Işınlanmış ve İşaretlenmiş Erkek Aedes aegypti Sivrisineklerinin Operasyonel Steril Böcek Tekniği Programında Salınıma Hazırlanması

Özet

Steril böcek tekniği (SIT), kimyasal kontrollere dirençli olabilecek spesifik, tıbbi açıdan önemli sivrisinek popülasyonlarını kontrol etmek için kullanılır. Burada, Aedes aegypti sivrisineğini hedef alan operasyonel bir SIT programında salınmak üzere steril erkek sivrisineklerin kitlesel olarak yetiştirilmesi ve hazırlanması yöntemini açıklıyoruz.

Özet

Dang humması, Zika ve chikungunya gibi insan hastalıklarının kontrolü, vektörleri Aedes aegypti sivrisineğinin kontrolüne dayanır, çünkü önleme yoktur. Sivrisinek vektörlerinin kontrolü, olgunlaşmamış ve yetişkin aşamalara uygulanan kimyasallara güvenebilir, bu da hedef olmayanların mortalitesine katkıda bulunabilir ve daha da önemlisi, vektörde böcek ilacı direncine yol açabilir. Steril böcek tekniği (SIT), canlı olmayan yavrular üretmek için vahşi dişilerle çiftleşen sterilize yetişkin erkeklerin salınması yoluyla haşere popülasyonlarını kontrol etmenin bir yöntemidir. Bu makalede, Aedes aegypti sivrisineklerinin kontrolü için operasyonel bir SIT programında kullanılmak üzere steril erkeklerin üretilmesi süreci açıklanmaktadır. Burada özetlenenler, bir koloninin yetiştirilmesi ve sürdürülmesi, erkek ve dişi pupaların ayrılması, yetişkin erkeklerin ışınlanması ve işaretlenmesi ve Aedes aegypti erkeklerinin salınım bölgesine gönderilmesi dahil olmak üzere programda kullanılan adımlardır. Ayrıca prosedürel uyarılar, program sınırlamaları ve gelecekteki hedefler de tartışılmaktadır.

Giriş

Sivrisinek kaynaklı patojenlerin insanlara bulaşması, dünya çapında her yıl milyonlarca hastalık ve ölüm vakasına neden olmaktadır. Zika veya dang humması gibi sivrisinek kaynaklı hastalıklar için etkili, onaylanmış aşıların yokluğunda, bulaşmayı azaltmanın en etkili yollarından biri, hastalık vektörü sivrisinek popülasyonlarını azaltmaktır. Geleneksel olarak pestisitler tarafından hedeflenen artan sayıda sivrisinek türü, artan düzeyde pestisit direnci sergilemektedir¹. Aynı zamanda, devlet kurumları daha önce onaylanmış pestisitlerin kayıtlarını agresif bir şekilde sildi veya yasakladı ve birkaç yeni, etkili kimyasal kontrol önlemi geliştiriliyor ^2,3. Sivrisinek kontrolünün önündeki engellerin bu takımyıldızı, sivrisinek popülasyonlarını azaltmak için alternatif kimyasal olmayan tekniklerin araştırılmasını motive etmiştir.

Bazı sivrisinek türleri, direnç ve pestisit kaydı konularını kontrol etmek için zorluklar ortaya koymaktadır. Aedes aegypti (L.), bu türün olgunlaşmamış gelişim ve yetişkin istirahati için yararlandığı şifreli peri-yerli habitat nedeniyle geleneksel entegre vektör yönetimi ile kontrol edilmesi son derece zor olan belirgin bir hastalık-vektör sivrisineksidir ^4,5. Konutların etrafındaki şifreli habitatın sömürülmesiyle ilgili zorluklar arasında, pestisit püskürtme teknikleriyle bu yerlere ulaşmanın zorluğunun yanı sıra, halk sağlığı vektör kontrol kurumlarının bu tür için etkili entegre vektör yönetimi (IVM) için çok önemli olan yoğun gözetim ve kontrol faaliyetlerini yürütmeleri için özel mülkiyete tekrar tekrar erişim için halk tarafından potansiyel olarak kabul edilmemesi yer almaktadır.

Neyse ki, diğer son derece zorlu böcek türlerinin^6'nın kalıcı kontrolü için başarılı olduğu kanıtlanmış bir yaklaşım olan SIT, Florida, St. Augustine'de (KJL, RLA, SCB yayınlanmamış veriler) bulunan çığır açan bir dizi deney ve operasyonel denemede Aedes aegypti problemine uygulanmaktadır. SIT, sivrisinekler de dahil olmak üzere bir dizi böcek türüne uygulanmış ve ^7,8 derinlemesine gözden geçirilmiştir. SIT, sterilize edilmiş koloni tarafından yetiştirilen erkeklerin kitlesel salınımından yararlanır, örneğin, iyonlaştırıcı radyasyona veya kimyasallara maruz kalarak, kadınların doğal popülasyonlarının eş seçimini ezmek için. Vahşi dişilerle çiftleşen sterilize erkekler, erkek gametlerin uğradığı hasar nedeniyle yumurtaları kısır hale getirir ve yeterli sayıda mevcutsa, teorik olarak doğal Aedes aegypti popülasyonunu çökertebilir.

Atlantik kıyısı Florida'daki bir kentsel alanda Aedes aegypti popülasyonlarını azaltmaya çalışmak için bir SIT programı başlatıldı ve bu türün yakın zamanda yeniden kolonileştiği ve Zika, dang humması veya chikungunya gibi virüslerin bulaşması için halk sağlığı riski oluşturduğu ve genişlediği ve sunduğu görülüyor. Vahşi dişilerle uyumluluk potansiyelini en üst düzeye çıkarmak için,⁹ programı için erkek üretmek üzere hedef popülasyondan vahşi yakalanmış Aedes aegypti kullanılarak yeni bir koloni kuruldu. Bu, yerel olarak türetilmiş, koloni tarafından yetiştirilen erkeklerin, yerel vahşi dişilerle çiftleşmek için yerel vahşi erkeklerle rekabet etme olasılığının daha yüksek olacağı hipotezine dayanıyordu. SIT'in etkili olması için, hedef bölgede sadece çok sayıda steril erkeğin bulunması gerekmez, aynı zamanda yerel vahşi dişi sivrisineklerle etkili bir şekilde kur yapma ve çiftleşme yeteneğine sahip olmaları gerekir.

Serbest bırakılacak en uygun steril erkek sayısını (KJL, RLA, SCB yayınlanmamış veriler) ve ayrıca vahşi dişilerin hayatta kalmasına, davranışına veya kabulüne müdahale etmeden erkekleri kısır hale getirecek optimal radyasyon dozlarını belirlemek için bir dizi deney yapılmıştır (KJL, RLA, SCB yayınlanmamış veriler). Bu veriler bu grubun müttefik yayınlarında ortaya çıkıyor, ancak bu bulguların bazıları bu protokolde de yakalanıyor ve başka yerlerde yeni SIT Aedes aegypti kontrol programları için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir. Bu tür sürekli olarak yelpazesini genişletiyor ve SIT programları bu popülasyonu kontrol etmek için uygun maliyetli, uzun vadeli çözümler olma konusunda büyük umut vaat ediyor. Bu protokolün amacı, operasyonel bir halk sağlığı vektör kontrol programında yerel Aedes aegypti popülasyonlarının doğal üreme döngülerini bozmak için dış alanlara sistematik olarak salınmak üzere sterilize edilmiş, erkek, koloni tarafından yetiştirilen Aedes aegypti sivrisinekleri üretmektir.

Transgenik Aedes aegypti erkeklerinin üretimi için benzer protokoller ve iş akışları ve Aedes SIT veya Wolbachia tabanlı uyumsuzluk programları için üretim iş akışları başka yerlerde yayınlanmış olsa da, bu protokol mevcut protokollerin Aedes aegypti üretimi, erkek pupalarının ayrılması ve ışınlanması, yetişkin erkeklerin işaretlenmesi ve paketlenmesi ve bu program için yayın alanına gönderilmesi için nasıl uyarlandığını göstermektedir ^9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Bu protokolün işaretleme bileşeni, olgun bir operasyonel SIT programında gerekli olmayabilir; ancak, SIT programının kurulmasının ilk yıllarında tüm sürecin etkinliğini izlemenin ve kalitesini kontrol etmenin bir yolu olduğu için buraya dahil edilmiştir. Sivrisinek kontrol programları tipik olarak yerel yetkililer tarafından yürütülür, bu nedenle yerel başarıyı en üst düzeye çıkarmak için kuruluşlarının büyüklüğü ve finansman tabanından kontrol taktiklerini ayarlamaya kadar birçok yönüyle geniş ölçüde değişebilirler. Bu nedenle, burada açıklanan protokol mevcut kaynaklarla uyumluluk açısından değerlendirilmelidir.

Protokol

NOT: Bu protokol Aedes aegypti'nin işlenmesine özgüdür, ancak diğer sivrisinek türleri için etkili olacak şekilde değiştirilebilir.

