقياس الجرعات. أعد تغليف أطباق بتري في الحاوية المعزولة لنقلها مرة أخرى إلى المختبر الرئيسي.
   ملاحظة: سجل ما إذا كانت البالغين قد ظهرت أثناء التشعيع وقم بتمييز طبق بتري المصاب حتى لا يهرب الشخص البالغ (البالغون) عند وضع الشرانق في أقفاص التربية (الخطوة 5.2).
7. تأكد من جرعة التشعيع باستخدام فيلم قياس الجرعات عن طريق قياس الفيلم بعد حوالي 24 ساعة من التعرض. قم بتنشيط قارئ قياس الجرعات واتركه يتوازن مع درجة حرارة الغرفة. قم بتحميل الفيلم باستخدام ملقط مرفق مع القارئ واتبع تعليمات الشركة المصنعة لقراءة الفيلم المشع وكذلك الفيلم الفارغ غير المشعع من نفس الدفعة. صفر القارئ بدون فيلم بين القراءات ، وسجل البيانات كما في ورقة بيانات المثال الموضحة في الشكل 5.
   ملاحظة: يعتمد هذا البروتوكول على معايير مجموعة عوامل تصفية ضمان الجودة ND0.5 وND1.0. من المهم قياس الفيلم بحيث يواجه الجانب غير اللامع المشغل.

الشكل 5: ورقة بيانات قياس الجرعات مملوءة بأمثلة على البيانات. تطالب عناوين الأعمدة المشغل بالتقاط البيانات الأساسية لتحليلها لاحقا. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

5. تربية ذكور الزاعجة المصرية المشععة إلى بالغين

1. تنظيف وتحضير أقفاص تربية بلاستيكية صغيرة 30 سم × 30 سم × 30 سم بحيث تكون جاهزة للعذارى المشععة عند العودة إلى المختبر الرئيسي. لكل 2 أطباق بتري من الشرانق الذكور المشععة ، قم بإعداد 1 قفص تربية. قم بتخزين كل قفص تربية بكوب بلاستيكي نصف مملوء يحتوي على 460 مل من ماء الصنبور وحاوية واحدة من محلول السكروز بنسبة 10٪ ، كما هو موضح في الخطوة 1.1.3.
2. نقل الشرانق المشععة على الفور إلى أقفاص التربية المعدة بعد العودة من مرفق التشعيع. استخدم زجاجة ضغط من الماء لغسل الشرانق بعناية من كل طبق بتري في 460 مل من الماء في الكوب البلاستيكي في كل قفص تربية. بعد 24 ساعة ، انقل الأكواب إلى أقفاص تربية جديدة ونظيفة تحتوي على مصدر التغذية ، وانتظر ما تبقى من الزاعجة المصرية البالغة المشععة.
   ملاحظة: إذا ظهرت الشرانق أثناء عملية التشعيع ، فافتح أطباق بتري مع المنشورات في قفص فارغ ، ثم تابع الخطوة 5.2. تجاهل الذكور التي تم جمعها في هذا القفص. يتم نقل الشرانق إلى أقفاص تربية جديدة بعد 24 ساعة لأن الذكور تظهر قبل الإناث من نفس الفوج وعزل أيام الظهور يمكن أن يقلل من حدوث تلوث الإناث ويضمن شيخوخة الذكور بدقة.

6. وسم ووزن الذكور الزاعجة المصرية البالغة المشععة

ملاحظة: يفترض هذا القسم من البروتوكول أن شخصين يقومان بالمهام; ل 1 شخص ، انظر 6.4.

