准备辐照和标记的雄性 埃及伊蚊 ，以便在操作性昆虫技术计划中释放

摘要

昆虫不育技术（SIT）用于控制可能对化学控制具有抗性的特定的、医学上重要的蚊子种群。在这里，我们描述了一种大规模饲养和制备不育雄性蚊子的方法，以便在针对 埃及伊蚊 的操作昆虫不育技术计划中释放。

摘要

对登革热、寨卡和基孔肯雅热等人类疾病的控制依赖于对其媒介埃及 伊蚊 的控制，因为没有预防。蚊媒的控制可以依靠应用于未成熟和成虫阶段的化学品，这可能导致非目标的死亡率，更重要的是，导致病媒中的杀虫剂耐药性。昆虫不育技术（SIT）是一种通过释放与野生雌配以产生无法存活的后代的绝育成年雄性来控制害虫种群的方法。本文描述了生产不育雄性的过程，用于控制 埃及伊蚊 的操作昆虫不育技术计划。这里概述了该计划中使用的步骤，包括饲养和维护一个群体，分离雄性和雌性蛹，照射和标记成年雄性，以及将 埃及伊蚊 雄性运送到释放地点。还讨论了程序警告、计划限制和未来目标。

引言

蚊媒病原体传播给人类每年在全世界造成数百万例疾病和死亡。在没有针对寨卡或登革热等蚊媒疾病的有效、经批准的疫苗的情况下，减少传播的最有效方法之一是减少病媒蚊子数量。令人烦恼的是，越来越多的蚊子物种，传统上以杀虫剂为目标，显示出^{越来越高的杀}虫剂抗性水平1。与此同时，政府机构积极取消注册或禁止以前批准的杀虫剂，并且^{很少有新的}，有效的化学控制措施正在制定2^，3。这一系列阻碍蚊子控制的障碍促使人们探索替代的非化学技术来减少蚊子数量。

某些蚊子种类对控制抗药性和农药登记问题提出了挑战。埃及伊蚊（L.）是一种突出的病媒蚊子，由于该物种利用未成熟发育和成虫休息的神秘周边栖息地，因此很难通过传统的综合病媒管理进行控制4^，5。与开发住宅周围神秘生境有关的挑战包括难以用杀虫剂喷洒技术到达这些地点，以及公众可能不接受公共卫生病媒控制机构反复进入私人财产进行密集监测和控制活动，这些活动对于有效综合病媒管理至关重要。

幸运的是，昆虫不育技术，一种被证明可以持久控制其他极具挑战性的^{昆虫物种6}的方法，正在佛罗里达州圣奥古斯丁的一系列开创性实验和操作试验中应用于埃及伊蚊问题（KJL，RLA，SCB 未发表的数据）。昆虫不育技术已被应用于包括蚊子在内的一系列昆虫物种，并已^{进行了深入的}审查7^，8。昆虫不育技术利用大量释放经过绝育的群体饲养的雄性，例如，通过暴露于电离辐射或化学物质来压倒雌性自然种群的配偶选择。与野生雌配的绝育雄性由于雄性配子遭受的损害而使卵不育，如果存在足够数量，理论上可以破坏埃及伊蚊的自然种群。

启动了一项昆虫不育技术计划，试图减少佛罗里达州大西洋沿岸城市地区的 埃及伊蚊 数量，该物种最近重新定居，并且正在扩大并给寨卡病毒、登革热或基孔肯雅热等病毒的传播带来公共卫生风险。为了最大限度地发挥与野生雌性相容的潜力，利用目标种群中野生捕获的 埃及伊蚊 建立了一个新的菌落，为计划⁹生产雄性。这是基于一个假设，即当地衍生的、殖民地饲养的雄性更有可能与当地的野生雄性竞争与当地的野生雌配。为了使昆虫不育技术有效，不仅目标区域需要有大量的不育雄性蚊子，而且还必须能够有效地与当地的野生雌性蚊子求偶和交配。

进行了一系列实验，以确定释放的最佳不育雄性数量（KJL，RLA，SCB 未发表的数据）以及使雄性不育而不干扰生存、行为或野生雌性接受的最佳辐射剂量（KJL、RLA、SCB 未发表的数据）。这些数据即将出现在该小组的联合出版物中，但其中一些发现也在本协议中捕获，并且可以用作其他地方新的昆虫不育技术埃及 伊蚊 控制计划的起点。该物种正在不断扩大其范围，昆虫不育技术计划显示出成为控制该种群的具有成本效益的长期解决方案的巨大希望。该协议的目的是在一项有效的公共卫生媒介控制计划中，生产经过绝育的雄性、群体饲养的埃及 伊 蚊，以便系统地释放到室外区域，以破坏当地 埃及伊蚊 种群的自然繁殖周期。

虽然已经发布了用于生产转基因埃及伊蚊雄性的类似协议和工作流程，并在其他地方发布了伊蚊 SIT 或基于沃尔巴克氏体的不相容程序的生产工作流程，但该协议说明了现有协议如何适用于埃及伊蚊的生产、雄性蛹的分离和辐照、标记和包装成年雄性，以及运送到该计划的发布地点^9， 10，11，12，¹³，^14，15，16，^17，18.该协议的标记组件在成熟的操作SIT程序中可能不需要;但是，它已被包括在这里，因为它是在建立SIT计划的早期监测功效和控制整个过程质量的一种方法。蚊虫控制计划通常由地方当局运行，因此它们在其组织的许多方面可能会有很大差异，从规模和资金基础到调整控制策略以最大限度地提高当地成功率。因此，应评估此处描述的协议与可用资源的兼容性。

