운영 멸균 곤충 기술 프로그램에서 방출하기 위해 조사되고 표시된 수컷 Aedes aegypti 모기 준비

요약

무균 곤충 기술 (SIT)은 화학적 통제에 내성이있을 수있는 의학적으로 중요한 특정 모기 개체군을 통제하는 데 사용됩니다. 여기에서는 Aedes aegypti 모기를 표적으로 하는 운영 SIT 프로그램에서 방출하기 위해 무균 수컷 모기를 대량 사육하고 준비하는 방법을 설명합니다.

초록

뎅기열, 지카 및 치쿤 구냐와 같은 인간 질병의 통제는 예방이 없기 때문에 벡터 인 Aedes aegypti 모기의 통제에 의존합니다. 모기 벡터의 제어는 미성숙 및 성충 단계에 적용되는 화학 물질에 의존 할 수 있으며, 이는 비 표적의 사망률에 기여할 수 있으며 더 중요한 것은 벡터에서 살충제 내성을 유발할 수 있습니다. 무균 곤충 기술 (SIT)은 야생 암컷과 교미하여 생존 할 수없는 자손을 생산하는 살균 된 성인 수컷의 방출을 통해 해충 개체군을 제어하는 방법입니다. 이 논문은 Aedes aegypti 모기의 통제를위한 운영 SIT 프로그램에 사용하기 위해 무균 수컷을 생산하는 과정을 설명합니다. 여기에 설명된 것은 식민지 사육 및 유지, 수컷과 암컷 번데기 분리, 성인 수컷 조사 및 표시, Aedes aegypti 수컷을 방출 장소로 운송하는 것을 포함하여 프로그램에서 사용되는 단계입니다. 또한 절차상의 주의 사항, 프로그램 제한 사항 및 향후 목표에 대해서도 논의됩니다.

서문

모기 매개 병원체가 인간에게 전염되면 전 세계적으로 매년 수백만 건의 질병과 사망이 발생합니다. Zika 또는 뎅기열과 같은 모기 매개 질병에 대한 효과적이고 승인 된 백신이없는 경우 전염을 줄이는 가장 효과적인 방법 중 하나는 질병 벡터 모기 개체수를 줄이는 것입니다. 성가시게도, 전통적으로 살충제의 표적이 되는 모기 종의 수가 증가하고 있으며,^{살충제 내성 수준이} 증가하고 있습니다1. 동시에 정부 기관은 이전에 승인 된 살충제를 적극적으로 등록 취소하거나 금지했으며 새롭고 효과적인 화학 물질 관리 조치가 거의 개발되지 않고 있습니다 ^2,3. 모기 통제에 대한 이러한 장애물의 별자리는 모기 개체수를 줄이기위한 대체 비 화학 기술의 탐구에 동기를 부여했습니다.

특정 모기 종은 내성 및 살충제 등록 문제를 통제하는 데 어려움을 겪습니다. Aedes aegypti(L.)는 미성숙 발달 및 성체 휴식 ^4,5를 위해 이 종이 착취하는 비밀스러운 주변 서식지로 인해 전통적인 통합 벡터 관리를 통해 제어하기가 매우 어려운 저명한 질병 벡터 모기입니다. 거주지 주변의 비밀 서식지 착취와 관련된 문제에는 살충제 살포 기술로 이러한 위치에 도달하는 어려움과 공중 보건 벡터 제어 기관이 이 종에 대한 효과적인 통합 벡터 관리(IVM)에 중요한 집중 감시 및 제어 활동을 수행하기 위해 사유 재산에 반복적으로 접근하는 것에 대한 대중의 잠재적 수용 부족이 포함됩니다.