الشكل 6: التعبئة المعلمة والمشععة والزاعجة المصرية في حاويات الإطلاق. (أ) حرر الحاوية التي تظهر مخزونا مثبتا في فتحة مقطوعة في جانب أسطوانة البطاقات بشريط لاصق ودبابيس وغراء ساخن. الإطار في مكانه مع دعامة لاصقة لاصقة مثبتة على الجانب. يحتفظ الإطار بغطاء شبكة التول المسحوبة بإحكام ؛ شريط مطاطي (غير مرئي) يثبت أيضا التول في مكانه أسفل الإطار. (ب) مجموعة من الذكور المخدرين في طور السقوط في صبغة وردية في كوب صغير من البطاقات. (ج) أربع حاويات إطلاق داخل حاوية شحن معزولة. لاحظ أن أكمام المخزون موجهة إلى منتصف حاوية الشحن ، ويتم وضع مواد التعبئة حول حاويات الإطلاق ، وتوجد مصادر التغذية والترطيب أعلى كل حاوية إطلاق مغطاة بقاع طبق بتري مقلوب مثبت بسرعة بواسطة أشرطة مرنة متقاطعة وأجزاء من الشريط. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. إعداد حاويات الإفراج عن البطاقات.
   1. اقطع فتحة قطرها 11.5 سم في جانب حاوية كرتون أسطوانية سعة 3.9 لتر بغطاء على بعد 1.5-3.0 سم من الأسفل حتى لا يتم تغطية الفتحة بالغطاء (الشكل 6 أ).
   2. قطع 40-50 سم من مخزون ، وتدبيس أحد طرفيه حول الجزء الداخلي من الفتحة 11.5 سم المقطوعة في 6.1.1. استخدم دباسة مكتبية قياسية مفتوحة بحيث يمكن دفع الدبابيس عبر المخزون والبطاقات من داخل الحاوية إلى سطح عمل مناسب مثل كتلة من رغوة البوليسترين المبثوقة الصلبة. قم بتجعيد الدبابيس باستخدام مفك براغي مسطح الرأس لتثبيت المخزون بإحكام في محيط الفتحة وربط الشريط اللاصق على الجانب المجعد لمنع العقبات. أغلق حافة المخزون الموجود داخل الأسطوانة على البطاقة بالغراء الساخن وتحقق من المجموعة بأكملها بحثا عن فتحات الهروب.
   3. قم بإنشاء إطار تثبيت عن طريق إزالة القرص الداخلي من الغطاء وقطع 33 سم × 33 سم مربع من شبكة تول النايلون الدقيقة بما يكفي للاحتفاظ بذكور البعوض Aedes aegypti البالغة. ضع الشبكة على الطرف المفتوح للأسطوانة وقم بتركيب الإطار فوق الشبكة لتثبيتها في مكانها بدون فجوات. اسحب الشبكة لأسفل بحيث تبرز أسفل الإطار لجعل الشبكة تدرس عبر الطرف المفتوح وأغلق الشبكة البارزة بإحكام على الأسطوانة بشريط مطاطي.
   4. ضع قطعة 10 سم من الشريط اللاصق على جانب الإطار مغطاة بقطعة 8 سم من شريط الملصقات بحيث يمكن استبدال شريط الملصقات بسهولة دون تمزيق الإطار.
      ملاحظة: حاويات التحرير متينة ويمكن إعادة استخدامها >10x مع التعامل السليم. قبل إدخال كل دفعة جديدة من البعوض المميز ، المشعع ، البالغ ، الذكور ، تحقق من أن المخزون متصل بإحكام بالحاوية ، وقم بإجراء الإصلاحات على الفور إذا لزم الأمر.
2. قم بإعداد محطة الوزن ووضع العلامات.
   1. صب ما يقرب من 50 ملغ من صبغة الوسم في حاوية بطاقات سعة 240 مل ، وانشر الصبغة كطبقة من المسحوق بالتساوي حول الأسطح الداخلية للحاوية. اضغط برفق للتخلص من الصبغة الزائدة. استخدم أكواب تحمل علامات واضحة لأصباغ متعددة للحفاظ على الألوان منفصلة.
   2. فارغة قارب وزن 100-500 جم على ميزان إلكتروني 0.0001 جم ؛ إنشاء نموذج بيانات (الجدول 3) ؛ وقم بلصق أربع ورقات معا من ورق نسخ مقاس 215.9 مم × 355.6 مم لعمل سطح عمل مقاس 431.8 مم × 711.2 مم.

الافراج عن الحاوية	وزن البعوض	رقم القفص	الإناث دفعة واحدة	عدد الذكور	الافراج عن الحاوية	الكتلة الكلية
الوردي الأول	0.024	D1 # 1		25	الوردي الأول	2.03
الوردي الأول	2.007	D1 # 1	7		الوردي الثاني	1.99
الوردي الثاني	1.990	D1 # 1			الوردي الثالث	2.03
الوردي الثالث	0.026	D1 # 3		25
الوردي الثالث	2.000	D1 # 3	18

الجدول 3: جدول بيانات محطة الوزن.