研究方案

注意:此协议特定于 埃及伊 蚊的处理，但可以修改为对其他蚊子物种有效。

1. 埃及伊蚊 群落的生产和维护

1. 饲养 成年埃及伊蚊 并产卵。
   1. 准备一个 0.6 m x 0.6 m x 0.6 m 的可折叠铝制框架、带有 20 x 20 玻璃纤维筛网的大型养殖笼和一面垂直墙上的伸手可及的 stockinette 套筒。
   2. 在每个饲养笼中放置一个装有 埃及伊蚊 （1:1性别比例）的 1900 mL 塑料桶，将袖子系紧，并将杯子留在原位进行封闭，直到没有更多的成虫出现（即大约 4 天）。此时，取下杯子，并将成鱼饲养笼保持在28-30°C，相对湿度（Rh）>50%和12:12或14:10明暗（L:D）循环。
      注: 埃及伊蚊 蛹的生产在第1.2节中描述。1900 mL 浴缸中的蛹密度应足以让所有蛹同时进入空气。
   3. 将蛹放入饲养笼中 24 小时后，将装有 10% 蔗糖溶液的容器与海绵灯芯一起放置，并将浸泡在蜂蜜中的 10 cm x 2 cm 海绵从每个笼子的铁丝钩中悬挂，为成年蚊子提供单独的水合作用和营养来源。监测海绵和蔗糖容器的干燥或霉菌生长情况，并根据需要补充或更换。
      注意:在小型饲养笼中使用带有 10 cm x 2 cm 海绵灯芯的 120 mL 塑料杯，通过盖子上的切口安装，在大笼子中使用带有 12 cm x 8 cm 海绵灯芯的 460 mL 塑料杯。
   4. 在大多数成虫出现后48-72小时向每个饲养笼提供血粉，此后每2-3天提供一次血粉，以保持大量血喂养的雌性，以最大限度地提高产卵率。在羔羊皮避孕套中填充50-100mL去纤维化的牛血，并在热水浴中加热至约37°C。然后，用布或纸巾拍打并部分擦干避孕套，然后将其放在笼子内的衬纸培养皿上30-60分钟。
      注意:使用前，用水冲洗每个避孕套的内部和外部 2-3 倍以去除润滑剂或其他基质，并检查是否有孔洞。避孕套可以通过冲洗血液并将其储存在一杯冷水中来重复使用 3-5 次喂养。由于一些蚁群可能会受到蚂蚁侵扰，因此可能需要暂停使用避孕套以限制进入。
   5. 每次喂血后等待48-72小时，然后将产卵杯引入每个成年饲养笼中。通过将 200 mL 过滤的蛹水（即水幼虫和蛹饲养）加入一个 460 mL 的塑料杯中来准备产卵杯，杯子配有一张 8-10 厘米高 x 30 厘米宽的种子发芽纸（产卵纸），沿杯子的内周齐平安装。每天检查产卵纸，每2-4天更换一次，并小心储存装满鸡蛋的产卵纸，让它们在>50%Rh¹⁹下干燥24-48小时。
      注意:将产卵杯留在饲养笼中不超过72小时，以防止鸡蛋孵化。
   6. 将成鱼养殖笼维护长达 3-4 周，然后再将其分解并建立新的成鱼养殖笼。
      1. 要打破饲养笼，请取出并清洁产卵杯，存放装满鸡蛋的产卵纸，取出并清洁蔗糖溶液容器和蜂蜜海绵，然后冷冻笼子以杀死所有蚊子。
      2. 清除所有蚊子尸体，并使用纸巾和海绵百洁布用稀释的肥皂和水彻底清洁每个笼子的内部和外部。让干净的笼子干燥至少24小时，然后在下一个饲养周期中使用。
         注意:使用装有高效过滤的真空设备去除可能导致过敏的微粒。蔗糖溶液容器可以清洁并重复使用3-5倍。
2. 从卵中饲养 埃及伊蚊 幼虫
   1. 通过将 80 g 比例为 3:2 的牛肝粉:啤酒酵母混合在 2200 mL 自来水中制备幼虫营养浆料。准备粉碎的鱼食。将鱼片倒入香料研磨机中，研磨至细粉状。
      注意:该浆料在本实验室中被指定为 棕色 。
   2. 使用步骤1.1.5中装满鸡蛋（5，000-10，000个鸡蛋）的产卵纸，垂直于产卵线切割3-7厘米的蛋纸部分，并将其放入装有自来水的460毫升容器中，并加入一小撮粉碎的鱼食片。盖上盖子并剧烈搅拌至少 1 分钟。
      注意:在开始孵化过程之前，蛋纸必须在产卵后至少存放 7 天（但不超过 90 天，这可以减少孵化）以允许胚胎化。鱼食中存在的细菌和藻类会迅速使水脱氧，从而引发幼虫发育。
   3. 将步骤1.2.2中容器的全部内容物倒入用3L自来水和50mL 棕色浆液 制备的幼虫饲养盘中。根据 表1标记锅的开始日期，菌株信息，进料时间表，并储存在28-30°C，>50%Rh和12:12或14:10 L:D周期。
      注意:3 L 水与 50 mL 棕色的比例 基于 材料表中提到的特定幼虫锅中的水深。不同尺寸的平底锅将支持不同的蛹密度，因此需要不同量的水和 棕色 浆液。 表1 中的幼虫摄食率以范围给出;使用量的选择基于经验和使用水浊度、颜色和气味等变量确定发育中的幼虫的整体健康状况;水面上存在细菌膜;活幼虫和死幼虫的数量或比例;以及幼虫的运动性。在第3至6天，喂食未成熟的蚊子，按 表1粉碎鱼的食物。添加水、减少食物和设置比项目所需的多 2-3 个平底锅是管理不健康的幼虫平底锅的方法。

日	添加量营养浆	添加水量	行动
1	50 毫升（浆料）	3000毫升
2	（没有食物）	（无水）
3	1/4 - 1/2茶匙（鱼粉）	500-1000毫升
4	1/2 - 3/4 茶匙（鱼粉食品）	500-1000毫升
5	1/2 - 3/4 茶匙（鱼粉食品）	500-1000毫升
6	1/4 - 1/2茶匙（鱼粉）	500-1000毫升
7	（没有食物）	（无水）	品系蛹和幼虫