다행스럽게도 SIT는 다른 매우 까다로운^{곤충 종6}의 지속적인 통제에 성공한 것으로 입증된 접근 방식으로, 플로리다 주 세인트 어거스틴에 기반을 둔 획기적인 일련의 실험 및 운영 시험에서 Aedes aegypti 문제에 적용되고 있습니다(KJL, RLA, SCB 미공개 데이터). SIT는 모기를 포함한 다양한 곤충 종에 적용되었으며 심층 ^7,8에서 검토되었습니다. SIT는 예를 들어 전리 방사선이나 화학 물질에 노출되어 살균 된 식민지 사육 수컷의 대량 방출을 활용하여 암컷의 자연 개체군의 짝 선택을 압도합니다. 야생 암컷과 짝짓기하는 살균 된 수컷은 수컷 배우자가 입은 손상으로 인해 알을 불임으로 만들고, 충분한 수로 존재하면 이론적으로 자연 Aedes aegypti 개체군을 추락시킬 수 있습니다.

SIT 프로그램은 이 종이 최근에 다시 식민지화되어 Zika, 뎅기열 또는 치쿤구냐와 같은 바이러스 전파에 대한 공중 보건 위험을 확장하고 제시하고 있는 플로리다 대서양 연안의 도시 지역에서 Aedes aegypti 의 개체수를 줄이기 위해 시작되었습니다. 야생 암컷과의 호환성 가능성을 극대화하기 위해 대상 개체군에서 야생에서 잡은 Aedes aegypti 를 사용하여 프로그램⁹를 위한 수컷을 생산하는 새로운 식민지가 설립되었습니다. 이것은 현지에서 파생되고 식민지에서 자란 수컷이 지역 야생 암컷과 짝짓기하기 위해 지역 야생 수컷과 경쟁 할 가능성이 더 높다는 가설에 근거했습니다. SIT가 효과적이기 위해서는 압도적 인 수의 무균 수컷이 대상 지역에 있어야할뿐만 아니라 지역 야생 암컷 모기와 효과적으로 구애하고 짝짓기 할 수 있어야합니다.

방출 할 최적의 무균 수컷 수 (KJL, RLA, SCB 미공개 데이터)와 야생 암컷의 생존, 행동 또는 수용을 방해하지 않으면 서 수컷을 불임으로 만드는 최적의 방사선 량 (KJL, RLA, SCB 미공개 데이터). 이러한 데이터는 이 그룹의 연합 간행물에 포함될 예정이지만 이러한 결과 중 일부는 이 프로토콜에서도 캡처되어 다른 곳에서 새로운 SIT Aedes aegypti 제어 프로그램의 출발점으로 사용될 수 있습니다. 이 종은 지속적으로 범위를 확장하고 있으며 SIT 프로그램은이 개체군을 통제하기위한 비용 효율적이고 장기적인 솔루션이 될 큰 가능성을 보여줍니다. 이 프로토콜의 목적은 운영 공중 보건 벡터 제어 프로그램에서 지역 Aedes aegypti 개체군의 자연 생식 주기를 방해하기 위해 야외 지역으로 체계적으로 방출하기 위해 살균된 수컷 식민지 사육 Aedes aegypti 모기를 생산하는 것입니다.

형질 전환 Aedes aegypti 수컷의 생산을 위해 유사한 프로토콜과 워크 플로우가 발표되었고 Aedes SIT 또는 Wolbachia 기반 비 호환성 프로그램에 대한 생산 워크 플로우가 다른 곳에서 출판되었지만,이 프로토콜은 기존 프로토콜이 Aedes aegypti 생산, 수컷 번데기의 분리 및 조사, 성인 남성의 표시 및 포장,이 프로그램의 방출 장소로의 선적에 어떻게 적용되었는지 보여줍니다^9, 10,11,12,13,14,15,16,17,18. 이 프로토콜의 마킹 구성 요소는 성숙한 운영 SIT 프로그램에서 필요하지 않을 수 있습니다. 그러나 SIT 프로그램 구축 초기에 효능을 모니터링하고 전체 프로세스의 품질을 제어하는 한 가지 방법이기 때문에 여기에 포함되었습니다. 모기 방제 프로그램은 일반적으로 지방 당국에서 운영하므로 규모 및 자금 기반에서 지역 성공을 극대화하기 위한 통제 전술 조정에 이르기까지 조직의 여러 측면에서 크게 다를 수 있습니다. 따라서, 본 명세서에 기술된 프로토콜은 이용가능한 자원들과의 호환성에 대해 평가되어야 한다.