1. Bir Aedes aegypti kolonisinin üretimi ve bakımı

1. Arka yetişkin Aedes aegypti ve yumurta üretir.
   1. 0,6 m x 0,6 m x 0,6 m katlanabilir, alüminyum çerçeve, 20 x 20 fiberglas örgü elemeli büyük yetiştirme kafesi ve bir dikey duvarda uzanma stoğu manşonu hazırlayın.
   2. Her yetiştirme kafesine Aedes aegypti pupa (1: 1 cinsiyet oranı) içeren 1900 mL'lik bir plastik küvet yerleştirin, manşonu kapalı bağlayın ve daha fazla yetişkin ortaya çıkmayana kadar (yani yaklaşık 4 gün) eclosion için bardakları yerinde bırakın. Bu zamanda, bardakları çıkarın ve yetişkin yetiştirme kafeslerini 28-30 ° C'de,% >50 bağıl nemde (Rh) ve 12: 12 veya 14: 10 açık: karanlık (L: D) döngüsünde tutun.
      NOT: Aedes aegypti pupalarının üretimi bölüm 1.2'de açıklanmıştır. 1900 mL küvetteki pupaların yoğunluğu, tüm pupaların aynı anda havaya çıkması için yeterli alan olacak şekilde olmalıdır.
   3. Pupa yetiştirme kafeslerine yerleştirildikten yirmi dört saat sonra, bir sünger fitili ile% 10 sakkaroz çözeltisinden oluşan bir kap yerleştirin ve yetişkin sivrisineklere ayrı hidrasyon ve beslenme kaynakları sağlamak için her kafesteki bir tel kancadan bala batırılmış 10 cm x 2 cm'lik bir süngeri askıya alın. Süngerleri ve sakkaroz kabını kuruluk veya küf büyümesi açısından izleyin ve gerektiğinde yenileyin veya değiştirin.
      NOT: Küçük yetiştirme kafeslerinde kapaktaki bir kesikten geçirilmiş 10 cm x 2 cm sünger fitilli 120 mL'lik bir plastik bardak ve büyük kafeslerde 12 cm x 8 cm sünger fitilli 460 mL plastik bardak kullanın.
   4. Yetişkinlerin çoğunluğu ortaya çıktıktan 48-72 saat sonra ve bundan sonra her 2-3 günde bir, yumurta verimini en üst düzeye çıkarmak için yüksek sayıda kanla beslenen dişi tutmak için her yetiştirme kafesine bir kan unu verin. Bir kuzu derisi prezervatifini 50-100 mL defibrinlenmiş sığır kanı ile doldurun ve sıcak su banyosunda yaklaşık 37 ° C'ye kadar ısıtın. Ardından, prezervatifi 30-60 dakika boyunca kafesin içindeki kağıt kaplı bir Petri kabına yerleştirmeden önce patlatmak ve kısmen kurutmak için bir bez veya kağıt havlu kullanın.
      NOT: Kullanmadan önce, yağlayıcıları veya diğer substratları çıkarmak için her prezervatifin içini ve dışını suyla 2-3x durulayın ve delikleri kontrol edin. Prezervatifler, kanı durulayarak ve bir bardak soğuk suda saklayarak 3-5 besleme için tekrar kullanılabilir. Bazı koloniler karınca istilası yaşayabileceğinden, erişimi sınırlamak için prezervatiflerin askıya alınması gerekebilir.
   5. Her kan beslemesinden sonra 48-72 saat bekleyin ve ardından her yetişkin yetiştirme kafesine bir yumurtlama kabı yerleştirin. Yumurtlama kaplarını, 200 mL filtrelenmiş pupa suyu (yani, su larvaları ve pupalar yetiştirildi) ekleyerek, bardağın iç çevresi boyunca hizalı olarak yerleştirilmiş 8-10 cm yüksekliğinde x 30 cm genişliğinde bir tohum çimlenme kağıdı (yumurtlama kağıdı) ile döşenmiş plastik bir 460 mL bardağa ekleyin. Yumurtlama kağıtlarını günlük olarak kontrol edin, her 2-4 günde bir değiştirin ve yumurta yüklü yumurtlama kağıtlarını% >50 Rh^19'da 24-48 saat kurumaya bırakarak dikkatlice saklayın.
      NOT: Yumurtaların yumurtadan çıkmasını önlemek için yumurtlama kaplarını yetiştirme kafeslerinde en fazla 72 saat bekletin.
   6. Yetişkin yetiştirme kafeslerini, parçalamadan ve yeni yetişkin yetiştirme kafesleri kurmadan önce 3-4 haftaya kadar koruyun.
      1. Bir yetiştirme kafesini parçalamak için, yumurtlama kabını çıkarın ve temizleyin, yumurta yüklü yumurtlama kağıdını saklayın, sakkaroz çözeltisi kabını ve bal süngerini çıkarın ve temizleyin ve tüm sivrisinekleri öldürmek için kafesi dondurun.
      2. Tüm sivrisinek gövdelerini çıkarın ve kağıt havlular ve süngerli ovma pedleri kullanarak her kafesin içini ve dışını seyreltilmiş sabun ve suyla iyice temizleyin. Bir sonraki yetiştirme döngüsünde kullanmadan önce temiz kafesin en az 24 saat kurumasını bekleyin.
         NOT: Alerjiye yol açabilecek partikülleri gidermek için yüksek verimli filtreleme ile donatılmış vakum ekipmanı kullanın. Sakkaroz çözeltisi kapları 3-5x temizlenebilir ve tekrar kullanılabilir.
2. Aedes aegypti larvalarının yumurtadan yetiştirilmesi
   1. 80 g 3: 2 oranında sığır karaciğeri tozu: bira mayasını 2200 mL musluk suyunda karıştırarak larva besin bulamacı stoğu hazırlayın. Toz haline getirilmiş balık yemi hazırlayın. Balık gevreğini bir baharat öğütücüye dökün ve ince bir toz haline gelene kadar öğütün.
      NOT: Bu bulamaç bu laboratuvarda kahverengi olarak belirlenmiştir.
   2. Adım 1.1.5'ten itibaren yumurta yüklü (5.000-10.000 yumurta) yumurtlama kağıdı kullanarak, yumurta kağıdının yumurtlama hattına dik 3-7 cm'lik bir kısmını kesin ve bir tutam toz haline getirilmiş balık yemi gevreği ile birlikte musluk suyuyla yarı dolu 460 mL'lik bir kaba yerleştirin. En az 1 dakika boyunca kuvvetlice örtün ve çalkalayın.
      NOT: Yumurta kağıdı, embriyonasyona izin vermek için kuluçka işlemine başlamadan önce yumurtlama sonrası en az 7 gün (ancak kuluçkayı azaltabilecek 90 günden fazla olmamalıdır) saklanmalıdır. Balık yeminde bulunan bakteri ve algler, larva gelişimini tetikleyen suyu hızla oksijensizleştirir.
   3. Kabın tüm içeriğini adım 1.2.2'den 3 L musluk suyu ve 50 mL kahverengi bulamaç ile hazırlanmış bir larva yetiştirme tavasına dökün. Tavayı başlangıç tarihi, gerinim bilgileri, Tablo 1 başına besleme programı ile işaretleyin ve 28-30 °C, %>50 Rh ve 12:12 veya 14:10 L:D'de saklayın devir.
      NOT: 3 L suya 50 mL kahverengi oranı, Malzeme Tablosunda belirtilen belirli larva tavalarındaki suyun derinliğine dayanmaktadır. Farklı boyuttaki tavalar farklı pupa yoğunluklarını destekleyecek ve bu nedenle farklı miktarlarda su ve kahverengi bulamaç gerektirecektir. Tablo 1'de larva besleme oranları aralık olarak verilmiştir; kullanılan miktarın seçimi, su bulanıklığı, renk ve koku gibi değişkenleri kullanarak gelişmekte olan larvaların genel sağlığının deneyimine ve belirlenmesine dayanır; su üzerinde bakteriyel film varlığı; canlı ve ölü larvaların sayısı veya oranı; ve larvaların hareketliliği. 3 ila 6. günlerde, olgunlaşmamış sivrisinekleri Tablo 1'e göre toz haline getirilmiş balık yemi ile besleyin. Su eklemek, yiyecekleri azaltmak ve projenin gerektirdiğinden 2-3 ekstra tava kurmak, sağlıksız larva tavalarını yönetmenin yollarıdır.

Gün	Hacim besleme bulamacı eklendi	Hacim suyu eklendi	Eylemler
1	50 mL (bulamaç)	3000 mL
2	(yemek yok)	(su yok)
3	1/4 - 1/2 çay kaşığı (toz haline getirilmiş balık yemi)	500-1000 mL
4	1/2 - 3/4 çay kaşığı (toz haline getirilmiş balık yemi)	500-1000 mL
5	1/2 - 3/4 çay kaşığı (toz haline getirilmiş balık yemi)	500-1000 mL
6	1/4 - 1/2 çay kaşığı (toz haline getirilmiş balık yemi)	500-1000 mL
7	(yemek yok)	(su yok)	pupaları ve larvaları suşlar

Tablo 1: Aedes aegypti larvalarının toplu yetiştirilmesi için beslenme programı.