表1:大规模饲养埃及伊蚊幼虫的饲喂时间表。

2.雄 性埃及伊蚊 蛹的分离

1. 从幼虫盘中浓缩蛹。一旦达到蛹的近似阈值比例，将每个锅的内容物倒入筛子（尺寸 20-40）。使用挤压瓶自来水将蛹和幼虫从筛子中清洗到3000毫升刻度塑料烧杯中。
   注意:每个 3000 mL 烧杯只能转移 2-3 个幼虫盘，以避免过度拥挤，以便蛹可以舒适地到达表面。预计蛹将在步骤1.2.3中提到的温度和光照条件下孵化后130-140小时之间发育。预计在种蛋建立的同一天会有明显的卵孵化。根据环境条件，大约20-70%的幼虫将化蛹，并准备在6天内过筛。将蛹分布在多个 3000 mL 烧杯中，可确保将体积倒入分离机中。
2. 将雄蛹与幼虫和雌蛹分开。
   注意:此步骤可以由一个操作员或两个操作员执行。
   1. 对于分离雄蛹的单个操作员:
      1. 将步骤 2.1 中产生的每个 3000 mL 烧杯的内容物分配到多个 1900 mL 塑料容器中，以减少溢出和分离器负担过重。通过在分离器底部的水闸下方放置一个刚性浅 4000 mL 收集容器来准备板分离器（图 1）。将两个 3000 mL 刻度塑料烧杯装满约 3/4 的自来水。
         注意: 使用水槽软管代替 3000 mL 塑料刻度烧杯。否则，烧杯需要在整个分离过程中不断重新填充。有关操作蛹分离器的其它细节可在参考文献^12，20中找到。
      2. 将水倒入玻璃板之间的空间，并顺时针或逆时针调整顶部和底部旋钮，以使水连续流过，同时产生距板底部约1.25厘米高度的积水。用胶带标记底部旋钮的起始位置。一旦积水以相同的高度和排水率均匀分布在玻璃板的底部，就开始通过板之间的空间倒入蛹和幼虫容器的内容物。
         注意:小（雄性）和大（雌性）蛹之间应有明确的区别;否则，将此批次冲洗干净，并调整上旋钮以减少板之间的空间。
      3. 在通过分离器缓慢倒水的同时，从带状标记的起始位置以逆时针方向~1-2厘米的方式连续旋转底部旋钮，直到大多数或所有幼虫冲过并沿着水闸滑入收集容器。
         注意:当一只手用于倒水时，另一只手一次旋转一个旋钮，但以较小的增量均匀且小的增量，以缓慢打开盘子。大多数幼虫很快就会被冲穿，但也会有一些幼虫被雄蛹捕获。这些离散幼虫将受到辐射，但发育滞后，并且不会与具有局灶性蛹队列的成虫接近。
      4. 将幼虫丢弃或回收回菌落，但无论哪种情况，在雄蛹开始通过分离器洗涤之前，将它们从收集容器中取出。通过停止水流来暂停该过程，同时通过倒入#30筛子清除水闸底部的收集容器中的幼虫，该筛子被反冲洗到单独的容器中。
         注意:幼虫首先流过，其次是雄蛹，最后是雌性（图1）。
      5. 继续倒水并旋转底部旋钮，直到雄性幼虫被冲洗并分离到收集容器中。在下一步转移雄蛹之前，暂停该过程以检查并从收集容器中取出幼虫。
         注意:分离雄性所需的冲洗次数取决于倒水的速度和旋钮的旋转速度。冲洗幼虫通常需要2000-2500毫升的水，冲洗雄蛹需要1000-1500毫升的水，冲洗雌蛹需要200-400毫升的水。
      6. 将雄蛹从收集容器中倒出，通过水槽上的#20筛子。使用 1000 mL 挤压瓶自来水从筛子中反冲洗雄蛹，同时倒入单独的 1900 mL 容器中。
      7. 将所有雄蛹分离后，继续通过分离器倒水，并调整下旋钮以冲洗通过雌蛹。使用步骤2.2.1.6中描述的筛子过程将雌性转移到单独的容器中，直到将所有未成熟的蚊子从分离器中冲洗出来。丢弃雌蛹。处理完批次后，将旋钮返回到其原始起始位置，并对下一批重复该过程。处理完所有批次后，保持板打开，以便分离机可以干燥。
         注意:使用此设备无法完美分离，这需要耐心和练习。顽固的蛹或幼虫可以用大量的水流排出，但不能将它们推到两侧的程度，这可能会污染未来的洪水。
   2. 对于分离雄蛹的两个运算符，修改第 2.2.1 节，如下所示。
      1. 第一个操作者:将水倒入分离器，并逐渐旋转旋钮以分离幼虫、雄蛹和雌蛹。
      2. 第二操作者:将每个阶段收集到水闸容器中后，筛出水闸容器的内容物，将幼虫、雄蛹和雌蛹分隔到多个单独的水闸收集容器中。如果没有水槽软管，请保持大烧杯装满水。

图 1:含有一批未成熟 埃及伊蚊的蛹隔膜。 分离首先通过分离器倒水，同时逆时针旋转底部旋钮 1-2 厘米，直到目标组（即幼虫、雄蛹或雌蛹）尽可能多地与剩余的组分离（左图）。右图显示了幼虫（最低带）、雄蛹（中带）和雌蛹（上带）的分离。 请点击此处查看此图的大图。

3.辐照用雄 性埃及伊蚊 蛹的制备

1. 将雄蛹分成塑料60毫米培养皿。
   注意:所需的培养皿数量取决于可用于照射的雄性蛹数量:步骤1.2中的一个幼虫饲养盘将填充大约1.5个培养皿。蛹龄从1岁到40小时不等。在该协议中，培养皿的较小直径较深的一半称为 底部，较大直径较浅的一半称为 顶部。
   1. 准备滤纸的预切盘，以适合培养皿底部的内径。在培养皿的每个底部放置一个水湿的滤纸盘，以在整个运输和照射过程中保持蛹的水分。
   2. 将蛹转移到培养皿中。用筛子过滤在步骤2.2.1.6中收集的雄蛹，并将蛹洗入1000mL刻度烧杯中，用尽可能少的水。小心地将蛹倒入培养皿中，直到每个滤纸盘均匀地覆盖有一层蛹（图2A - C）。将培养皿排成一排排列在桌子的边缘，以方便倾倒。
      注意:过滤蛹的替代方法是将塑料 3 mL 巴斯德移液管的尖端剪成足够大的直径以容纳蛹。使用移液管将蛹从步骤2.2.1.6中产生的容器直接转移到滤纸盘上，以便在每个培养皿中有一个紧密排列的蛹层。这仅适用于小批量。
   3. 使用未改变的 3 mL 巴斯德移液管去除培养皿底部的积水，以防止在步骤 （3.2） 和运输过程中蛹移动。