3. ضع علامة على دفعات كمية من الذكور البالغين المشععين بصبغة الفلورسنت.
   1. نقل البعوض البالغ (2.5-3.5 أيام) من كل قفص تربية إلى قوارير شفاط. قم بإزالة مصادر التغذية من قفص التربية من الخطوة 5.2 وضع القفص بأكمله_{في غرفة كبيرة} من ثاني أكسيد الكربون لمدة 5-7 دقائق ، مما يؤدي إلى طرق جوانب الحاوية لإزاحة البعوض الذي قد يتشبث بقفص التربية. بعد انقضاء وقت التعرض ، قم بإزالة قفص التربية من الغرفة ، واستنشاق جميع البعوض البالغ في سلسلة من قوارير الشفط البلاستيكية.
      ملاحظة: إدارة 99.5-100٪ CO₂ من خزان به منظم ، وشوكة نحاسية ، وأنابيب سيليكون يتم توجيهها إلى الغرفة بمعدل تدفق 6 لتر / دقيقة. يعتمد عدد القوارير اللازمة لإزالة قفص التربية على عدد البعوض الموجود في القفص وكفاءة المشغل ، ولكن عادة ما تكون هناك حاجة إلى 3-5 قوارير لكل قفص. اختر شفاطا يحتوي على قوارير صغيرة سريعة التغيير لتسهيل إدارة البعوض البالغ على دفعات ، على سبيل المثال ، واحدة تستخدم قارورة تجميع البوليسترين سعة 60 مل مختومة بشاشة ألومنيوم شبكية 20 × 20 من أحد طرفيها وصمام رفرف خلات شفاف من الطرف الآخر. يتم تخدير القفص بأكمله قبل الطموح لتقليل الوقت اللازم لنقل البعوض إلى قوارير لتقليل الضغط على البعوض والحفاظ على البروتوكول قابلا للسحب.
   2. فرز جميع البعوض البالغ من كل قفص تربية حسب الجنس.
      1. قم بتعريض القارورة الأولى من الخطوة 6.3.1 إلى ثاني أكسيد الكربون في غرفة صغيرة لمدة 4 دقائق ، ثم هز البعوض المخدر برفق ، وانشره عبر سطح عمل الورقة البيضاء المعد_{في الخطوة} 6.2.2.
      2. قم بتحميل قارورة فارغة جديدة في الشافطة ، واستنشاق جميع الذكور بعناية من سطح العمل ، ومرر هذه القارورة إلى محطة الوزن (الخطوة 6.3.3.). قم بإحصاء أي إناث تركت وراءها ، واستنشقها في قنينة منفصلة وتخلص منها ، جنبا إلى جنب مع أي ذكور مطحونة.
      3. كرر هذه العملية مع القوارير المتبقية من 6.3.1 ، ولكن في مرحلة ما من عملية فرز الجنس ، قم بإنشاء قارورة منفصلة بها 25 ذكرا فقط يتم تمريرها أيضا إلى محطة الوزن. كرر الخطوة 6.3.2. لكل قفص تربية.
         ملاحظة: أثناء معالجة الذكور البالغين المشععين للجنس والوزن ووضع العلامات ، تتبع عدد الإناث في كل دفعة ، وهي بيانات أساسية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وضمان جودة فرز جنس العذراء والعملية بأكملها. إذا كان عدد الإناث أعلى من المتوقع ، يجب على الشخص الثاني استخراج الإناث بينما يقوم المشغل الرئيسي بشفط الذكور. من المهم وزن عينة من 25 ذكرا من كل قفص تربية لحساب متوسط الوزن لكل بعوضة ، والتي سيتم استخدامها لتقدير أعداد الذكور المشععة التي تم إطلاقها في نهاية البروتوكول.
   3. وزن وصبغ دفعات من البعوض الذكور البالغة.
      1. في محطة الوزن، ضع القارورة الأولى من ذكور البعوض البالغة من محطة الجنس (القسم 6.3.2)_{في حجرة} صغيرة لثاني أكسيد الكربون لمدة دقيقتين، وهز البعوض بعناية في قارب وزن القطران المعد في الخطوة 6.2.2. سجل وزن البعوض وصب البعوض في كوب الصبغة المعد في 6.2.1.
      2. قم بإمالة وتدوير الكوب 1 ببطء في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة بحيث يلامس البعوض مسحوق الطلاء على الأسطح الداخلية للكوب ويتم غباره جميعا برفق بالصبغة (الشكل 6 ب). صب البعوض ملحوظ في قارب وزن.
      3. انتقل بسرعة إلى الخطوة التالية حتى لا يتعافى البعوض ويهرب. كرر هذه الخطوة حتى تتم معالجة جميع القوارير من القسم 6.3.2.
         ملاحظة: يتم تسجيل وزن الذكور من القارورة المنفصلة المكونة من 25 ذكرا لكل قفص تربية في القسم 6.3.2 واستخدامها لحساب متوسط الوزن لكل ذكر من هذا القفص.
   4. قم بتحميل حاويات الإطلاق بذكور بالغين مشعين بشكل ملحوظ. قم بطي قارب الوزن الذي يحتوي على ذكر بعوض مخدر وملحوظ ومشعع من نهاية القسم 6.3.3. لإنشاء قناة ، ثم قم بتوجيه هذه القناة من خلال غلاف Stock لنقل الذكور إلى حاوية الإطلاق. استمر في إضافة البعوض حتى يكون حوالي 2.0 جم أو 1500-3000 من ذكور البعوض في حاوية الإطلاق واربط غلاف المخزون مغلقا. ضع علامة على شريط الملصقات الموجود على إطار حاوية الإطلاق بلون الصبغة ورقم الحاوية والوزن الإجمالي للبعوض ، وانسخ هذه البيانات إلى النموذج من الخطوة 6.2.2.
      ملاحظة: التعامل مع البعوض في أي مرحلة من مراحل الحياة يؤدي إلى الإجهاد ويمكن أن يقلل من البقاء على قيد الحياة أو النشاط. يمكن أن تؤثر سلسلة التخدير الموصوفة في هذا البروتوكول على البعوض. ومع ذلك ، فإن محاولات ملاحقة واستنشاق البعوض غير المخدر في كل خطوة من شأنها أن تؤدي إلى مزيد من التوتر وبروتوكول غير مستدام. (أ) قسم الوزن الإجمالي للبعوض في كل حاوية إطلاق على متوسط الوزن لكل ذكر من البعوض المتولد في القسم 6-3-3 لاستخلاص تقدير لعدد الذكور في حاوية الإطلاق هذه؛ يجب ألا تحتوي كل حاوية إطلاق على أكثر من 2 غرام من الذكور ، وهو ما يعادل حوالي 1 قفص تربية كبير.
4. تعديلات على بروتوكول الوسم لمشغل واحد
   1. إجراء فرز الجنس لجميع الأقفاص الكبيرة أولا. تعريض كل قفص كبير لثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 4-5 دقائق وشفط جميع البعوض في 4-5 قوارير. قم بتعريض كل قارورة لثاني أكسيد_{الكربون لمدة} 2-3 دقائق ، وقم بإخراج جميع البعوض على سطح عمل الورق الأبيض ، وقم بإزالة الإناث وحصيلها ، وإعادة الذكور إلى قفصها السكاني الكبير.
   2. الوزن ووضع العلامات
      1. ابدأ بأول قفص حمل ذكر تم إنتاجه في الخطوة 6.4.1: قم بإزالة مصدر التغذية وتخدير الذكور في غرفة CO₂ كبيرة لمدة 5-7 دقائق. نضح الذكور المخدرة بالتساوي في قوارير منفصلة. كرر هذه الخطوة مع كل قفص احتجاز بالترتيب الذي تم إنتاجه به.
         ملاحظة: سيتم إنتاج ما يقرب من 2-3 قوارير مزدحمة لكل قفص. تؤدي معالجة أقفاص احتجاز الذكور بالترتيب الذي تم إنتاجها به إلى زيادة وقت الشفاء لكل قفص من الذكور.
      2. تخدير القارورة الأولى المنتجة في الخطوة 6.4.2.1. لمدة 1-2 دقيقة في غرفة CO₂ صغيرة. اسكب عددا صغيرا من البعوض على سطح عمل الورق الأبيض ، واستنشق 25 من ذكور البعوض في قنينة جديدة ، وقم بمعالجتها كما في 6.3.2 لتحديد متوسط الوزن لكل ذكر لهذا القفص. إعادة أي ذكور إضافية إلى القارورة المصدر ، أو استنشاقها في قنينة منفصلة جديدة لتتم معالجتها لاحقا ؛ تابع الوزن ووضع العلامات والنقل إلى حاويات الإطلاق لبقية الذكور في القارورة الأولى كما هو موضح في بقية الخطوة 6.3. كرر الخطوة 6.4.2.2. (باستثناء عزل 25 ذكرا في قنينة منفصلة) لبقية القوارير المنتجة في الخطوة 6.4.2.1. بالترتيب الذي تم إنتاجه به ، ثم انتقل إلى قفص التربية التالي المصنف حسب الجنس الذي تم إنتاجه في 6.4.1.
         ملاحظة: سير العمل مع شخص واحد أبطأ ، وستحتاج بعض ذكور البعوض إلى التخدير عدة مرات. البحث باستمرار عن وإزالة البعوض الإناث.