2. Erkek Aedes aegypti pupalarının ayrılması

1. Larva tavalarından pupaları konsantre edin. Pupaların yaklaşık eşik oranına ulaşıldığında, her bir tava içeriğini bir elek (boyut 20-40) içinden dökün. Pupa ve larvaları elek içinden 3000 mL dereceli plastik bir beherde yıkamak için bir şişe musluk suyu sıkın.
   NOT: Pupaların yüzeye rahatça ulaşabilmesi için aşırı kalabalıklaşmayı önlemek için her 3000 mL beherine sadece 2-3 larva tavası aktarılmalıdır. Pupaların, adım 1.2.3'te belirtilen sıcaklık ve ışık koşulları altında yumurtadan çıktıktan sonra 130-140 saat arasında gelişmesi beklenmektedir. Yumurtaların kurulduğu gün gözle görülür bir yumurta kapağı bekleyin. Çevre koşullarına bağlı olarak, larvaların yaklaşık% 20-70'i yavrulanmış olacak ve 6 gün içinde elenmeye hazır olacaktır. Pupaların birden fazla 3000 mL beherde bölümlenmesi, separatöre dökülebilecek yönetilebilir hacimler sağlar.
2. Erkek pupaları larvalardan ve dişi pupalardan ayırın.
   NOT: Bu adım bir operatör veya iki operatör tarafından gerçekleştirilebilir.
   1. Erkek pupaları ayıran tek bir operatör için:
      1. Adım 2.1'de üretilen her bir 3000 mL beherin içeriğini, dökülmeyi ve separatörün aşırı yüklenmesini azaltmak için birden fazla 1900 mL plastik kaba bölün. Plakalı separatörünü, separatörün tabanındaki savağın altına sert sığ 4000 mL toplama kabı yerleştirerek hazırlayın (Şekil 1). Musluk suyuyla dolu iki adet 3000 mL dereceli plastik beheri yaklaşık 3/4 doldurun.
         NOT: 3000 mL plastik dereceli beherlere alternatif olarak bir lavabo hortumu kullanın. Aksi takdirde, beherlerin ayırma işlemi boyunca sürekli olarak yeniden doldurulması gerekecektir. Pupa separatörün çalıştırılması için ek ayrıntılar^{referans 12,20'de} bulunabilir.
      2. Cam plakalar arasındaki boşluktan su dökün ve üst ve alt düğmeleri saat yönünde veya saat yönünün tersine ayarlayarak suyun sürekli olarak akmasını sağlayın ve aynı anda plakaların tabanından yaklaşık 1,25 cm yüksekliğe kadar ayakta duran su üretin. Alt düğmelerin başlangıç konumlarını bantla işaretleyin. Ayakta duran su, cam plakaların tabanı boyunca eşit yükseklikte ve drenaj hızıyla eşit olarak dağıtıldıktan sonra, pupa ve larva kaplarının içeriğini plakalar arasındaki boşluktan dökmeye başlayın.
         NOT: Küçük (erkek) ve büyük (dişi) pupalar arasında net bir ayrım bulunmalıdır; aksi takdirde, bu toplu işi yıkayın ve plakalar arasındaki boşluğu azaltmak için üst düğmeleri ayarlayın.
      3. Separatörden yavaşça su dökerken, alt düğmeleri bant işaretli başlangıç konumundan saat yönünün tersine ~ 1-2 cm mesafede, larvaların çoğu veya tamamı yıkanana ve savağı toplama kabına kaydırana kadar sürekli olarak bir çift olarak döndürün.
         NOT: Bir el su dökmek için kullanıldığından, diğer el plakaları yavaşça açmak için düğmeleri birer birer döndürür, ancak eşit olarak ve küçük artışlarla döndürür. Çoğu larva hızla yıkanır, ancak erkek pupalarla yakalanan bazı larvalar olacaktır. Bu başıboş larvalar ışınlanacak, ancak gelişimde gecikecek ve pupaların fokal kohortu olan yetişkinlere yakın olmayacaktır.
      4. Larvaları koloniye geri atın veya geri dönüştürün, ancak her iki durumda da, erkek pupalar ayırıcıdan yıkanmaya başlamadan önce bunları toplama kabından çıkarın. Savağın tabanındaki toplama kabı, ayrı bir kaba geri yıkanan #30 elek içinden dökülerek larvalardan temizlenirken, su akışını durdurarak işlemi duraklatın.
         NOT: Larvalar önce akar, ardından erkek pupalar ve son olarak dişiler (Şekil 1).
      5. Erkek larvalar yıkanana ve toplama kabına ayrılana kadar su dökmeye ve alt düğmeleri döndürmeye devam edin. Bir sonraki adımda erkek pupaların transferinden önce larvaları toplama kabından kontrol etmek ve çıkarmak için işlemi duraklatın.
         NOT: Erkekleri ayırmak için gereken kızarma sayısı, su dökme hızına ve düğmelerin döndürülme hızına bağlıdır. Larvaları temizlemek için genellikle 2000-2500 mL, erkek pupaları temizlemek için 1000-1500 mL ve dişi pupaları temizlemek için 200-400 mL su gerekir.
      6. Erkek pupaları toplama kabından bir lavabonun üzerine #20 elek ile dökün. Ayrı bir 1900 mL kaba dökerken erkek pupaları elek içinden geri yıkamak için 1000 mL'lik bir sıkma şişesi musluk suyu kullanın.
      7. Tüm erkek pupalar ayrıldıktan sonra, ayırıcıdan su dökmeye devam edin ve alt düğmeleri dişi pupalardan akacak şekilde ayarlayın. Adım 2.2.1.6'da açıklanan elek işlemini kullanarak dişileri, olgunlaşmamış tüm sivrisinekler ayırıcıdan temizlenene kadar ayrı bir kaba aktarın. Dişi pupaları atın. Toplu işlem tamamlandıktan sonra, düğmeleri orijinal başlangıç konumlarına geri döndürün ve işlemi bir sonraki partiyle tekrarlayın. Tüm partiler işlendikten sonra, separatörün kuruması için plakaları açık bırakın.
         NOT: Bu cihazı kullanarak sabır ve pratik gerektiren mükemmel bir ayrım yoktur. İnatçı pupa veya larvalar ağır bir su akışıyla yerinden çıkarılabilir, ancak onları yanlara ittiği ölçüde değil, gelecekteki su baskınlarını kirletebilir.
   2. Erkek pupaları ayıran iki operatör için, bölüm 2.2.1'i aşağıdaki gibi değiştirin.
      1. İlk operatör: Ayırıcıdan su dökün ve larvaları, erkek pupaları ve dişi pupaları ayırmak için düğmeleri kademeli olarak döndürün.
      2. İkinci operatör: Her aşama savak kabına toplandıktan sonra, larvaları, erkek pupaları ve dişi pupaları çoklu, ayrı savak toplama kaplarına bölmek için savak kabının içeriğini eleyin. Bir lavabo hortumu mevcut değilse, büyük beherleri suyla dolu tutun.

Resim 1: Bir grup olgunlaşmamış Aedes aegypti içeren pupa ayırıcı. Ayırma, hedeflenen küme, yani larvalar, erkek pupalar veya dişi pupalar, kalan kümelerden mümkün olduğunca izole edilene kadar alt düğmeleri saat yönünün tersine 1-2 cm döndürürken ayırıcıdan su dökerek başlar (soldaki resim). Sağ görüntü larvaların (en düşük bant), erkek pupaların (orta bant) ve dişi pupaların (üst bant) ayrılmasını göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Işınlama için erkek Aedes aegypti pupalarının hazırlanması

1. Erkek pupaları plastik 60 mm Petri tabaklara bölün.
   NOT: İhtiyaç duyulan Petri bulaşıklarının sayısı, ışınlama için kaç erkek pupanın mevcut olduğuna bağlıdır: 1.2. adımdan itibaren bir larva yetiştirme tavası yaklaşık 1.5 Petri kabını dolduracaktır. Pupa yaşının yaşı 1 ila 40 saat arasında değişmektedir. Bu protokolde, Petri kabının daha küçük çaplı daha derin yarısına alt ve daha büyük çaplı sığ yarısına üst denir.
   1. Petri kabı tabanının iç çapına uyacak şekilde önceden kesilmiş filtre kağıdı diskleri hazırlayın. Pupaları taşıma ve ışınlama işlemi boyunca nemli tutmak için Petri bulaşıklarının her bir tabanına bir adet suyla nemlendirilmiş filtre kağıdı diski yerleştirin.
   2. Pupaları Petri kaplarına aktarın. Adım 2.2.1.6'da toplanan erkek pupaları bir elek ile süzün ve pupaları mümkün olduğunca az suyla 1000 mL dereceli bir beherde yıkayın. Her filtre kağıdı diski tek bir pupa tabakası ile eşit şekilde kaplanana kadar pupaları Petri kaplarına dikkatlice dökün (Şekil 2A - C). Dökülmeyi kolaylaştırmak için Petri tabaklarını üst üste bir masanın kenarına yerleştirin.
      NOT: Pupaları süzmeye bir alternatif, plastik 3 mL Pasteur pipetin ucunu pupaları barındıracak kadar büyük bir çapa getirmektir. Pipetleri kullanarak pupaları adım 2.2.1.6'da üretilen kaptan doğrudan filtre kağıdı disklerine aktarın, böylece her Petri kabında yakından paketlenmiş tek bir pupa tabakası bulunur. Bu sadece küçük partiler için pratiktir.
   3. Seks adımı (3.2) ve taşıma sırasında pupa hareketini önlemek amacıyla Petri kabının tabanından durgun suyu çıkarmak için değiştirilmemiş 3 mL Pasteur pipet kullanın.