图2:将蛹转移到培养皿中进行照射 。 （A） 将过筛的蛹倒入 1000 mL 塑料烧杯中并反冲洗。（B）烧杯中保留最少的水，以便于倒入培养皿中。（C）培养皿沿表面边缘排列，以方便倒入单层蛹。（D） 装满蛹的培养皿堆叠并固定，以便运送到辐照设施。 请点击此处查看此图的大图。

2. 对蛹进行以检查雌性污染。在解剖镜下，使用探针旋转每个蛹以检查腹面是否有指示男性的大尺寸生殖器叶（图3）。去除并丢弃具有减少或较小的生殖器叶的蛹，这些蛹表明雌性，并用相同数量的雄性蛹替换以保持正确的计数。
   注意:在操作程序中，此步骤是不切实际的，因为蚊子数量众多，而且辐照后的分离、转移、辐照和准备笼子都是在一天内完成的，时间有限。可以对来自选定培养皿的样品进行质量检查，特别是在SIT程序开发的早期阶段。

图3:使用生殖器叶对蛹进行。 （A）雌性（）和雄性（）埃及伊蚊蛹的腹侧视图和（♂ ♀ B）侧视图，指出生殖器叶以显示性二态性。请点击此处查看此图的大图。

3. 用培养皿的顶部覆盖底部，并用实验室胶带固定。用松紧带将胶带培养皿捆扎成适合照射室的堆叠，并密封在贴有标签的 3.8 L 可重复密封袋内（图 2D）。不要让蛹在 >1 小时内保持未被覆盖。

4.雄性 埃及伊蚊 蛹的照射

1. 通过切割 1 cm² 平方的薄膜并将每个正方形放入其单独的信封中，从同一批次制备剂量测定膜。
   注意:每天使用的所有胶片都是同时切割的。这减少了存储引起的少量变化。每个堆栈所需的正方形数量为1 +（培养皿数量）。
2. 准备一个试剂盒以带入辐照设施，其中应包括实验室计时器、实验室胶带、永久性标记、准备好的剂量学胶片信封、剂量学徽章和带有清单的实验室便笺表，以跟踪关键信息（图 4）。

图4:完成剂量反应集的实验室书大纲-IR 表。 以红色标出的文本框（用红色箭头标记）表示不同部分的有用注释并重申关键信息。 请点击此处查看此图的大图。

3. 将蛹运送到辐照设施。将步骤3.3中的雄蛹培养皿放在绝缘容器中，并在运输过程中避免阳光直射并装有空调。
4. 准备成堆的培养皿，以便在辐照器上照射。堆叠适当数量的培养皿以适合照射室，剂量测定膜包络位于每个培养皿之间以及堆叠的顶部和底部。用实验室胶带固定信封和整个堆栈，以防止溢出并便于将堆栈放置在腔室中。
5. 照射雄蛹的培养皿。将培养皿堆放在腔室中的刚性金属网上，以根据特定照射单元²¹的先前剂量映射，将培养皿放置在正确的高度以获得最佳暴露锥。激活辐照器上的转盘并进行辐照，同时启动实验室计时器。照射适当的间隔以达到所需的剂量（示例如 表2所示）。
   注意:本协议基于铯-137辐照器（见 材料表）和50 Gy的目标剂量。由于 Cs-137 会随着时间的推移而衰减，因此每年通过使用丙氨酸剂量计进行剂量反应系列来调整剂量率，并在大约 10% 的辐照样品中补充用于常规剂量测定的放射致变色膜和丙氨酸。鉴于目前的剂量率为8.8 Gy/min，达到50 Gy的目标剂量需要5分钟41秒的暴露。常规薄膜剂量测定如步骤4.7中所述进行。丙氨酸颗粒剂量测定法在德克萨斯A&M大学的国家电子束研究中心或美国马里兰州盖瑟斯堡的国家标准与技术研究所进行。

剂量（Gy）	时间（基于 8.8 Gy/分钟）
0	那
10	1 分 8 秒
30	3 分 24 秒
50	5 分 41 秒
65	7 分 23 秒
85	9 分 39 秒
100	11 分 22 秒
110	12 分 30 秒

表2:铯-137辐照器的示例剂量时间。

6. 一旦超过规定的时间，从辐照器中取出培养皿，然后小心地拆除烟囱。用堆叠中的日期和位置标记所有培养皿和胶片信封。密封信封并存放以进行剂量测定。将培养皿重新包装到绝缘容器中，以便运回主实验室。
   注意:记录成虫在照射过程中是否出现，并标记受影响的培养皿，以便在将蛹放入饲养笼时成虫不会逃脱（步骤5.2）。
7. 通过暴露后约24小时测量胶片来用剂量测定膜确认照射剂量。激活剂量测定读数器并使其平衡至室温。使用阅读器随附的镊子装入薄膜，并按照制造商的说明读取同一批次的辐照薄膜以及未照射的空白薄膜。将读数器归零，读数之间没有薄膜，并记录数据，如图 5所示的示例数据手册所示。
   注意:此协议基于 ND0.5 和 ND1.0 QA 过滤器组标准。测量薄膜时，哑光面朝向操作员非常重要。

图 5:填充了示例数据的剂量学数据表。 列标题提示操作员捕获关键数据以供以后分析。 请点击此处查看此图的大图。

5. 将受辐照的雄性 埃及伊蚊 蛹养成成虫

1. 清洁并准备30厘米x 30厘米x 30厘米的小塑料养殖笼，以便在返回主实验室时准备好辐照蛹。对于每 2 个辐照雄性蛹的培养皿，准备 1 个饲养笼。如步骤1.1.3所述，在每个养殖笼中放养一个装有460mL自来水和10%蔗糖溶液容器的半装塑料杯。
2. 从辐照设施返回后，立即将辐照的蛹转移到准备好的养殖笼中。使用挤压瓶水小心地将每个培养皿中的蛹清洗到每个饲养笼塑料杯中的 460 mL 水中。24小时后，将杯子转移到含有营养来源的新，干净的饲养笼中，并等待成年，雄性照射埃及 伊蚊的剩余封闭。
   注意:如果在照射过程中出现蛹，请将带有传单的培养皿打开到空笼子中，然后继续步骤5.2。丢弃收集在这个笼子里的雄性。蛹在24小时后转移到新的饲养笼中，因为雄性先于同一队列的雌性出现，隔离出苗的日子可以减少雌性污染的发生率并确保雄性准确老化。