7. حاويات إطلاق التعبئة والشحن من الذكور المميزين والمشععين والبالغين Aedes aegypti

1. قم بإعداد حاويات الإفراج للشحن. بمجرد ملء حاوية الإطلاق بذكور مميزة ، ضع 4 كرات قطنية مبللة بمحلول سكروز بنسبة 10٪ على غطاء الشبكة وقم بتغطيتها بقاع مقلوب من طبق بتري مثبت في مكانه بواسطة شريطين مطاطيين ممتدين حول الحاوية بأكملها وفوق طبق بتري لتشكيل صليب. ضع قطعة من الشريط اللاصق فوق X من الشريطين المطاطيين لإبقائهما في مكانهما أعلى طبق بتري المقلوب.
   ملاحظة: تأكد من أن كرات القطن التي تحتوي على محلول سكروز بنسبة 10٪ غير مشبعة لدرجة التنقيط ، مما يؤدي إلى إتلاف الحاوية وحبس البعوض وقتله.
2. قم بتعبئة حاويات إطلاق البطاقات في مبرد شحن رغوة البوليسترين المبثوق. كزة 4 فتحات تهوية من خلال غطاء برودة وانسداد مع القطن لمنع النمل والحفاظ على البعوض هارب. ضع 4 حاويات تحرير في وضع مستقيم في مبرد الشحن بحيث تواجه مخزون كل حاوية المركز (الشكل 6C). ثني التفاف الفقاعة بين كل حاوية وفي المنتصف لتثبيتها. املأ بقية المساحة في مبرد الشحن بوسائد هوائية أو قم بتكديس طبقة ثانية من 4 حاويات تحرير مباشرة فوق الطبقة الأولى واستقر بالمثل مع الوسائد الهوائية.
   ملاحظة: يجب أن تكون حاويات التحرير مثبتة بدرجة كافية بحيث لا تتحرك عند اهتزازها. درجة الحرارة داخل العبوة محيطة.
3. قم بإعداد مبرد الشحن للتسليم. أغلق مبرد الشحن بغطاء جيد التهوية ، وضعه في عبوة من الورق المقوى ، وأغلق الشريط ، واشحنه عبر البريد السريع طوال الليل إلى موقع الإصدار.