프로토콜

알림: 이 프로토콜은 Aedes aegypti 의 취급에만 해당되지만 다른 모기 종에 효과적이도록 수정될 수 있습니다.

1. Aedes aegypti 식민지의 생산 및 유지 관리

1. 성인 Aedes aegypti를 키우고 알을 낳습니다.
   1. 0.6m x 0.6m x 0.6m 접을 수 있는 알루미늄 프레임, 20 x 20 유리 섬유 메쉬 스크리닝이 있는 대형 사육 케이지 및 하나의 수직 벽에 리치인 스토키네트 슬리브를 준비합니다.
   2. 각 사육 케이지에 Aedes aegypti 번데기(1:1 성비)가 담긴 1900mL 플라스틱 욕조를 놓고 소매를 묶고 더 이상 성인이 나오지 않을 때까지(즉, 약 4일) 컵을 제자리에 두십시오. 이때 컵을 제거하고 성체 사육 케이지를 28-30°C, >50% 상대습도(Rh), 12:12 또는 14:10 명암(L:D) 주기로 유지합니다.
      참고 : Aedes aegypti 번데기의 생산은 섹션 1.2에 설명되어 있습니다. 1900mL 욕조의 번데기 밀도는 모든 번데기가 동시에 공기를 위해 올라올 수 있는 충분한 공간이 있어야 합니다.
   3. 번데기를 사육 케이지에 넣은 지 24 시간 후, 스폰지 심지가있는 10 % 자당 용액 용기를 놓고 각 케이지의 와이어 후크에서 꿀에 담근 10cm x 2cm 스폰지를 매달아 성인 모기에게 별도의 수분 공급원과 영양을 제공합니다. 스폰지와 자당 용기의 건조 또는 곰팡이 성장을 모니터링하고 필요에 따라 보충하거나 교체하십시오.
      알림: 작은 사육 케이지의 뚜껑에 있는 컷아웃을 통해 10cm x 2cm 스폰지 심지가 장착된 120mL 플라스틱 컵과 큰 케이지에 12cm x 8cm 스폰지 심지가 있는 460mL 플라스틱 컵을 사용하십시오.
   4. 대부분의 성인이 출현 한 후 48-72 시간 후에 각 사육 케이지에 혈액 식사를 제공하고 그 후 2-3 일마다 많은 수의 혈액 공급 암컷을 유지하여 알 수확량을 최대화합니다. 양가죽 콘돔에 50-100mL의 소의 혈액을 채우고 뜨거운 물 욕조에서 약 37 ° C로 따뜻하게합니다. 그런 다음 천이나 종이 타월을 사용하여 콘돔을 두드리고 부분적으로 말린 다음 케이지 내부의 종이로 덮인 페트리 접시에 30-60 분 동안 놓습니다.
      알림: 사용하기 전에 각 콘돔의 내부와 외부를 물로 2-3 번 헹구어 윤활유 또는 기타 기질을 제거하고 구멍이 있는지 확인하십시오. 콘돔은 혈액을 헹구고 시원한 물 한 컵에 보관하여 3-5 회 급식으로 재사용 할 수 있습니다. 일부 식민지에서는 개미 감염이 발생할 수 있으므로 접근을 제한하기 위해 콘돔을 일시 중지해야 할 수도 있습니다.
   5. 각 혈액 공급 후 48-72 시간을 기다린 다음 각 성인 양육 케이지에 산란 컵을 도입하십시오. 여과된 번데기 물(즉, 물 유충과 번데기가 사육됨) 200mL를 컵의 내부 둘레를 따라 같은 높이로 장착된 높이 8-10cm x 너비 30cm 너비의 종자 발아지(산란 종이)가 있는 플라스틱 460mL 컵에 추가하여 산란 컵을 준비합니다. 산란 종이를 매일 확인하고 2-4일마다 교체하고 난자가 든 산란 종이를 >50% Rh¹⁹에서 24-48시간 동안 건조시켜 조심스럽게 보관하십시오.