6. 标记和称重辐照成年 埃及伊蚊 雄性

注意:协议的这一部分假设两个人正在执行任务;对于 1 人，请参阅 6.4。

图6:将标记的辐照埃及 伊蚊 雄性包装到释放容器中。 （A） 释放容器显示用遮蔽胶带、订书钉和热胶固定在卡片纸圆筒侧面切开的孔上的丝袜。挡板就位，侧面贴有遮蔽胶带标签背衬。表圈保留了紧拉的薄纱网盖;松紧带（不可见）也将薄纱固定在表圈下方。（B）一批麻醉的男性在一个小卡纸杯中用粉红色染料翻滚的过程中。（C） 绝缘集装箱内的四个释放容器。请注意，丝袜套筒朝向运输容器的中间，包装材料塞在释放容器周围，营养和水合作用来源在每个释放容器的顶部就位，由倒置的培养皿底部覆盖，由交叉的松紧带和胶带固定。 请点击此处查看此图的大图。

1. 准备卡片纸释放容器。
   1. 在距离底部 1.5-3.0 厘米处的带盖圆柱形 3.9 L 卡片纸容器的侧面切一个直径为 11.5 厘米的孔，以便孔不会被盖子覆盖（图 6A）。
   2. 切一个 40-50 厘米长的丝袜，并在 6.1.1 中切出的 11.5 厘米孔的内侧装订它的一端。使用打开的标准办公室订书机，以便将订书钉从容器内部强制穿过库存和卡片纸，并进入合适的工作表面，例如一块硬质挤出聚苯乙烯泡沫。使用平头螺丝刀压接订书钉，将丝袜紧紧固定在孔的周边，并将遮蔽胶带固定在压接侧以防止卡住。用热胶将圆柱体内侧的 stockinette 边缘密封到卡片纸上，并交叉检查整个组件是否有逃生孔。
   3. 通过从盖子上取下内盘来创建固定挡板，并切出一个 33 厘米 x 33 厘米见方的尼龙薄纱网，使其足够细，以留住成年雄性 埃及伊蚊 。将网格放在圆柱体的开口端，并将挡板安装在网格上，使其固定到位，没有间隙。向下拉网格，使其突出到挡板下方，使网格穿过开口端，并用橡皮筋将突出的网格紧紧地密封在圆柱体上。
   4. 在用 8 厘米标签胶带覆盖的挡板侧面放置一块 10 厘米的遮蔽胶带，以便可以轻松更换标签胶带，而不会撕裂挡板。
      注意:释放容器经久耐用，如果处理得当，可以重复使用>10倍。在引入每批新的标记、辐照、成年、雄性蚊子之前，请检查袜子是否牢固地固定在容器上，并在需要时及时进行维修。
2. 准备称重和标记站。
   1. 将大约 50 mg 标记染料倒入 240 mL 卡片纸容器中，并将染料以粉末形式均匀地铺在容器的内表面。轻轻拍打以丢弃多余的染料。使用清晰标记的杯子进行多种染料，以保持颜色分离。
   2. 在0.0001 g电子天平上去皮100-500 g称量船;创建数据表单（表3）;并将四张 215.9 毫米 x 355.6 毫米的复印纸粘在一起，制成 431.8 毫米 x 711.2 毫米的工作台面。

释放容器	蚊子的重量	笼数	成批雌性	男性人数	释放容器	总质量
粉红 I	0.024	D1 #1		25	粉红 I	2.03
粉红 I	2.007	D1 #1	7		粉红二	1.99
粉红二	1.990	D1 #1			粉红三	2.03
粉红三	0.026	D1 #3		25
粉红三	2.000	D1 #3	18