النتائج

تتكون تربية البعوض اليقظة والكافية من توافر متوازن للذكور والإناث في أقفاص المستعمرات ، والحفاظ على محلول السكروز الطازج والعسل ، وتغذية الدم عالية الجودة باستمرار. ستوفر هذه الظروف صفائح بيض معبأة بكثافة مثالية للاستخدام في أحواض تربية اليرقات SIT. التخزين والاستخدام المناسبان لأوراق البيض المجففة ، مثل وضع العلامات المنهجية لتسهيل الاستخدام من الأقدم إلى الأحدث ، سيدعم الفقس الموحد في جميع المقالي. يمكن أن يؤدي ملء جميع أحواض تربية اليرقات بالماء قبل الفقس إلى تقليل الوقت الذي تكون فيه صفائح البيض في حاويات الفقس وتعزيز النمو الصحي. تتطلب صيانة أحواض اليرقات من الفقس إلى التشرنق مشاركة دقيقة من قبل أفراد المستعمرة حيث قد تحتاج بعض المقالي إلى طعام أكثر أو أقل أو مياه إضافية اعتمادا على مراحل التطور والمتغيرات البيئية. إذا كانت هناك مشكلات في مرحلة التطور بحلول اليوم المحدد لفصل جنس العذراء ، فيجب إجراء التعديلات في وقت مبكر من العملية مثل الفقس مبكرا أو لاحقا ، أو تعديل الطعام ، أو تغيير درجة حرارة الحاضنة.

لا تجعل عملية التربية في هذا البروتوكول جميع البيض يفقس في الوقت المناسب ليتطور إلى خادرة يمكن تشعيعها واستخدامها لأغراض المكافحة. ما بين 20 و 50٪ من البعوض الذي يتم تربيته في المستعمرة سيظل يرقات بحلول الوقت الذي تحتاج فيه الشرانق إلى الانفصال. ومع ذلك ، لا يتم تبديد هذه اليرقات ، ولكن يسمح لها بالنضوج لمدة 24 ساعة لتقديم الشرانق الإضافية التي يمكن دمجها مع الشرانق الإناث من فصل اليوم السابق وإعادة تدويرها مرة أخرى في أقفاص المستعمرات. في أقفاص المستعمرة ، سيسمح للعذارى بالنضوج لتصبح بالغين ، والتزاوج ، وتغذية الدم ، وإنتاج البيض الذي يدعم مشروع SIT.

يجب أن يحدث فصل الشرانق ، وصب الشرانق في أطباق بتري ، والإشعاع ، ووضعها في أقفاص احتجاز البالغين بعد التشعيع في يوم واحد ؛ وبالتالي ، ينبغي تخصيص وقت كاف لمعالجة جميع الخطوات بشكل مريح. يجب أن يتم تجميع وإعداد حاويات الإطلاق قبل عملية وضع العلامات. عند إرجاع صناديق الشحن من موقع الإطلاق ، يجب فحص حاويات الإطلاق وإعدادها لاستخدامها التالي. سيؤدي التخلص من كرات القطن المبللة ، وتهوية حاويات الإطلاق الرطبة ، وتنظيف أطباق بتري ، واستبدال الشبكة ، وإزالة الأربطة المرنة من الحاوية ، أثناء عدم استخدامها ، إلى إطالة عمر حاويات الإطلاق بشكل كبير.

نظرا للواقع العالمي لوباء COVID-19 الفيروسي ، تم تعديل هذا البروتوكول الذي عادة ما يكون عملية متعددة الأشخاص ليكون قابلا للتنفيذ بواسطة شخص واحد يعمل بمفرده في المختبر لكل خطوة. الخطوات في العملية التي يعوقها سيناريو شخص واحد هي خطوات صيانة الجنس ووضع العلامات والوزن وتربية المستعمرات. يجب أن يكون فصل الشرانق حسب الجنس من قبل شخص واحد كافيا إذا كانت هناك فواصل متعددة تعمل في وقت واحد في غرف مختلفة. في حالة الوباء حيث يحدث التباعد الاجتماعي في مكان العمل ، يلزم تجهيز محطات متعددة لإكمال الخطوات من الجنس إلى التعبئة. اعتمادا على سرعة المشغل ، يستغرق شخص واحد ~ 4 ساعات لممارسة الجنس 15000 بعوضة ثم 1-2 ساعة أخرى لوضع علامة عليها ووزنها وتعبئتها. يقلل سيناريو شخصين من الوقت الذي يتم فيه تخدير البعوض لوضع العلامات ويقلل من وقت العمل الإجمالي. ومع ذلك ، حتى في سيناريو شخصين ، فإن تخصيص 2.0 غرام كاملة من البعوض لكل قفص إطلاق يمكن أن يكون صعبا بسبب وقت العمل المحدود أثناء تخدير البعوض. على الرغم من أن عملية تنظيف وإعداد مواد تربية اليرقات والبالغين تستغرق وقتا طويلا للغاية وتتطلب عمالة مكثفة ، إلا أنه يمكن تقسيمها بحيث يمكن للمشغلين الفرديين العمل بشكل مستقل وآمن أثناء الوباء.