      알림: 알이 부화하지 않도록 산란 컵을 사육 케이지에 72 시간 이상 두지 마십시오.
   6. 성인 양육 케이지를 분해하고 새로운 성인 양육 케이지를 설치하기 전에 최대 3-4 주 동안 유지하십시오.
      1. 사육 케이지를 분해하려면 산란 컵을 제거하고 청소하고, 계란이 담긴 산란 종이를 보관하고, 자당 용액 용기와 꿀 스폰지를 제거 및 청소하고, 케이지를 동결하여 모든 모기를 죽입니다.
      2. 모든 모기 시체를 제거하고 종이 타월과 스폰지로 수세미를 사용하여 희석 된 비누와 물로 각 케이지의 내부와 외부를 철저히 청소하십시오. 다음 사육주기에 사용하기 전에 깨끗한 케이지를 최소 24 시간 동안 건조시킵니다.
         알림: 고효율 여과 기능이 장착된 진공 장비를 사용하여 알레르기를 유발할 수 있는 미립자를 제거하십시오. 자당 용액 용기는 3-5 번 세척하고 재사용 할 수 있습니다.
2. 알에서 Aedes aegypti 유충 사육
   1. 2200mL 수돗물에 소 간 분말:맥주 효모의 3:2 비율 80g을 혼합하여 유충 영양 슬러리를 준비합니다. 분쇄 된 생선 음식을 준비하십시오. 생선 조각을 향신료 분쇄기에 붓고 미세한 가루가 될 때까지 갈아줍니다.
      알림: 이 슬러리는 이 실험실에서 갈색 으로 지정됩니다.
   2. 1.1.5단계의 계란이 함유된(5,000-10,000개의 계란) 산란 종이를 사용하여 산란선에 수직인 계란 종이의 3-7cm 부분을 자르고 분쇄된 생선 음식 플레이크의 꼬집집과 함께 수돗물이 반쯤 채워진 460mL 용기에 넣습니다. 뚜껑을 덮고 최소 1분 동안 격렬하게 저어줍니다.
      알림: 계란 종이는 배아를 허용하기 위해 부화 과정을 시작하기 전에 산란 후 최소 7일(그러나 부화를 줄일 수 있는 90일 이하) 동안 보관해야 합니다. 생선 음식에 존재하는 박테리아와 조류는 물을 빠르게 탈산소화하여 유충 발달을 유발합니다.
   3. 1.2.2 단계에서 용기의 전체 내용물을 3L의 수돗물과 50mL의 갈색 슬러리로 준비된 유충 사육 팬에 붓습니다. 팬에 시작 날짜, 변형 정보, 표 1에 따른 공급 일정을 표시하고 28-30°C, >50% Rh 및 12:12 또는 14:10 L:D에서 보관하십시오. 주기.
      알림: 3L의 물과 50mL의 갈색 비율은 재료 표에 언급된 특정 유충 팬의 물 깊이를 기준으로 합니다. 다른 크기의 팬은 다른 번데기 밀도를 지원하므로 다른 양의 물과 갈색 슬러리가 필요합니다. 표 1 의 유충 먹이 속도는 범위로 주어진다; 사용 된 양의 선택은 물의 탁도, 색 및 냄새와 같은 변수를 사용하여 발달중인 유충의 전반적인 건강 상태에 대한 경험과 결정을 기반으로합니다. 물 위에 박테리아 필름의 존재; 살아있는 유충과 죽은 유충의 수 또는 비율; 그리고 애벌레의 운동성. 3 내지 6일째에, 표 1에 따라 미성숙 모기를 분쇄한 어류 사료를 사료로 사료하였다. 물을 추가하고, 음식을 줄이고, 프로젝트에 필요한 것보다 2-3 개의 추가 팬을 설치하는 것은 건강에 해로운 애벌레 팬을 관리하는 방법입니다.