表 3:称重站数据表。

3. 用荧光色素标记定量的成年辐照男性批次。
   1. 将成年蚊子（2.5-3.5天大）从每个饲养笼转移到吸气器瓶中。从步骤5.2中取出饲养笼中的营养来源，并将整个笼子放入一个大的CO₂ 室中5-7分钟，敲击容器的侧面以驱除可能附着在饲养笼上的蚊子。暴露时间过后，从室内取出饲养笼，并将所有成年蚊子吸入一系列塑料吸液瓶中。
      注意:99.5-100% CO₂ 的施用来自带有调节器、黄铜倒钩和硅胶管的罐，该罐以 6 L/min 的流速引导到腔室中。清理饲养笼所需的小瓶数量取决于笼子中的蚊子数量和操作员的熟练程度，但每个笼子通常需要 3-5 个小瓶。选择具有小型快速更换小瓶的吸气器，以方便分批管理成年蚊子，例如，使用60 mL聚苯乙烯收集瓶，一端用20 x 20目铝筛密封，另一端使用透明醋酸纤维瓣阀。整个笼子在抽吸前被麻醉，以减少将蚊子转移到小瓶中的时间，以减少对蚊子的压力并保持方案易于处理。
   2. 按性别对每个饲养笼中的所有成年蚊子进行分类。
      1. 将步骤6.3.1中的第一个小瓶暴露在小室中CO 2中4分钟，然后轻轻摇出麻醉的蚊子，将它们散布在步骤6.2.2制备的白纸工作表面上。
      2. 将一个新的空小瓶装入吸气器中，并小心地从工作台上吸出所有雄性，并将该小瓶传递到称重站（步骤6.3.3）。统计留下的任何雌性，并将它们吸入单独的小瓶中并丢弃，以及任何压碎的雄性。
      3. 对 6.3.1 中的剩余小瓶重复此过程，但在性别分拣过程中的某个时刻，生成一个只有 25 名男性的单独小瓶，该小瓶也传递到称重站。重复步骤 6.3.2。对于每个养殖笼。
         注意:在处理辐照的成年雄性进行性别、称重和标记时，请跟踪每批雌性的数量，这是用于蛹性别分类和整个过程的故障排除和质量保证的关键数据。如果雌性计数高于预期，则第二个人应抽取雌性，而主要操作者则吸出雄性。重要的是对每个饲养笼中的25只雄性样本进行称重，以计算每只蚊子的平均重量，这将用于估计在协议结束时释放的标记辐照雄性的数量。
   3. 对成批成年雄性蚊子进行称重和染色。
      1. 在称重站，将来自站（第6.3.2节）的第一瓶成年雄性蚊子放入一个小的CO 2室中2分钟，并小心地将蚊子摇入步骤6.2.2准备的去皮称重船中。记录蚊子的重量，将蚊子倒入6.2.1制备的染杯中。
      2. 顺时针和逆时针缓慢倾斜并旋转杯子 1 全旋转，使蚊子接触杯子内表面上的粉末涂层，并全部轻轻撒上染料（图 6B）。将标记的蚊子倒入称重船中。
      3. 快速进行下一步，以免蚊子恢复并逃脱。重复此步骤，直到处理完第 6.3.2 节中的所有小瓶。
         注意:记录第6.3.2节中为每个饲养笼产生的25只雄性单独小瓶中的雄性体重，并用于计算该笼中每只雄性的平均重量。
   4. 在释放容器中装载有标记的辐照成年雄性。稍微折叠包含麻醉，标记，辐照的雄性蚊子的称重船，从第6.3.3节的末尾开始。创建一个通道，然后将该通道引导通过 stockinette 套筒将雄性转移到释放容器中。继续添加蚊子，直到释放容器中约有2.0克或1500-3000只雄性蚊子，并将丝袜套系紧。在释放容器的边框上标记染料颜色、容器编号和蚊子总重量的标签胶带，并将这些数据复制到步骤 6.2.2 中的表格中。
      注意:在任何生命阶段处理蚊子都会引起压力，并会降低存活率或活力。该协议中描述的一系列麻醉可能会影响蚊子;然而，试图在每一步都追捕和吸出未麻醉的蚊子会引发更大的压力和不可持续的方案。将每个释放容器中的蚊子总重量除以第6.3.3节中产生的每只雄蚊的平均重量，得出该释放容器中雄蚊子数量的估计数;每个放生容器的雄性不应超过2克，相当于大约1个大型养殖笼。
4. 修改单个操作员的标记协议
   1. 首先对所有大笼子进行性别分类。将每个大笼子暴露在CO₂ 中4-5分钟，并将所有蚊子吸入4-5小瓶中。将每个小瓶暴露在CO 2中_2-3 分钟，将所有蚊子倒在白纸工作台上，取出雌性并计数，然后将雄性放回其大型种群笼中。
   2. 称重和标记
      1. 从步骤6.4.1中产生的第一个雄性保持笼开始:去除营养源并在大型CO₂ 室中麻醉雄性5-7分钟。将麻醉的男性均匀地吸出到单独的小瓶中。按照生产顺序对每个保持架重复此步骤。
         注意:每个保温笼将生产大约 2-3 个拥挤的小瓶。按照生产顺序处理雄性笼子，可以最大限度地延长每个雄性笼子的恢复时间。
      2. 麻醉在步骤6.4.2.1中产生的第一个小瓶。在小CO 2室中_1-2 分钟。将少量蚊子倒在白纸工作台面上，将25只雄性蚊子吸入新小瓶中，并按照6.3.2中的步骤确定该笼子的每个雄性平均重量。将任何其他雄性物放回源小瓶中，或吸出到新的单独小瓶中以供稍后处理;如步骤6.3的其余部分所述，继续称重，标记并转移到第一个小瓶中其余男性的释放容器中。重复步骤 6.4.2.2。（除了将25名雄性隔离到单独的小瓶中）用于步骤6.4.2.1中产生的其余小瓶。按照它们的生产顺序，然后转到6.4.1中生产的下一个性别分类饲养笼。
         注意:一个人的工作流程较慢，一些雄性蚊子需要多次麻醉。不断寻找并清除雌性蚊子。

7. 标记的、经过辐照的成年雄性埃及伊蚊的包装和运输放行容器

1. 准备要装运的放行容器。一旦释放容器装满了标记的雄性，将 4 个用 10% 蔗糖溶液蘸湿的棉球放在网盖上，并盖上培养皿的倒置底部，由两条橡皮筋固定到位在整个容器周围和培养皿上形成十字。将一块遮蔽胶带放在两个橡皮筋的X上，以将它们保持在倒置的培养皿顶部。
   注意:确保含有10%蔗糖溶液的棉球未饱和到滴落点，这会损坏容器并诱捕和杀死蚊子。
2. 将卡片纸释放容器包装到挤出聚苯乙烯泡沫运输冷却器中。在冷却器盖上戳4个通风孔，并用棉花遮挡，以防止蚂蚁和逃跑的蚊子。将 4 个释放容器直立放入运输冷却器中，每个容器的库存面向中心（图 6C）。在每个容器之间和中心塞上气泡膜以稳定它们。用气枕填充运输冷却器中的其余空间，或将第二层 4 个释放容器直接堆叠在第一层的顶部，并同样用气枕稳定。
   注意: 释放容器应足够稳定，以便在摇晃时不会移动。封装内的温度是环境温度。
3. 准备装运冷却器以进行交付。用通风盖密封运输冷却器，放入纸板外包装中，胶带关闭，然后通过隔夜快递运送到释放地点。

结果

警惕和充分的蚊子饲养包括蜂群笼中雄性和雌性供应均衡，保持新鲜蔗糖溶液和蜂蜜，以及始终如一的高质量血液喂养。这些条件将提供最适合用于昆虫不育技术幼虫饲养盘的密集包装卵片。正确储存和使用干蛋片，例如系统贴标签以方便从最旧到最新的使用，将支持所有平底锅的均匀阴影。在孵化前将所有幼虫饲养盘装满水可以减少卵片在孵化容器中的时间并促进健康发育。从孵化到化蛹的幼虫盘的维护需要群体人员的仔细参与，因为根据发育阶段和环境变量，一些平底锅可能需要或多或少的食物或额外的水。如果在预定的蛹性别分离日之前发育阶段出现问题，则应在过程中更早地进行调整，例如更早或更晚地孵化，调整食物或改变孵化器温度。