إن إطلاق سراح ذكور الزاعجة المصرية البالغة والمعلمة والمشععة يقع خارج نطاق هذا البروتوكول ولكنه معروض هنا باختصار. وتبدأ عملية إطلاق ذكور البعوض الموسومة والمشععة بتحديد توزيع موحد لإطلاق حاويات الإطلاق استنادا إلى الأوزان (وبالتالي الأعداد المستنبطة من الذكور العقيمة)، كما ورد في الجدول 3. بعد تسليم الشحنات إلى منطقة مكافحة النواقل ، يتم فتح الصناديق وتقييم حاويات الإطلاق بحثا عن أي مشاكل تتعلق بالوفيات أو حالة حاويات الإطلاق. ثم يسمح للبعوض الموجود في حاويات الإطلاق بالتأقلم مع درجة الحرارة والرطوبة المحيطة لمدة 1-2 ساعة قبل نقله إلى منطقة المعالجة. يتم تحديد مواقع الإطلاق في منطقة المعالجة بعد الترصد المكثف للبؤر الساخنة للمجموعات البرية من الزاعجة المصرية. ويوازن توقيت الإطلاقات وتواترها وكثافتها من خلال الخصائص الحيوية للأنواع فضلا عن الأرصاد الجوية والدعم العام وقدرات التربية المختبرية.

نظرا لمطابقة حاويات الإطلاق المحددة مع مواقع إطلاق معينة ، يجب فحص الملصق قبل فتح حاوية الإطلاق عن طريق قطع الشبكة الموجودة في الأعلى ، مما يسمح للمشغل بتشويه الشبكة بحيث يمكن لجزء من الذكور الهروب. تتكرر طريقة الإطلاق الجزئي هذه في كل نقطة إطلاق مخصصة للحاوية حتى يتم إطلاق جميع الذكور التي تطير بحرية. ثم تتكرر هذه العملية لكل حاوية إطلاق في موقع الإطلاق المخصص لها حتى تتم معالجة جميع الحاويات. اختياريا ، بعد إطلاق البعوض ، يمكن جمع أي بعوض ميت أو معاق لم يغادر بحرية في أطباق بتري ووضع علامات عليها ليتم عدها يدويا أو وزنها لتصحيح العدد المقدر الذي تم إطلاقه. ويجرى ترصد مستمر وواسع النطاق للمراحل البالغة والبيضية وغير الناضجة من الزاعجة المصرية البرية في المنطقة المستهدفة، وربما في مواقع المراقبة غير التدخلية، لتقييم فعالية عملية تقنية الحشرة العقيمة.

Discussion

يتطلب بدء برنامج مراقبة يتميز بتقنية الحشرة العقيمة التي تستخدم الإشعاع إنشاء سلالة محلية من الزاعجة المصرية. هذه الخطوة حاسمة ويمكن أن تسمح لتقنية الحشرة العقيمة بتمييز نفسها حقا عن تقنيات التحكم المماثلة. من خلال تطوير المشروع من سلالة محلية من البعوض ، من المحتمل أن يكون للذكور المتولدة سلوكيات تسمح لها بالتكيف مع التغيرات والإشارات البيئية وتحديد موقع الإناث البرية والتزاوج معها في المنطقة المجاورة. وعلاوة على ذلك، فإن إطلاق الذكور المحليين المشععين قد لا يولد رأيا عاما سلبيا مقارنة بإطلاق سلالة غير محلية من البعوض المعدل وراثيا يمكن، على سبيل المثال، إدخال أليلات جديدة في أسراب البعوض المحلية.

إن إنفاق موارد كبيرة لتربية كميات هائلة من البعوض فقط لتكون قادرة على استخدام حوالي نصفها لأغراض المكافحة هو أحد قيود برنامج الزاعجة المصرية . يجب إجراء تحسينات على بروتوكول التربية لتكثيف نضوج اليرقات في أطر زمنية أكثر تحديدا عندما تكون الشرانق جاهزة. هذا من شأنه أن يسمح بجمع المزيد من الشرانق في الوقت الأمثل للفصل. ومع ذلك ، فإن الشرانق الإضافية للمعالجة تزيد من خطر تشرنق المزيد من الإناث عند جمع الشرانق وبالتالي زيادة احتمالية أن ينتهي الأمر بالإناث في أطباق بتري مع الذكور وربما يتم إطلاقها. على الرغم من انخفاض العمر الافتراضي وسلوك التغذية بالدم وسلوك وضع البيض في إناث Aedes aegypti الشرانق المشععة عند البالغين ، إلا أنه ليس من الجيد إطلاق الإناث بالمصادفة جنبا إلى جنب مع الذكور المشععين²². لذلك ، يجب أن تظل الأولوية لتقليل عدد الإناث المنفصلات عن غير قصد ، والإشعاع ، ووضع العلامات ، وإطلاق سراحهن مع الذكور.