하루	부피 영양 슬러리 추가	볼륨 물 추가	작업
1	50 mL (슬러리)	3000 밀리리터
2	(음식 불포함)	(물 없음)
3	1/4 - 1/2 티스푼 (분쇄 생선 요리)	500-1000 mL
4	1/2 - 3/4 티스푼 (분쇄 된 생선 요리)	500-1000 mL
5	1/2 - 3/4 티스푼 (분쇄 된 생선 요리)	500-1000 mL
6	1/4 - 1/2 티스푼 (분쇄 생선 요리)	500-1000 mL
7	(음식 불포함)	(물 없음)	스트레인 번데기 및 애벌레

표 1 : Aedes aegypti 유충의 대량 사육을위한 먹이 일정.

2. 수컷 Aedes aegypti 번데기의 분리

1. 애벌레 팬에서 번데기를 집중시킵니다. 번데기의 대략적인 임계 비율에 도달하면 각 팬의 내용물을 체 (크기 20-40)에 붓습니다. 수돗물을 짜서 번데기와 유충을 체에서 씻어 내고 3000mL 눈금이 매겨진 플라스틱 비커로 씻습니다.
   알림: 번데기가 표면에 편안하게 닿을 수 있도록 과밀을 피하기 위해 각 3000mL 비커에 2-3개의 유충 팬만 옮겨야 합니다. 번데기는 1.2.3단계에서 언급한 온도와 빛 조건에서 알이 부화한 후 130-140시간 사이에 발달할 것으로 예상됩니다. 알이 설정된 당일에 눈에 띄는 알 부화를 기대하십시오. 환경 조건에 따라 유충의 약 20-70 %가 번데기를 거쳐 6 일 이내에 체질 될 준비가됩니다. 번데기를 여러 개의 3000mL 비커에 분할하면 분리기에 쏟아질 수 있는 부피가 보장됩니다.
2. 유충과 암컷 번데기에서 수컷 번데기를 분리하십시오.
   알림: 이 단계는 한 명의 운영자 또는 두 명의 운영자가 수행할 수 있습니다.
   1. 수컷 번데기를 분리하는 단일 연산자의 경우:
      1. 2.1단계에서 생성된 각 3000mL 비커의 내용물을 여러 개의 1900mL 플라스틱 용기에 나누어 엎지르거나 분리기에 과부하가 걸리는 것을 줄입니다. 분리기 바닥의 수문 아래에 딱딱하고 얕은 4000mL 수집 용기를 놓아 플레이트 분리기를 준비합니다(그림 1). 3000mL 눈금이 매겨진 플라스틱 비커 2개를 수돗물로 약 3/4 정도 채웁니다.
         알림: 3000mL 플라스틱 눈금이 새겨진 비커 대신 싱크 호스를 사용하십시오. 그렇지 않으면 분리 과정 전반에 걸쳐 비커를 지속적으로 리필해야 합니다. 번데기 분리기를 작동시키기 위한 추가적인 세부사항은 참고문헌^12,20에서 찾을 수 있다.
      2. 유리판 사이의 공간을 통해 물을 붓고 상단 및 하단 손잡이를 시계 방향 또는 시계 반대 방향으로 조정하여 물이 지속적으로 흐르도록 하는 동시에 플레이트 바닥에서 약 1.25cm 높이까지 고인 물을 생성합니다. 하단 손잡이의 시작 위치를 테이프로 표시하십시오. 고인 물이 동일한 높이와 배수 속도로 유리판 바닥에 고르게 분포되면 번데기와 유충 용기의 내용물을 판 사이의 공간을 통해 붓기 시작합니다.
         알림: 작은 (수컷) 번데기와 큰 (암컷) 번데기 사이에 명확한 분리가 있어야합니다. 그렇지 않으면 이 배치를 플러시하고 상단 손잡이를 조정하여 플레이트 사이의 공간을 줄입니다.