Şekil 2: Pupaların ışınlama için Petri kaplarına aktarılması . (A) Elenmiş pupalar dökülür ve 1000 mL'lik plastik bir beherin içine geri yıkanır. (B) Petri kaplarına dökülmeyi kolaylaştırmak için beherde minimum su tutulur. (C) Petri tabakları, tek bir pupa tabakasına dökülmeyi kolaylaştırmak için bir yüzeyin kenarı boyunca sıralanmıştır. (D) Pupa yüklü Petri kapları, ışınlama tesisine teslim edilmek üzere istiflenir ve sabitlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Kadınlarla kontaminasyonu kontrol etmek için pupaları cinsiyetlendirin. Diseksiyon kapsamında, ventral yüzeyi erkek cinsiyetini gösteren büyük boyutlu bir genital lob için kontrol etmek üzere her bir pupayı döndürmek için problar kullanın (Şekil 3). Pupayı dişileri gösteren azaltılmış veya küçük genital loblarla çıkarın ve atın ve doğru sayımı korumak için eşit sayıda erkek pupa ile değiştirin.
   NOT: Operasyonel bir programda, bu adım çok sayıda sivrisinek ve ışınlamadan sonra ayırma, aktarma, ışınlama ve kafes hazırlamanın sınırlı bir süre ile bir günde yapılması nedeniyle pratik değildir. Seçkin Petri yemeklerinden bir numunenin kalite kontrolü, özellikle SIT programının geliştirilmesinin erken aşamalarında yapılabilir.

Şekil 3: Genital lob kullanılarak seksleme pupaları . (A) Ventral ve (B) dişi () ve erkek (♀ ♂) Aedes aegypti pupalarının lateral görünümleri, genital lobların cinsel dimorfizmi gösterdiği belirtildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Alt kısımları Petri tabaklarının üst kısımlarıyla örtün ve laboratuvar bandı ile sabitleyin. Bantlanmış Petri kaplarını, ışınlama odasına sığacak boyutta yığınlar halinde elastik bantlarla bir araya getirin ve etiketli 3,8 L yeniden kapatılabilir bir torbanın içine kapatın (Şekil 2D). Pupaların >1 saat boyunca açıkta kalmasına izin vermeyin.

4. Erkek Aedes aegypti pupalarının ışınlanması

1. 1^cm2 film karesini keserek ve her kareyi ayrı ayrı zarfına yerleştirerek aynı partiden dozimetri filmi hazırlayın.
   NOT: Her gün kullanılan tüm filmler aynı anda kesilir. Bu, depolamanın neden olduğu az miktarda varyasyonu azaltır. Her yığın için gereken kare sayısı 1 +'dır (Petri kabı sayısı).
2. Bir laboratuvar zamanlayıcısı, laboratuvar bandı, kalıcı işaretleyici, hazırlanmış dozimetri filmi zarfları, dozimetri rozeti ve önemli bilgileri takip etmek için kontrol listeleri içeren bir laboratuvar not sayfası içermesi gereken ışınlama tesisine almak için bir kit hazırlayın (Şekil 4).

Şekil 4: Bir doz yanıt seti için tamamlanan laboratuvar kitabı taslağı-IR sayfası. Kırmızı renkle özetlenen (kırmızı oklarla işaretlenmiş) metin kutuları, farklı bölümlerle ilgili yararlı notları gösterir ve önemli bilgileri yineler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Pupaları ışınlama tesisine taşıyın. Erkek pupaların Petri tabaklarını adım 3.3'ten itibaren yalıtımlı kaplara yerleştirin ve taşıma sırasında doğrudan güneş ışığından ve klimadan uzak tutun.
4. Işınlayıcıda ışınlama için Petri bulaşıkları yığınları hazırlayın. Her bir çanak arasında ve yığının üstünde ve altında ortalanmış bir dozimetri filmi zarfı ile ışınlama odasına sığacak uygun sayıda Petri kabını istifleyin. Dökülmeleri önlemek ve yığının hazneye yerleştirilmesini kolaylaştırmak için zarfları ve tüm yığını laboratuvar bandı ile sabitleyin.
5. Erkek pupaların Petri yemeklerini ışınlayın. Petri çanak yığınını, spesifik ışınlama ünitesi^21'in önceki doz haritalamasına dayanarak optimum maruz kalma konisi için doğru yüksekliğe konumlandırmak üzere haznedeki sert metal ağ üzerine yerleştirin. Işınlayıcı üzerindeki döner tablayı etkinleştirin ve ışınlayın, aynı anda laboratuvar zamanlayıcısını başlatın. İstenilen dozu gerçekleştirmek için uygun aralık için ışınlama yapın (örnekler Tablo 2'de gösterilmiştir).
   NOT: Bu protokol bir sezyum-137 ışınlayıcıya ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 50 Gy'lik bir hedef doza dayanmaktadır. Cs-137 zamanla bozunduğundan, ışınlanmış numunelerin yaklaşık% 10'unda rutin dozimetri ve alanin için radyokromik film ile desteklenmiş alanin dozimetreleri kullanılarak bir doz-yanıt serisi gerçekleştirilerek doz oranı her yıl ayarlanır. Mevcut 8.8 Gy / dak doz oranı göz önüne alındığında, 50 Gy'lik hedef doza ulaşmak 5 dakika, 41 s maruz kalmayı gerektirir. Rutin film dozimetrisi, adım 4.7'de açıklandığı gibi gerçekleşir. Alanin pelet dozimetrisi, Texas A & M Üniversitesi'ndeki Ulusal Elektron Işını Araştırma Merkezi'nde veya Gaithersburg, MD, ABD'deki Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü'nde gerçekleştirilir.

Dozaj (Gy)	Zaman (8,8 Gy/dk'ya göre)
0	NA
10	1 dk 8 sn
30	3 dk 24 sn
50	5 dk 41 sn.
65	7 dk 23 sn
85	9 dk 39 sn
100	11 dk 22 sn
110	12 dk 30 sn

Tablo 2: Sezyum-137 ışınlayıcı için örnek dozaj süreleri.

6. Öngörülen süre geçtikten sonra, Petri bulaşıklarını ışınlayıcıdan çıkarın ve yığını dikkatlice sökün. Tüm Petri tabaklarını ve film zarflarını yığındaki tarih ve konumla etiketleyin. Zarfları kapatın ve dozimetri için saklayın. Petri tabaklarını ana laboratuvara geri götürmek üzere yalıtımlı kaba yeniden paketleyin.
   NOT: Yetişkinlerin ışınlama sırasında ortaya çıkıp çıkmadığını kaydedin ve etkilenen Petri kabını işaretleyin, böylece pupalar yetiştirme kafeslerine yerleştirildiğinde yetişkin (ler) kaçmayacaktır (adım 5.2).
7. Filmi maruz kaldıktan yaklaşık 24 saat sonra ölçerek dozlama dozunu dozimetri filmi ile onaylayın. Dozimetri okuyucuyu etkinleştirin ve oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin. Filmi okuyucuyla birlikte verilen forseps kullanarak yükleyin ve ışınlanmış filmi ve ışınlanmamış boş filmi aynı partiden okumak için üreticinin talimatlarını izleyin. Okumalar arasında film olmadan okuyucuyu sıfırlayın ve Şekil 5'te gösterilen örnek veri sayfasında olduğu gibi verileri kaydedin.
   NOT: Bu protokol ND0.5 ve ND1.0 QA Filtre Seti standartlarını temel alır. Filmi, mat tarafı operatöre bakacak şekilde ölçmek önemlidir.

Şekil 5: Örnek verilerle doldurulmuş dozimetri veri sayfası. Sütun başlıkları, operatörden daha sonra analiz edilmek üzere anahtar verileri yakalamasını ister. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Işınlanmış erkek Aedes aegypti pupalarının yetişkinlere yetiştirilmesi

1. 30 cm x 30 cm x 30 cm boyutlarında küçük plastik yetiştirme kafeslerini temizleyin ve hazırlayın, böylece ana laboratuvara döndüklerinde ışınlanmış pupalara hazır olurlar. Işınlanmış erkek pupaların her 2 Petri kabı için 1 yetiştirme kafesi hazırlayın. Her yetiştirme kafesini, adım 1.1.3'te açıklandığı gibi, 460 mL musluk suyu ve% 10 sakkaroz çözeltisi kabı içeren yarı dolu bir plastik kap ile stoklayın.
2. Işınlanmış pupaları, ışınlama tesisinden döndükten sonra derhal hazırlanan yetiştirme kafeslerine aktarın. Her Petri kabındaki pupayı, her yetiştirme kafesindeki plastik bardaktaki 460 mL suya dikkatlice yıkamak için bir şişe su sıkın. 24 saat sonra, bardakları besin kaynağını içeren yeni, temiz yetiştirme kafeslerine aktarın ve yetişkin, erkek ışınlanmış Aedes aegypti'nin kalan eklozyonunu bekleyin.
   NOT: Işınlama işlemi sırasında pupa ortaya çıktıysa, Petri çanaklarını el ilanlarıyla birlikte boş bir kafese açın ve ardından adım 5.2 ile devam edin. Bu kafeste toplanan erkekleri atın. Pupa 24 saat sonra yeni yetiştirme kafeslerine aktarılır, çünkü erkekler aynı kohortun dişilerinden önce ortaya çıkar ve ortaya çıkma günlerini izole etmek kadın kontaminasyon insidansını azaltabilir ve erkeklerin doğru yaşlanmasını sağlayabilir.