يعتمد نجاح برنامج تقنية الحشرة العقيمة في نهاية المطاف على المنافسة الناجحة بين الذكور الذين يتم تربيتهم في المستعمرات ويتعرضون للإشعاع. يعتمد الحفاظ على القدرة التنافسية للذكور على الاختيار الشامل المشتق تجريبيا للجرعة وتعظيم النسبة المقدرة للذكور العقيمة: البرية في السكان. يتم تحديد اختيار الجرعة من خلال عدة عوامل رئيسية تشمل طول العمر والخصوبة والخصوبة ووفيات العذراء. وقد لوحظ أن ذكور البعوض ستظهر منحنى خصوبة مقارب يقترب من الصفر مع زيادة الإشعاع (KJL ، RLA ، SCB بيانات غير منشورة). في الوقت نفسه ، يتناقص طول عمر البعوض الذكور ومستويات النشاط بشكل كبير مع زيادة جرعة الإشعاع (KJL ، RLA ، SCB البيانات غير المنشورة). لذلك ، بدلا من تحديد جرعة تنتج عقما بنسبة 99.9٪ عند الذكور ، يفضل التركيز على نسبة عقم أقل مع دعم البقاء على قيد الحياة. وبمجرد تحديد نطاق جرعة لا يفرق بين طول العمر أو وفيات العذراء للذكور المشععين والذكور غير المشععين، ينبغي إجراء تقييمات إضافية للخصوبة لتحديد الجرعة التي تجعل الذكور عقيمة بشكل كبير، ولكنها تنافسية.

وفي الوقت نفسه، من الأهمية بمكان مقارنة عدد ذكور البعوض في السكان بعدد الذكور المشععة التي تم إطلاقها. يمكن تحقيق ذلك عن طريق جمع الذكور من مواقع مختلفة في منطقة الإطلاق المستهدفة وحولها بشكل متكرر من نفس الموقع وقبل وأثناء وبعد بدء برنامج تقنية الحشرة العقيمة. يجب إجراء دراسة العلامة والإطلاق والاستعادة لتقييم نسبة ذكور البعوض البري إلى البعوض الذي تم إطلاقه. تعتمد دراسة العلامات والإطلاق وإعادة الالتقاط على إطلاق عدد معروف من البعوض المميز من نقطة معينة وإعادة التقاطها لاحقا في نقاط قريبة تحيط بنقطة الإطلاق الأولية. من خلال مقارنة عدد الذكور المعاد أسرها والذكور البرية على مسافات من نقطة الإطلاق ، من الممكن تقدير السكان البرية العامة للذكور في المنطقة بحيث يمكن إطلاق نسب تنافسية من الذكور العقيمة²³. تعظيم نسبة العقيمة: يمكن تحقيق الذكور البرية عن طريق إطلاق المزيد من الذكور العقيمة و / أو عن طريق تقليل عدد السكان البرية عن طريق وسائل التحكم الكلاسيكية مثل تقليل المصدر أو التحكم غير الناضج أو علاجات مبيدات البالغين.

لقياس فعالية إطلاقات الذكور العقيمة ، يمكن مقارنة مجموعات البالغين زمنيا مع منطقة عدم التدخل. مع إطلاق الذكور العقيمة وتناقص عدد الذكور والإناث التي تم جمعها في منطقة ما فيما يتعلق بمنطقة مماثلة غير تدخلية ، فقد يفترض أن ذلك يرجع إلى أن الذكور العقيمة التي تم إطلاقها تفوقت بنجاح على الذكور الخصبة المحلية. يمكن ملاحظة هذا التأثير أيضا في أكواب مصيدة وضع البيض المنتشرة في كل من مواقع التدخل وعدم التدخل. قد لا يزال يتم إنتاج البيض في موقع التدخل ، ولكن إذا كان عدد الفقس أقل من تلك الموجودة في موقع عدم التدخل ، فقد يفترض أنه لم يتم تخصيبه بسبب تزاوج الإناث مع الذكور العقيمة. يمكن أن يؤدي المزيد والمزيد من وضع البيض للبويضات غير المخصبة في النهاية إلى تقليل وضع البيض بسبب عدم استبدال الإناث في موقع التدخل ^8,24.

تتوسع الاتجاهات المستقبلية لتكنولوجيا وبرامج تقنية الحشرة العقيمة بشكل طبيعي إلى أنواع إضافية من البعوض مهمة طبيا. على سبيل المثال ، يمكن تكييف هذه التكنولوجيا بسهولة للتحكم في الزاعجة المرقطة ، بالنظر إلى علم الأحياء المتشابه جدا ل Aedes aegypti و Aedes albopictus. تشمل أنواع البعوض الأخرى الناقل للأمراض ذات الأهمية Culex quinquefasciatus و Culex tarsalis وأنواع Anopheles المختلفة. يعتمد تحسين فعالية هذه التكنولوجيا على زيادة قدرة الشرانق الذكور المنتجة في وقت معين ، والتي يمكن تحقيقها من خلال التلاعب الجيني أو الانتقاء الاصطناعي ، وتحسين القدرة التنافسية للذكور ، والتي يمكن تحقيقها عن طريق زيادة الفحولة أو الخصوبة أو طول العمر.