该协议中的饲养过程不会使所有卵及时孵化成可以辐照并用于控制目的的蛹。当蛹需要分离时，20%至50%的蜂群饲养的蚊子仍将是幼虫。然而，这些幼虫并没有被浪费，而是让它们成熟24小时，以产生额外的蛹，这些蛹可以与前一天分离的雌蛹结合并回收回群落笼中。在群落笼中，蛹将被允许成熟为成虫，交配，血液喂养，并产生维持昆虫不育技术项目的卵。

分离蛹，将蛹倒入培养皿中，照射，照射后放入成人笼中必须在一天内完成;因此，应分配足够的时间来舒适地处理所有步骤。放行容器的组装和准备应在标记过程之前完成。当装运箱从放行地点退回时，应检查放行容器并为下次使用做好准备。丢弃湿棉球，晾晒湿释放容器，清洁培养皿，更换网眼，从容器中取出松紧带，在不使用时，将大大延长释放容器的使用寿命。

鉴于 COVID-19 病毒大流行的全球现实，这种通常是多人操作的协议已被修改为每个步骤都可以由一个人在实验室中单独工作。单人方案阻碍最大的步骤是性别、标记、称重和蜂群饲养维护步骤。如果在不同的房间中同时有多个分离器，则一个人按性别分离蛹就足够了。在工作场所发生社交距离的大流行情况下，需要配备多个站点才能完成从性行为到打包的步骤。根据操作员的速度，一个人~4小时对15，000只蚊子进行，然后再花1-2小时来标记，称重和包装它们。两人方案减少了蚊子被麻醉进行标记的时间，并减少了整体工作时间。然而，即使在两人的情况下，由于蚊子镇静期间工作时间有限，每个释放笼分配完整的 2.0 克蚊子也可能具有挑战性。尽管清洁和准备幼虫和成虫饲养材料的过程非常耗时和劳动密集型，但可以对其进行划分，以便各个操作员在大流行期间可以独立安全地工作。

释放成年、标记的、经过辐照的 埃及伊蚊 雄性不在本协议的范围之内，但在此简要介绍。如 表3所示，释放标记的、经过辐照的雄性蚊子的过程首先根据重量（从而推断出不育雄蚊的数量）确定释放容器的均匀释放分布。将货物运送到病媒控制区后，打开箱子，评估释放容器是否存在死亡率或释放容器状况的任何问题。然后让释放容器中的蚊子适应环境温度和湿度1-2小时，然后再运输到治疗区域。在对 埃及伊蚊野生种群的热点进行密集监测后，确定了治疗区的释放点。释放的时间、频率和密度与物种的生物组学以及气象、公众支持和实验室饲养能力相平衡。

由于特定的释放容器与特定的释放位点相匹配，因此在打开释放容器之前，必须通过切割顶部的网眼来交叉检查标签，允许操作员使网状物变形，以便一部分雄性可以逃脱。在容器的每个指定释放点重复这种部分释放方法，直到所有自由飞行的雄性都被释放。然后，在各自分配的发布位置对每个发布容器重复此过程，直到处理完所有容器。或者，在蚊子被释放后，任何没有自由离开的死亡或残疾蚊子都可以收集到培养皿中，并贴上标签，用手计数或称重以纠正估计的释放数量。对目标地区以及可能在非干预控制地点的野生 埃及伊蚊 成虫、卵和未成熟阶段进行持续和普遍的监测，以评估昆虫不育技术操作的有效性。

讨论

启动以使用辐射的昆虫不育技术为特征的控制计划需要建立当地的 埃及伊蚊菌株。这一步至关重要，可以让SIT真正与类似的控制技术区分开来。通过从当地的蚊子菌株开发该项目，产生的雄性可能会具有使它们能够适应环境变化和线索的行为，并与附近的野生雌性定位和交配。此外，与释放非本地转基因蚊子相比，释放受辐照的当地雄性蚊子可能不会产生负面舆论，例如，释放一种非本地转基因蚊子，例如，可以将新的等位基因引入当地蚊子种群。

花费大量资源饲养大量蚊子，却只能将其中约一半用于控制目的，这是 埃及伊蚊 昆虫不育技术计划的局限性。应改进饲养方案，将幼虫的成熟压缩到更明确的时间范围内，届时蛹将准备就绪。这将允许在最佳分离时间收集更多的蛹。然而，额外的蛹需要处理会增加收集蛹时更多雌性化蛹的风险，因此增加了雌性最终与雄性一起进入培养皿并可能被释放的可能性。尽管受辐照的雌 性埃及伊蚊 的寿命、摄血行为和产卵行为在成虫中有所减少，但偶然释放雌性与受辐照的雄性一起释放并不是一个好的策略²².因此，应继续优先考虑尽量减少无意中与雄性分开、照射、标记和释放的雌性数量。

昆虫不育技术计划的成功最终取决于蜂群饲养的辐射雄性的成功配偶竞争。保持雄性竞争力依赖于详尽的实验衍生剂量选择，并最大限度地提高种群中不育:野生雄性的估计比例。剂量选择由几个关键因素决定，包括寿命、生育能力、繁殖力和蛹死亡率。据观察，雄性蚊子将表现出随着辐射增加而接近零的渐近生育曲线（KJL，RLA，SCB未发表的数据）。同时，雄性蚊子的寿命和活动水平随着辐射剂量的增加呈指数级下降（KJL，RLA，SCB未发表的数据）。因此，与其确定男性产生 99.9% 不育率的剂量，不如在支持生存的同时关注较低的不育百分比。一旦确定的剂量范围不能区分受辐照雄鱼与未受辐照雄鱼的寿命或蛹死亡率，就应对生育能力进行进一步评估，以确定使雄性绝大多数不育但具有竞争力的剂量。