6. Işınlanmış yetişkin Aedes aegypti erkeklerinin işaretlenmesi ve tartılması

NOT: Protokolün bu bölümü, iki kişinin görevleri yerine getirdiğini varsayar; 1 kişi için bkz. 6.4.

Resim 6: İşaretli, ışınlanmış, erkek Aedes aegypti'nin serbest bırakma kaplarına ambalajlanması. (A) Maskeleme bandı, zımbalar ve sıcak tutkal ile karton silindirinin yan tarafında kesilmiş bir deliğe tutturulmuş şarampole tutturulmuş stoğu gösteren kabı serbest bırakın. Çerçeve, yan tarafa yapıştırılmış bir maskeleme bandı etiketi desteği ile yerine oturtulmuştur. Çerçeve, sıkıca çekilmiş tül örgü kapağını koruyor; elastik bir bant (görünmez) de tülü çerçevenin altında yerinde tutuyor. (B) Küçük bir karton kapta pembe boya ile yuvarlanma sürecinde anestezi uygulanan erkeklerin partisi. (C) Yalıtımlı nakliye konteyneri içinde dört serbest bırakma konteyneri. Stokinette manşonların nakliye konteynırının ortasına yönlendirildiğini, ambalaj malzemelerinin serbest bırakma kaplarının etrafına sıkıştığını ve çapraz elastik bantlar ve bant parçaları tarafından hızlı bir şekilde tutulan ters çevrilmiş bir Petri kabı tabanı ile kaplanmış her bir serbest bırakma kabının üstünde beslenme ve hidrasyon kaynaklarının bulunduğunu unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Karton serbest bırakma kapları hazırlayın.
   1. Kapaklı, silindirik 3,9 L karton kabın yan tarafındaki 11,5 cm çapında bir deliği, alttan 1,5-3,0 cm yükseklikte kesin, böylece delik kapakla kaplanmayacaktır (Şekil 6A).
   2. 40-50 cm uzunluğunda bir stockinette kesin ve bir ucunu 6.1.1'de kesilmiş 11.5 cm'lik deliğin iç kısmına zımbalayın. Zımbaların haznenin içinden ve kartondan geçerek sert ekstrüde polistiren köpük bloğu gibi uygun bir çalışma yüzeyine zorlanabilmesi için standart bir ofis zımbalayıcı kullanın. Stolineti deliğin çevresine sıkıca sabitlemek için düz başlı bir tornavida kullanarak zımbaları sıkın ve takılmaları önlemek için maskeleme bandını kıvrımlı tarafa sabitleyin. Silindirin içindeki şarampole kenarını sıcak tutkalla kartona kapatın ve tüm tertibatı kaçış delikleri için çapraz kontrol edin.
   3. İç diski kapaktan çıkararak bir tutucu çerçeve oluşturun ve yetişkin erkek Aedes aegypti sivrisineklerini tutacak kadar ince bir 33 cm x 33 cm kare naylon tül örgü kesin. Ağı silindirin açık ucuna yerleştirin ve çerçeveyi boşluk bırakmadan yerinde tutmak için ağın üzerine yerleştirin. Ağın açık uç boyunca öğretilmesini sağlamak için ağı çerçevenin altına çıkıntı yapacak şekilde aşağı doğru çekin ve çıkıntılı ağı silindire karşı lastik bir bantla sıkıca kapatın.
   4. 8 cm'lik bir etiketleme bandı parçasıyla kaplı çerçevenin yan tarafına 10 cm'lik bir maskeleme bandı parçası yerleştirin, böylece etiketleme bandı çerçeveyi yırtmadan kolayca değiştirilebilir.
      NOT: Serbest bırakma kapları dayanıklıdır ve uygun kullanımla >10x tekrar kullanılabilir. Her yeni işaretli, ışınlanmış, yetişkin, erkek sivrisinek grubunu tanıtmadan önce, stokun kaba güvenli bir şekilde tutturulduğunu kontrol edin ve gerekirse derhal onarım yapın.
2. Tartım ve işaretleme istasyonunu hazırlayın.
   1. 240 mL'lik bir karton kaba yaklaşık 50 mg işaretleme boyası dökün ve boyayı kabın iç yüzeylerine eşit olarak bir toz tabakası olarak yayın. Fazla boyayı atmak için hafifçe dokunun. Renkleri ayrı tutmak için birden fazla boya için açıkça etiketlenmiş kaplar kullanın.
   2. 0,0001 g elektronik terazide 100-500 g ağırlığındaki bir tekneyi dara edin; bir veri formu oluşturmak (Tablo 3); ve 431,8 mm x 711,2 mm çalışma yüzeyi oluşturmak için dört yaprak 215,9 mm x 355,6 mm kopya kağıdını birlikte bantlayın.

Serbest Bırakma Kabı	Sivrisineklerin ağırlığı	Kafes Numarası	Toplu Dişiler	Erkek Sayısı	Serbest Bırakma Kabı	Toplam Kütle
PEMBE I	0.024	D1 #1		25	PEMBE I	2.03
PEMBE I	2.007	D1 #1	7		PEMBE II	1.99
PEMBE II	1.990	D1 #1			PEMBE III	2.03
PEMBE III	0.026	D1 #3		25
PEMBE III	2.000	D1 #3	18

Tablo 3: Tartım istasyonu veri tablosu.