      3. 분리기를 통해 물을 천천히 붓는 동안 대부분 또는 모든 유충이 씻겨 내려가 수문을 수집 용기로 미끄러질 때까지 테이프 표시 시작 위치에서 시계 반대 방향으로 ~ 1-2cm 씩 하단 손잡이를 쌍으로 계속 돌립니다.
         알림: 한 손으로 물을 붓는 동안 다른 손은 손잡이를 한 번에 하나씩 균등하게 조금씩 돌려 플레이트를 천천히 엽니다. 대부분의 유충은 빨리 씻겨 나가지만 수컷 번데기에 잡힌 유충이있을 것입니다. 이 낙오자 유충은 방사선 조사를 받지만 발달이 지연되고 번데기의 초점 코호트를 가진 성인과 가깝지 않습니다.
      4. 유충을 버리거나 식민지로 다시 재활용하되, 두 경우 모두 수컷 번데기가 분리기를 통해 세척을 시작하기 전에 수집 용기에서 제거하십시오. 수문 바닥에있는 수집 용기가 # 30 체를 통해 쏟아져 유충을 제거하는 동안 물의 흐름을 중단하여 공정을 일시 중지하고 별도의 용기로 역세척합니다.
         참고 : 유충이 먼저 흐르고 수컷 번데기, 마지막으로 암컷이 흐릅니다 (그림 1).
      5. 계속해서 물을 붓고 수컷 유충이 씻겨 져서 수집 용기로 분리 될 때까지 바닥 손잡이를 돌립니다. 다음 단계에서 수컷 번데기를 옮기기 전에 수집 용기에서 유충을 확인하고 제거하는 과정을 일시 중지하십시오.
         알림: 수컷을 분리하는 데 필요한 플러시 횟수는 물 붓기의 템포와 손잡이가 회전하는 속도에 따라 다릅니다. 일반적으로 유충을 씻어내는 데 2000-2500mL의 물, 수컷 번데기를 씻어내는 데 1000-1500mL, 암컷 번데기를 씻어내는 데 200-400mL가 필요합니다.
      6. 싱크대 위의 #20 체를 통해 수집 용기에서 수컷 번데기를 붓습니다. 1000mL 스퀴즈 병의 수돗물을 사용하여 별도의 1900mL 용기에 붓는 동안 체에서 수컷 번데기를 역세척합니다.
      7. 수컷 번데기가 모두 분리되면 분리기를 통해 물을 계속 붓고 아래쪽 손잡이를 조정하여 암컷 번데기를 통해 플러시합니다. 2.2.1.6 단계에서 설명한 체 공정을 사용하여 암컷을 모든 미성숙 모기가 분리기에서 플러시 될 때까지 별도의 용기에 옮깁니다. 암컷 번데기를 버리십시오. 배치가 처리되면 노브를 원래 시작 위치로 되돌리고 다음 배치로 프로세스를 반복합니다. 모든 배치가 처리되면 분리기가 건조될 수 있도록 플레이트를 열어 둡니다.
         알림: 이 장치를 사용하면 완벽하게 분리되지 않으므로 인내와 연습이 필요합니다. 완고한 번데기 또는 유충은 무거운 물의 흐름으로 제거 될 수 있지만 측면으로 밀어 넣어 향후 침수를 오염시킬 정도는 아닙니다.
   2. 수컷 번데기를 분리하는 두 연산자의 경우 섹션 2.2.1을 다음과 같이 수정합니다.
      1. 첫 번째 연산자: 분리기를 통해 물을 붓고 손잡이를 점진적으로 돌려 유충, 수컷 번데기 및 암컷 번데기를 분리합니다.
      2. 두 번째 연산자 : 각 단계가 수문 용기에 수집되면 수문 용기의 내용물을 체로 쳐서 유충, 수컷 번데기 및 암컷 번데기를 여러 개의 별도의 수문 수집 용기로 분할합니다. 싱크 호스를 사용할 수없는 경우 큰 비커에 물을 채우십시오.