同时，将种群中雄性蚊子的数量与释放的受辐射雄性蚊子的数量进行比较至关重要。这可以通过从同一位置以及SIT计划开始之前，期间和之后从目标释放区域内和周围的不同位置重复收集雄性来实现。应进行标记、释放、重新捕获研究，以评估野生雄性蚊子与释放蚊子的比例。标记、释放、重新捕获研究依赖于从特定点释放已知数量的标记蚊子，然后它们在初始释放点附近的点重新捕获。通过比较距离释放点的重新捕获的雄性和野生雄性的数量，可以估计该地区雄性的一般野生种群，以便释放不育雄性的竞争比例²³。通过释放更多的不育雄性和/或通过经典控制手段（如源头减少、未成熟对照或杀成虫处理）减少野生种群，可以实现不育:野生雄性比例的最大化。

为了衡量不育雄性释放的有效性，可以按时间顺序将成人收集与非干预区域进行比较。随着不育雄性被释放，并且与可比较的非干预区域相比，一个地区收集的雄性和雌性数量减少，那么可以假设这是由于释放的不育雄性成功地胜过当地可育雄性。在干预和非干预部位部署的产卵捕集杯中也可以观察到这种效果。卵仍然可以在干预部位产生，但如果孵化次数少于非干预部位的孵化次数，则可以假设它们没有受精，因为雌性与不育的雄配。越来越多的未受精卵产卵最终可能导致产卵减少，因为干预部位^没有更换雌性8^，24。

昆虫不育技术技术和计划的未来方向自然会扩展到其他医学上重要的蚊子种类。例如，鉴于埃及伊蚊和白纹伊蚊的生物组学非常相似，这项技术可能很容易适应控制白纹伊蚊。其他感兴趣的病媒蚊种包括五筋膜库蚊、跗骨库蚊和各种按蚊属。提高这项技术的功效取决于增加在特定时间产生的雄蛹的能力，这可以通过遗传操作或人工选择来实现，并提高雄性竞争力，这可以通过增加阳刚之气、生育能力或寿命来实现。

归根结底，昆虫不育技术计划并不是控制蚊子的灵丹妙药。相反，它们是一套其他控制技术（如IVM程序）中的工具，可以交叉补偿技术之间的弱点。例如，虽然化学控制提供了快速和廉价的控制，但它也助长了耐药性和非目标死亡率的发展;虽然昆虫不育技术具有物种特异性，不太可能产生抗药性，但必须永久生产和释放昆虫不育技术雄性昆虫不育技术，以控制来自病媒控制区以外的移民种群。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-1/8" wrench (1" (1 inch) = 2.54 cm)	Craftsman	CMMT44707
1/2 pint cardstock cup (1/2 pint = 236.5 mL)	Science Supplies WLE corp	1/2 pint
1/4" tubing - tygon	Hudson Extrusions	LLDPE1/8 X 1/4 BLK	to attach to CO2 gas regulator
1/8" brass barb w/ MIP connection	B&K	BHB-85NLB	to attach to CO2 gas regulator
1000 mL graduated plastic beakers with handle	Thermo Scientific	1223-1000
3000 mL graduated plastic beakers with handle	Thermo Scientific	1223-3000
Adult large cage	Bioquip	1450D
Aspirator vials	Bioquip	2809V
Bovine liver powder	MP Biomedicals	290039601
Brewers yeast	MP Biomericals	02903312-CF
CO2 regulator	Randor	64003038
CO2 tank (20# canister)	Praxair	CDBEVCARB20
Collection basin	Treasure Gurus	KI-ENAMELBOWL	for separator
Cotton balls - large	Fisher Scientific	22-456-883
Deli cups w/lids - 470 mL	Pactiv DELItainer	PCTYSD2516
Deli cups w/lids - 1900 mL	Berry Global	T60764
DoseReader 4			ND0.5 and ND1.0 QA Filter Set standards
Dosimetry film	Far West Technology, Inc.
Filter paper	Millipore	AP10045S0
Flashlight aspirator	Bioquip	2809D
Forceps - fine featherweight	Bioquip	4748 or 4750	featherweight
GAFchromic			radiochromic film
Gammator M	Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ		Cesium-137 irradiator
Hand held mechanical aspirator	Clarke Mosquito	13500
Lambskin condoms	Trojan	Naturalamb
Large CO2 chamber	Sterilite	Walmart # 568789514
Larval rearing pans	Blue Ridge Thermoforming	01-FG-400-3N-ABS	Dimensions: 22.375 x 17.5 x 3 (inches)
Magnets - 20# pull	Master magnetics	MHHH20BX
Marking dye	Dayglo	ECO-11	Aurora Pink
Marking dye	Dayglo	ECO-17	Saturn Yellow
Mesh	Falk		T301
Pasture pipettes	Thermo Scientific	02-708-006
Petri dishes - large	VWR International	25384-090 CS
Petri dishes - small (60 mm x 15 mm)	Fisher Brand	FB0875713A
Pupa separator	J.W. Hock	1512
Red rubber hose	Welch	331040-5
Release containers	Science Supplies WLE corp	1 gallon
Rubber bands - cross #19	Alliance	ALL37196
Rubber bands - latitude #64	Skillcraft	NSN0589974
Scale	Ohaus	H-4737
Seed germination paper - Heavy stock 76#	Anchor Paper	#76
Shipping coolers- 16 x 13 x 12.5"	MrBoxonline.com	Husky Foam Cooler kit
Sieve #20	Advantech	20BS8F
Sieve #30	Advantech	30BS8F
Small cage - Bug Dorm	MegaView	Bug Dorm-1
Small CO2 chamber	Mainstays	Walmart # 562922221
Souffle cup lid	SOLO	41165277456
Souffle cups - 4 oz (1 oz = 29.6 mL)	SOLO	41165024104
Sponge	ocelo	MMM7274FD
Squeeze bottle	Dynalon	3UUP6
Stereoscope	Meiji Techno	EMZ-5
Stockinette	BSN Medical	30-1006
Styrofoam			extruded polystyrene foam
Tropical fish flake food	Tetra	4.52 pound
Vaccum chamber - desiccator	BelArt	T9FB892757
Weigh boats	Globe Scientific	3621