3. Floresan pigmentli yetişkin ışınlanmış erkeklerin niceliklendirilmiş partilerini işaretleyin.
   1. Yetişkin sivrisinekleri (2.5-3.5 günlük) her yetiştirme kafesinden aspiratör şişelerine aktarın. Yetiştirme kafesinden besin kaynaklarını adım 5.2'den çıkarın ve tüm kafesi 5-7 dakika boyunca büyük bir CO₂ odasına yerleştirin, yetiştirme kafesine yapışmış olabilecek sivrisinekleri yerinden çıkarmak için kabın kenarlarını vurun. Maruz kalma süresi geçtikten sonra, yetiştirme kafesini odadan çıkarın ve tüm yetişkin sivrisinekleri bir dizi plastik aspirasyon şişesine aspire edin.
      NOT: %99,5-100 CO_2'nin uygulanması, hazneye 6 L/dak akış hızında kanalize edilmiş regülatör, pirinç diken ve silikon borulu bir tanktan yapılır. Yetiştirme kafesini temizlemek için gereken şişe sayısı, kafeste kaç sivrisinek bulunduğuna ve operatörün yeterliliğine bağlıdır, ancak kafes başına tipik olarak 3-5 şişe gereklidir. Yetişkin sivrisineklerin gruplar halinde yönetimini kolaylaştırmak için küçük hızlı değişim şişelerine sahip bir aspiratör seçin, örneğin, bir ucunda 20 x 20 mesh alüminyum ekran ve diğer ucunda net bir asetat flep valfi ile kapatılmış 60 mL polistiren toplama şişesi kullanın. Sivrisinekler üzerindeki stresi azaltmak ve protokolü izlenebilir tutmak için sivrisinekleri şişelere aktarma süresini azaltmak için aspirasyondan önce tüm kafes anestezi altına alınır.
   2. Tüm yetişkin sivrisinekleri her yetiştirme kafesinden cinsiyete göre sıralayın.
      1. İlk şişeyi adım 6.3.1'den CO 2'ye kadar küçük bir odada 4 dakika boyunca maruz bırakın ve ardından anestezi uygulanan sivrisinekleri hafifçe sallayın ve bunları adım 6.2.2'de hazırlanan beyaz kağıt çalışma yüzeyine yayın.
      2. Aspiratöre yeni bir boş şişe yükleyin ve tüm erkekleri çalışma yüzeyinden dikkatlice aspire edin ve bu şişeyi tartım istasyonuna geçirin (adım 6.3.3.). Geride kalan dişileri toplayın ve onları ayrı bir şişeye aspire edin ve ezilmiş erkeklerle birlikte atın.
      3. Bu işlemi 6.3.1'den kalan şişelerle tekrarlayın, ancak cinsiyet sıralama işleminin bir noktasında, tartım istasyonuna da geçirilen sadece 25 erkekten oluşan ayrı bir şişe oluşturun. Adım 6.3.2'yi yineleyin. her yetiştirme kafesi için.
         NOT: Işınlanmış yetişkin erkekleri cinsiyetlendirme, tartma ve işaretleme için işlerken, pupa cinsiyet sıralamasının ve tüm sürecin sorun giderme ve kalite güvencesi için kilit veriler olan her partideki kadın sayısını takip edin. Kadın sayısı beklenenden yüksekse, ana operatör erkekleri aspire ederken ikinci bir kişi dişileri çıkarmalıdır. Sivrisinek başına ortalama bir ağırlığı hesaplamak için her yetiştirme kafesinden 25 erkekten oluşan bir numunenin tartılması önemlidir; bu, protokolün sonunda salınan işaretli ışınlanmış erkeklerin sayısını tahmin etmek için kullanılacaktır.
   3. Yetişkin erkek sivrisineklerin partilerini tartın ve boyayın.
      1. Tartım istasyonunda, yetişkin erkek sivrisineklerin ilk şişesini seks istasyonundan (bölüm 6.3.2) 2 dakika boyunca küçük bir CO₂ odasına yerleştirin ve sivrisinekleri adım 6.2.2'de hazırlanan katranlı tartım teknesine dikkatlice sallayın. Sivrisineklerin ağırlığını kaydedin ve sivrisinekleri 6.2.1'de hazırlanan boya kabına dökün.
      2. Bardağı yavaşça eğin ve döndürün 1 tam dönüş saat yönünde ve saat yönünün tersine çevirin, böylece sivrisinekler kabın iç yüzeylerindeki toz kaplamaya temas eder ve hepsi boya ile hafifçe tozlanır (Şekil 6B). İşaretli sivrisinekleri bir tartım teknesine dökün.
      3. Sivrisineklerin iyileşmemesi ve kaçmaması için bir sonraki adıma hızla ilerleyin. Bölüm 6.3.2'deki tüm şişeler işlenene kadar bu adımı tekrarlayın.
         NOT: Bölüm 6.3.2'de her yetiştirme kafesi için üretilen 25 erkekten oluşan ayrı şişeden erkeklerin ağırlığı kaydedilir ve bu kafesten erkek başına ortalama ağırlığı hesaplamak için kullanılır.
   4. Serbest bırakma kaplarını işaretli ışınlanmış yetişkin erkeklerle yükleyin. Bölüm 6.3.3'ün sonundan anestezi yapılmış, işaretlenmiş, ışınlanmış, erkek sivrisinekler içeren tartım teknesini hafifçe katlayın. Bir kanal oluşturmak için ve daha sonra erkekleri serbest bırakma kabına aktarmak için bu kanalı stockinette manşonundan yönlendirin. Yaklaşık 2.0 g veya 1500-3000 erkek sivrisinek serbest bırakma kabında olana kadar sivrisinekleri eklemeye devam edin ve stockinette manşonunu kapatın. Serbest bırakma kabının çerçevesindeki etiketleme bandını boya rengi, kap numarası ve sivrisineklerin toplam ağırlığı ile işaretleyin ve bu verileri adım 6.2.2'deki forma kopyalayın.
      NOT: Sivrisineklerin herhangi bir yaşam evresinde taşınması strese neden olur ve hayatta kalma veya canlılığı azaltabilir. Bu protokolde açıklanan anestezi serileri sivrisinekleri etkileyebilir; Bununla birlikte, her adımda anestezi yapılmamış sivrisinekleri takip etme ve aspire etme girişimleri daha fazla strese ve sürdürülemez bir protokole neden olacaktır. Her bir salınım kabındaki sivrisineklerin toplam ağırlığını, bu salınım kabındaki erkek sayısının bir tahminini elde etmek için bölüm 6.3.3'te üretilen erkek sivrisinek başına ortalama ağırlığa bölün; Her serbest bırakma kabı, yaklaşık 1 büyük yetiştirme kafesine eşit olan 2 g'dan fazla erkeğe sahip olmamalıdır.
4. Tek bir operatör için işaretleme protokolünde yapılan değişiklikler
   1. Önce tüm büyük kafesler için seks sıralama yapın. Her büyük kafesi 4-5 dakika boyunca CO_2'ye maruz bırakın ve tüm sivrisinekleri 4-5 şişeye aspire edin. Her şişeyi 2-3 dakika boyunca CO_2'ye maruz bırakın, tüm sivrisinekleri beyaz kağıt çalışma yüzeyine atın, dişileri çıkarın ve sayım yapın ve erkekleri büyük popülasyon kafeslerine geri döndürün.
   2. Tartım ve markalama
      1. Adım 6.4.1'de üretilen ilk erkek tutma kafesi ile başlayın: beslenme kaynağını çıkarın ve erkekleri 5-7 dakika boyunca büyük bir CO₂ odasında uyuşturun. Anestezi uygulanan erkekleri ayrı şişelere eşit şekilde aspire edin. Bu adımı, her bir tutma kafesi ile üretildikleri sırayla tekrarlayın.
         NOT: Tutma kafesi başına yaklaşık 2-3 adet kalabalık şişe üretilecektir. Erkek tutma kafeslerinin üretildikleri sırayla işlenmesi, her bir erkek kafesi için iyileşme süresini en üst düzeye çıkarır.
      2. Adım 6.4.2.1'de üretilen ilk şişeyi anestezi altına alın. küçük bir CO 2 odasında_1-2 dakika boyunca. Beyaz kağıt çalışma yüzeyine az sayıda sivrisinek dökün, 25 erkek sivrisineği yeni bir şişeye aspire edin ve bu kafes için erkek başına ortalama ağırlığı belirlemek için 6.3.2'deki gibi işleyin. Ek erkekleri kaynak şişeye iade edin veya daha sonra işlenmek üzere yeni bir ayrı şişeye aspire edin; adım 6.3'ün geri kalanında açıklandığı gibi ilk şişedeki erkeklerin geri kalanı için tartım, işaretleme ve serbest bırakma kaplarına aktarma işlemine devam edin. 6.4.2.2 adımını yineleyin. Adım 6.4.2.1'de üretilen şişelerin geri kalanı için (25 erkeğin ayrı bir şişede izole edilmesi hariç). üretildikleri sırayla ve daha sonra 6.4.1'de üretilen bir sonraki cinsiyete göre sıralanmış yetiştirme kafesine geçin.
         NOT: Bir kişiyle iş akışları daha yavaştır ve bazı erkek sivrisineklerin birden çok kez anestezi altına alınması gerekir. Sürekli dişi sivrisinekleri arayın ve çıkarın.

7. İşaretli, ışınlanmış, yetişkin erkek Aedes aegypti'nin ambalajlanması ve nakliye serbest bırakma konteynerleri

1. Serbest bırakma konteynerlerini sevkiyat için hazırlayın. Bir serbest bırakma kabı işaretli erkeklerle doldurulduktan sonra, ağ kapağına% 10 sakkaroz çözeltisi ile nemlendirilmiş 4 pamuk topu yerleştirin ve bir haç oluşturmak için tüm kabın etrafına ve Petri kabının üzerine gerilmiş iki lastik bant tarafından yerinde tutulan bir Petri kabının ters çevrilmiş bir tabanıyla örtün. Ters çevrilmiş Petri kabının üstünde yerinde tutmak için iki lastik bandın X'inin üzerine bir parça maskeleme bandı yerleştirin.
   NOT: % 10 sakkaroz çözeltisi içeren pamuk toplarının, kabın zarar görmesine ve sivrisinekleri yakalayıp öldürmesine neden olacak damlama noktasına doygun olmadığından emin olun.
2. Karton serbest bırakma kaplarını ekstrüde polistiren köpük nakliye soğutucusuna paketleyin. Soğutucu kapaktan 4 havalandırma deliği açın ve karıncaları dışarıda tutmak ve kaçan sivrisinekleri tutmak için pamukla tıkayın. 4 serbest bırakma konteynerini, her bir konteynerin stoğu merkeze bakacak şekilde nakliye soğutucusuna dik olarak yerleştirin (Şekil 6C). Stabilize etmek için kabarcık sargısını her bir kabın arasına ve merkeze yerleştirin. Nakliye soğutucusundaki alanın geri kalanını hava yastıklarıyla doldurun veya 4 serbest bırakma kabından oluşan ikinci bir katmanı doğrudan ilk katmanın üzerine istifleyin ve benzer şekilde hava yastıklarıyla stabilize edin.
   NOT: Serbest bırakma kapları, çalkalandığında hareket etmeyecek kadar stabilize edilmelidir. Paketin içindeki sıcaklık ortamdır.
3. Nakliye soğutucusunu teslimat için hazırlayın. Nakliye soğutucusunu havalandırmalı kapakla kapatın ve karton üst ambalajın içine yerleştirin, bant kapatın ve gece ekspresi ile serbest bırakma konumuna gönderin.

Sonuçlar

Uyanık ve yeterli sivrisinek yetiştiriciliği, koloni kafeslerinde erkek ve dişilerin dengeli mevcudiyeti, taze sakkaroz çözeltisi ve balın bakımı ve tutarlı yüksek kaliteli kan beslenmesinden oluşur. Bu koşullar, SIT larva yetiştirme tavalarında kullanım için en uygun şekilde paketlenmiş yumurta tabakaları sağlayacaktır. En eskisinden en yenisine kullanımı kolaylaştırmak için sistematik etiketleme gibi kurutulmuş yumurta tabakalarının uygun şekilde depolanması ve kullanılması, tüm tavalarda tek tip kuluçkalamayı destekleyecektir. Yumurtadan çıkmadan önce tüm larva yetiştirme tavalarının suyla doldurulması, yumurta tabakalarının kapak kaplarında bulunduğu süreyi azaltabilir ve sağlıklı gelişimi destekleyebilir. Larva tavalarının kapaktan yavruya kadar bakımı, koloni personelinin dikkatli bir şekilde katılımını gerektirir, çünkü bazı tavalar gelişim aşamalarına ve çevresel değişkenlere bağlı olarak az ya da çok yiyeceğe veya ek suya ihtiyaç duyabilir. Pupa cinsiyet ayrımının planlanan gününe kadar gelişim aşaması ile ilgili sorunlar varsa, daha erken veya daha geç kuluçkalama, yiyecekleri ayarlama veya inkübatör sıcaklığını değiştirme gibi süreçte daha erken ayarlamalar yapılmalıdır.