في نهاية المطاف ، برامج SIT ليست رصاصة فضية للسيطرة على البعوض. إنها بدلا من ذلك أداة في مجموعة من تقنيات التحكم الأخرى ، مثل برامج IVM ، التي تعوض عن نقاط الضعف بين التقنيات. فعلى سبيل المثال، في حين أن المكافحة الكيميائية توفر مراقبة سريعة ورخيصة، فإنها تعزز أيضا تطور المقاومة والوفيات غير المستهدفة؛ وعلى الرغم من أن تقنية الحشرة العقيمة خاصة بالأنواع ومن غير المحتمل أن تولد مقاومة، يجب إنتاج ذكور تقنية الحشرة العقيمة وإطلاقها إلى الأبد للسيطرة على المجموعات المهاجرة من خارج منطقة مكافحة النواقل.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-1/8" wrench (1" (1 inch) = 2.54 cm)	Craftsman	CMMT44707
1/2 pint cardstock cup (1/2 pint = 236.5 mL)	Science Supplies WLE corp	1/2 pint
1/4" tubing - tygon	Hudson Extrusions	LLDPE1/8 X 1/4 BLK	to attach to CO2 gas regulator
1/8" brass barb w/ MIP connection	B&K	BHB-85NLB	to attach to CO2 gas regulator
1000 mL graduated plastic beakers with handle	Thermo Scientific	1223-1000
3000 mL graduated plastic beakers with handle	Thermo Scientific	1223-3000
Adult large cage	Bioquip	1450D
Aspirator vials	Bioquip	2809V
Bovine liver powder	MP Biomedicals	290039601
Brewers yeast	MP Biomericals	02903312-CF
CO2 regulator	Randor	64003038
CO2 tank (20# canister)	Praxair	CDBEVCARB20
Collection basin	Treasure Gurus	KI-ENAMELBOWL	for separator
Cotton balls - large	Fisher Scientific	22-456-883
Deli cups w/lids - 470 mL	Pactiv DELItainer	PCTYSD2516
Deli cups w/lids - 1900 mL	Berry Global	T60764
DoseReader 4			ND0.5 and ND1.0 QA Filter Set standards
Dosimetry film	Far West Technology, Inc.
Filter paper	Millipore	AP10045S0
Flashlight aspirator	Bioquip	2809D
Forceps - fine featherweight	Bioquip	4748 or 4750	featherweight
GAFchromic			radiochromic film
Gammator M	Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ		Cesium-137 irradiator
Hand held mechanical aspirator	Clarke Mosquito	13500
Lambskin condoms	Trojan	Naturalamb
Large CO2 chamber	Sterilite	Walmart # 568789514
Larval rearing pans	Blue Ridge Thermoforming	01-FG-400-3N-ABS	Dimensions: 22.375 x 17.5 x 3 (inches)
Magnets - 20# pull	Master magnetics	MHHH20BX
Marking dye	Dayglo	ECO-11	Aurora Pink
Marking dye	Dayglo	ECO-17	Saturn Yellow
Mesh	Falk		T301
Pasture pipettes	Thermo Scientific	02-708-006
Petri dishes - large	VWR International	25384-090 CS
Petri dishes - small (60 mm x 15 mm)	Fisher Brand	FB0875713A
Pupa separator	J.W. Hock	1512
Red rubber hose	Welch	331040-5
Release containers	Science Supplies WLE corp	1 gallon
Rubber bands - cross #19	Alliance	ALL37196
Rubber bands - latitude #64	Skillcraft	NSN0589974
Scale	Ohaus	H-4737
Seed germination paper - Heavy stock 76#	Anchor Paper	#76
Shipping coolers- 16 x 13 x 12.5"	MrBoxonline.com	Husky Foam Cooler kit
Sieve #20	Advantech	20BS8F
Sieve #30	Advantech	30BS8F
Small cage - Bug Dorm	MegaView	Bug Dorm-1
Small CO2 chamber	Mainstays	Walmart # 562922221
Souffle cup lid	SOLO	41165277456
Souffle cups - 4 oz (1 oz = 29.6 mL)	SOLO	41165024104
Sponge	ocelo	MMM7274FD
Squeeze bottle	Dynalon	3UUP6
Stereoscope	Meiji Techno	EMZ-5
Stockinette	BSN Medical	30-1006
Styrofoam			extruded polystyrene foam
Tropical fish flake food	Tetra	4.52 pound
Vaccum chamber - desiccator	BelArt	T9FB892757
Weigh boats	Globe Scientific	3621