Bu protokoldeki yetiştirme süreci, zamanla yumurtadan çıkan tüm yumurtaların ışınlanabilen ve kontrol amacıyla kullanılabilen pupalara dönüşmesini sağlamaz. Koloni tarafından yetiştirilen sivrisineklerin% 20 ila% 50'si, pupaların ayrılması gerektiğinde hala larva olacaktır. Bununla birlikte, bu larvalar israf edilmez, ancak önceki günün ayrılmasından dişi pupalarla birleştirilebilecek ve koloni kafeslerine geri dönüştürülebilecek ek pupa oluşturmak için 24 saat boyunca olgunlaşmalarına izin verilir. Koloni kafeslerinde, pupaların yetişkinlere dönüşmesine, çiftleşmesine, kan beslemesine ve SIT projesini sürdüren yumurtalar üretmesine izin verilecektir.

Pupaları ayırmak, pupaları Petri kaplarına dökmek, ışınlamak ve ışınlamadan sonra yetişkin tutma kafeslerine yerleştirmek bir gün içinde gerçekleşmelidir; Bu nedenle, tüm adımları rahatça işlemek için yeterli zaman ayrılmalıdır. Serbest bırakma kaplarının montajı ve hazırlanması, işaretleme işleminden önce yapılmalıdır. Nakliye kutuları serbest bırakma alanından iade edildiğinde, serbest bırakma konteynerleri incelenmeli ve bir sonraki kullanımları için hazırlanmalıdır. Islak pamuk toplarını atmak, ıslak serbest bırakma kaplarını havalandırmak, Petri bulaşıklarını temizlemek, ağı değiştirmek ve elastik bantları kaptan çıkarmak, kullanımda değilken, serbest bırakma kaplarının ömrünü büyük ölçüde uzatacaktır.

COVID-19 viral pandemisinin dünya çapındaki gerçekliği göz önüne alındığında, tipik olarak çok kişilik bir operasyon olan bu protokol, her adım için bir laboratuvarda tek başına çalışan bir kişi tarafından çekilebilecek şekilde değiştirilmiştir. Tek kişilik bir senaryo tarafından en çok engellenen süreçteki adımlar, cinsiyetlendirme, işaretleme, tartma ve koloni yetiştirme bakım adımlarıdır. Pupaları cinsiyete göre bir kişi tarafından ayırmak, farklı odalarda aynı anda çalışan birden fazla ayırıcı varsa yeterli olmalıdır. İşyerinde sosyal mesafenin oluştuğu bir pandemi durumunda, cinsel ilişkiden paketlemeye kadar olan adımları tamamlamak için birden fazla istasyonun donatılması gerekir. Operatörün hızına bağlı olarak, 15.000 sivrisinek seks yapmak için bir kişi ~ 4 saat ve daha sonra onları işaretlemek, tartmak ve paketlemek için 1-2 saat daha sürer. İki kişilik bir senaryo, sivrisineklerin işaretleme için uyuşturulduğu süreyi azaltır ve genel çalışma süresini azaltır. Yine de, iki kişilik bir senaryoda bile, salınım kafesi başına tam 2.0 g sivrisinek tahsis etmek, sivrisinekler sakinleştirilirken sınırlı çalışma süresi nedeniyle zor olabilir. Larva ve yetişkin yetiştirme materyallerini temizleme ve hazırlama süreci son derece zaman alıcı ve emek yoğun olmasına rağmen, bireysel operatörlerin bir pandemi sırasında bağımsız ve güvenli bir şekilde çalışabileceği şekilde bölümlendirilebilir.

Erişkin, işaretli, ışınlanmış Aedes aegypti erkeklerinin serbest bırakılması bu protokolün kapsamı dışındadır ancak burada kısaca sunulmuştur. İşaretli, ışınlanmış, erkek sivrisinekleri serbest bırakma süreci, Tablo 3'te bildirildiği gibi, salınım kaplarının ağırlıklara (ve dolayısıyla steril erkeklerin çıkarılan sayılarına) dayalı olarak eşit bir salınım dağılımını belirleyerek başlar. Gönderiler vektör kontrol bölgesine teslim edildikten sonra, kutular açılır ve serbest bırakma konteynerleri, serbest bırakma konteynerlerinin ölüm oranı veya durumu ile ilgili herhangi bir sorun için değerlendirilir. Salınım kaplarındaki sivrisineklerin daha sonra tedavi alanına taşınmadan önce 1-2 saat boyunca ortam sıcaklığına ve neme alışmasına izin verilir. Tedavi alanındaki salınım bölgeleri, Aedes aegypti'nin vahşi popülasyonlarının sıcak noktaları için yoğun gözetimden sonra tespit edilir. Salınımların zamanlaması, sıklığı ve yoğunluğu, türlerin biyonomiklerinin yanı sıra meteoroloji, kamu desteği ve laboratuvar yetiştirme yetenekleri ile dengelenir.

Belirli serbest bırakma kapları belirli serbest bırakma bölgeleriyle eşleştirildiğinden, serbest bırakma kabı açılmadan önce, üstteki ağ kesilerek etiketin çapraz kontrol edilmesi gerekir, böylece operatörün ağın deforme olmasına izin verilir, böylece erkeklerin bir kısmı kaçabilir. Bu kesirli serbest bırakma yöntemi, serbestçe uçan tüm erkekler serbest bırakılana kadar konteyner için atanan her serbest bırakma noktasında tekrarlanır. Bu işlem daha sonra tüm kapsayıcılar işlenene kadar her yayın kapsayıcısı için kendi atanmış yayın konumlarında tekrarlanır. İsteğe bağlı olarak, sivrisinekler serbest bırakıldıktan sonra, serbestçe ayrılmayan ölü veya engelli sivrisinekler Petri kaplarına toplanabilir ve elle sayılmak üzere etiketlenebilir veya salınan tahmini sayıyı düzeltmek için tartılabilir. SIT operasyonunun etkinliğini değerlendirmek için hedef bölgede ve muhtemelen müdahale dışı kontrol bölgelerinde vahşi Aedes aegypti'nin yetişkin, yumurta ve olgunlaşmamış aşamalarının devam eden ve yaygın gözetimi yapılmaktadır.

Tartışmalar

Radyasyon kullanan SİT içeren bir kontrol programının başlatılması, yerel bir Aedes aegypti suşunun kurulmasını gerektirir. Bu adım kritiktir ve SIT'in kendisini benzer kontrol teknolojilerinden gerçekten ayırt etmesini sağlayabilir. Projeyi yerel bir sivrisinek türünden geliştirerek, üretilen erkekler muhtemelen çevresel değişikliklere ve ipuçlarına uyum sağlamalarına ve çevredeki vahşi dişileri bulmalarına ve onlarla çiftleşmelerine izin veren davranışlara sahip olacaklardır. Dahası, ışınlanmış yerel erkeklerin serbest bırakılması, örneğin, yerel sivrisinek popülasyonuna yeni aleller sokabilecek genetiği değiştirilmiş sivrisineklerin yerel olmayan bir suşunun salınmasıyla karşılaştırıldığında olumsuz kamuoyu oluşturmayabilir.

Sadece yaklaşık yarısını kontrol amacıyla kullanabilmek için çok miktarda sivrisinek yetiştirmek için önemli kaynaklar harcamak, Aedes aegypti SIT programının bir sınırlamasıdır. Larvaların olgunlaşmasını pupaların hazır olacağı daha tanımlanmış zaman dilimlerine yoğunlaştırmak için yetiştirme protokolünde iyileştirmeler yapılmalıdır. Bu, en uygun ayrılma zamanında daha fazla pupanın toplanmasına izin verecektir. Bununla birlikte, işlenecek ek pupalar, pupalar toplandığında daha fazla dişinin yavrulanma riskini arttırır ve bu nedenle dişilerin erkeklerle Petri yemeklerine girme ve muhtemelen serbest bırakılma olasılığını arttırır. Işınlanmış dişi Aedes aegypti pupalarında yaşam süresi, kan besleme davranışı ve yumurtlama davranışı yetişkinlerde azalmış olsa da, ışınlanmış erkeklerin yanında kadınları tesadüfen serbest bırakmak iyi bir strateji değildir²². Bu nedenle, yanlışlıkla erkeklerle ayrılan, ışınlanan, işaretlenen ve serbest bırakılan kadın sayısını en aza indirmek bir öncelik olarak kalmalıdır.

Bir SIT programının başarısı nihayetinde koloni tarafından yetiştirilen, ışınlanmış erkeklerin başarılı eş rekabetine dayanır. Erkek rekabet gücünün korunması, dozun deneysel olarak türetilmiş kapsamlı seçimine ve popülasyondaki steril: vahşi erkeklerin tahmini oranının en üst düzeye çıkarılmasına dayanır. Doz seçimi, uzun ömürlülük, doğurganlık, doğurganlık ve pupa mortalitesini içeren birkaç anahtar faktör tarafından belirlenir. Erkek sivrisineklerin radyasyon arttıkça sıfıra yaklaşan asimptotik bir doğurganlık eğrisi sergileyeceği gözlemlenmiştir (KJL, RLA, SCB yayınlanmamış veriler). Aynı zamanda, radyasyon dozu arttıkça erkek sivrisinek ömrü ve aktivite seviyeleri katlanarak azalır (KJL, RLA, SCB yayınlanmamış veriler). Bu nedenle, erkeklerde% 99.9 sterilite veren bir doz tanımlamak yerine, hayatta kalmayı desteklerken daha düşük bir sterilite yüzdesine odaklanmak tercih edilir. Işınlanmış erkeklerin uzun ömürlülüğünü veya pupa mortalitesini ışınlanmamış erkeklerinkinden ayırt etmeyen bir doz aralığı belirlendikten sonra, erkekleri ezici bir şekilde steril, ancak rekabetçi kılan bir dozu tanımlamak için doğurganlık üzerine ek değerlendirmeler yapılmalıdır.

Aynı zamanda, popülasyondaki erkek sivrisineklerin sayısını, salınan ışınlanmış erkeklerinkiyle karşılaştırmak çok önemlidir. Bu, hedef salınım alanının içindeki ve çevresindeki çeşitli konumlardan erkekleri aynı yerden tekrar tekrar ve SIT programının başlatılmasından önce, sırasında ve sonrasında toplayarak gerçekleştirilebilir. Yabani erkek sivrisineklerin salınan sivrisineklere oranını değerlendirmek için bir işaret, salınım, yeniden yakalama çalışması yapılmalıdır. Bir işaret, salınım, yeniden yakalama çalışması, bilinen sayıda işaretli sivrisineğin belirli bir noktadan salınmasına ve daha sonra ilk salınım noktasını çevreleyen yakın noktalarda yeniden yakalanmalarına dayanır. Salınım noktasından uzakta yeniden yakalanan erkeklerin ve vahşi erkeklerin sayısını karşılaştırarak, bölgedeki erkeklerin genel vahşi popülasyonunu tahmin etmek mümkündür, böylece steril erkeklerin rekabetçi oranları²³ serbest bırakılabilir. Steril: vahşi erkeklerin oranını en üst düzeye çıkarmak, daha steril erkeklerin serbest bırakılmasıyla ve / veya kaynak azaltma, olgunlaşmamış kontrol veya yetişkin öldürme tedavileri gibi klasik kontrol araçlarıyla vahşi popülasyonun azaltılmasıyla sağlanabilir.

Steril erkek salınımlarının etkinliğini ölçmek için, yetişkin koleksiyonları kronolojik olarak müdahale edilmeyen bir alanla karşılaştırılabilir. Steril erkekler serbest bırakıldıkça ve bir alanda toplanan erkek ve dişilerin sayısı, karşılaştırılabilir bir müdahale dışı alana göre azaldıkça, serbest bırakılan steril erkeklerin yerel verimli erkekleri başarılı bir şekilde geride bırakmasından kaynaklandığı varsayılabilir. Bu etki, hem müdahale hem de müdahale edilmeyen bölgelerde konuşlandırılan yumurtlama tuzağı kaplarında da gözlenebilir. Müdahale bölgesinde hala yumurta üretilebilir, ancak müdahale edilmeyen bölgeden daha az yumurtadan çıkarsa, steril erkeklerle çiftleşen dişiler nedeniyle döllenmedikleri varsayılabilir. Döllenmemiş yumurtaların giderek daha fazla yumurtlaması, müdahale bölgesindeki dişilerin değiştirilmemesi nedeniyle yumurtlamanın azalmasına neden olabilir ^8,24.

SIT teknolojisinin ve programlarının gelecekteki yönleri doğal olarak tıbbi olarak önemli ek sivrisinek türlerine genişlemektedir. Örneğin, bu teknoloji, Aedes aegypti ve Aedes albopictus'un çok benzer biyonomiği göz önüne alındığında, Aedes albopictus'u kontrol etmek için kolayca uyarlanabilir. İlgilenilen diğer hastalık vektör sivrisinek türleri arasında Culex quinquefasciatus, Culex tarsalis ve çeşitli Anopheles türleri bulunmaktadır. Bu teknolojinin etkinliğini artırmak, belirli bir zamanda üretilen erkek pupaların kapasitesinin arttırılmasına, genetik manipülasyon veya yapay seleksiyon yoluyla elde edilebilmesine ve erkekliğin, doğurganlığın veya uzun ömürlülüğün arttırılmasıyla elde edilebilecek erkek rekabet gücünün geliştirilmesine bağlıdır.

Sonuçta, SIT programları sivrisinekleri kontrol etmek için gümüş bir mermi değildir. Bunun yerine, IVM programları gibi teknikler arasındaki zayıflıkları çapraz telafi eden bir dizi diğer kontrol tekniğinde bir araçtır. Örneğin, kimyasal kontrol hızlı ve ucuz kontrol sunarken, aynı zamanda direncin ve hedef dışı mortalitenin gelişimini de teşvik eder; ve SIT türe özgü ve direnç üretmesi muhtemel olmasa da, SIT erkekleri vektör kontrol bölgesi dışından göç eden popülasyonları kontrol etmek için sürekli olarak üretilmeli ve serbest bırakılmalıdır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-1/8" wrench (1" (1 inch) = 2.54 cm)	Craftsman	CMMT44707
1/2 pint cardstock cup (1/2 pint = 236.5 mL)	Science Supplies WLE corp	1/2 pint
1/4" tubing - tygon	Hudson Extrusions	LLDPE1/8 X 1/4 BLK	to attach to CO2 gas regulator
1/8" brass barb w/ MIP connection	B&K	BHB-85NLB	to attach to CO2 gas regulator
1000 mL graduated plastic beakers with handle	Thermo Scientific	1223-1000
3000 mL graduated plastic beakers with handle	Thermo Scientific	1223-3000
Adult large cage	Bioquip	1450D
Aspirator vials	Bioquip	2809V
Bovine liver powder	MP Biomedicals	290039601
Brewers yeast	MP Biomericals	02903312-CF
CO2 regulator	Randor	64003038
CO2 tank (20# canister)	Praxair	CDBEVCARB20
Collection basin	Treasure Gurus	KI-ENAMELBOWL	for separator
Cotton balls - large	Fisher Scientific	22-456-883
Deli cups w/lids - 470 mL	Pactiv DELItainer	PCTYSD2516
Deli cups w/lids - 1900 mL	Berry Global	T60764
DoseReader 4			ND0.5 and ND1.0 QA Filter Set standards
Dosimetry film	Far West Technology, Inc.
Filter paper	Millipore	AP10045S0
Flashlight aspirator	Bioquip	2809D
Forceps - fine featherweight	Bioquip	4748 or 4750	featherweight
GAFchromic			radiochromic film
Gammator M	Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ		Cesium-137 irradiator
Hand held mechanical aspirator	Clarke Mosquito	13500
Lambskin condoms	Trojan	Naturalamb
Large CO2 chamber	Sterilite	Walmart # 568789514
Larval rearing pans	Blue Ridge Thermoforming	01-FG-400-3N-ABS	Dimensions: 22.375 x 17.5 x 3 (inches)
Magnets - 20# pull	Master magnetics	MHHH20BX
Marking dye	Dayglo	ECO-11	Aurora Pink
Marking dye	Dayglo	ECO-17	Saturn Yellow
Mesh	Falk		T301
Pasture pipettes	Thermo Scientific	02-708-006
Petri dishes - large	VWR International	25384-090 CS
Petri dishes - small (60 mm x 15 mm)	Fisher Brand	FB0875713A
Pupa separator	J.W. Hock	1512
Red rubber hose	Welch	331040-5
Release containers	Science Supplies WLE corp	1 gallon
Rubber bands - cross #19	Alliance	ALL37196
Rubber bands - latitude #64	Skillcraft	NSN0589974
Scale	Ohaus	H-4737
Seed germination paper - Heavy stock 76#	Anchor Paper	#76
Shipping coolers- 16 x 13 x 12.5"	MrBoxonline.com	Husky Foam Cooler kit
Sieve #20	Advantech	20BS8F
Sieve #30	Advantech	30BS8F
Small cage - Bug Dorm	MegaView	Bug Dorm-1
Small CO2 chamber	Mainstays	Walmart # 562922221
Souffle cup lid	SOLO	41165277456
Souffle cups - 4 oz (1 oz = 29.6 mL)	SOLO	41165024104
Sponge	ocelo	MMM7274FD
Squeeze bottle	Dynalon	3UUP6
Stereoscope	Meiji Techno	EMZ-5
Stockinette	BSN Medical	30-1006
Styrofoam			extruded polystyrene foam
Tropical fish flake food	Tetra	4.52 pound
Vaccum chamber - desiccator	BelArt	T9FB892757
Weigh boats	Globe Scientific	3621