그림 1: 미성숙 Aedes aegypti의 배치를 포함하는 번데기 분리기. 분리는 대상 세트, 즉 유충, 수컷 번데기 또는 암컷 번데기가 남아있는 세트에서 가능한 한 많이 격리 될 때까지 하단 손잡이를 시계 반대 방향으로 1-2cm 회전하면서 분리기를 통해 물을 붓는 것으로 시작됩니다 (왼쪽 이미지). 오른쪽 이미지는 유충 (가장 낮은 밴드), 수컷 번데기 (중간 밴드) 및 암컷 번데기 (상단 밴드)의 분리를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 방사선 조사를 위한 수컷 Aedes aegypti 번데기의 제조

1. 수컷 번데기를 플라스틱 60mm 페트리 접시로 나눕니다.
   참고: 필요한 페트리 접시의 수는 조사에 사용할 수 있는 수컷 번데기의 수에 따라 다릅니다: 1.2단계의 유충 사육 팬 하나가 약 1.5개의 페트리 접시를 채울 것입니다. 번데기 나이의 나이는 1 세에서 40 세 사이입니다. 이 프로토콜에서는 페트리 접시의 더 작은 직경의 더 깊은 절반을 바닥이라고하고 더 큰 직경의 얕은 절반을 상단이라고합니다.
   1. 페트리 접시 바닥의 내경에 맞게 미리 절단된 여과지 디스크를 준비합니다. 페트리 접시의 각 바닥에 물에 적신 여과지 디스크를 하나씩 놓아 운송 및 조사 과정 전반에 걸쳐 번데기에 수분을 공급합니다.
   2. 번데기를 페트리 접시에 옮깁니다. 단계 2.2.1.6에서 채취한 수컷 번데기를 체로 걸러내고 번데기를 가능한 한 적은 물로 1000mL 눈금이 매겨진 비커로 세척합니다. 각 여과지 디스크가 번데기의 단일 층으로 고르게 덮일 때까지 번데기를 페트리 접시에 조심스럽게 붓습니다(그림 2A - C). 붓기를 용이하게하기 위해 테이블 가장자리에 페트리 접시를 연속으로 배열하십시오.
      알림: 번데기를 긴장시키는 대안은 플라스틱 3mL 파스퇴르 피펫의 끝을 번데기를 수용할 수 있을 만큼 충분히 큰 직경으로 자르는 것입니다. 피펫을 사용하여 2.2.1.6단계에서 생산된 용기에서 번데기를 여과지 디스크로 직접 옮겨 각 페트리 접시에 밀집된 단일 번데기 층이 있도록 합니다. 이것은 작은 배치에만 실용적입니다.
   3. 변경되지 않은 3mL 파스퇴르 피펫을 사용하여 페트리 접시 바닥에서 고인 물을 제거하여 섹스 단계(3.2) 및 운송 중 번데기 움직임을 방지합니다.

그림 2: 조사를 위해 번데기를 페트리 접시로 옮기는 작업 . (A) 체로 쳐진 번데기를 붓고 1000mL 플라스틱 비커에 역세척합니다. (B) 페트리 접시에 쉽게 쏟아질 수 있도록 비커에 최소한의 물이 유지됩니다. (C) 번데기의 단일 층에 붓는 것을 용이하게하기 위해 표면의 가장자리를 따라 페트리 접시가 늘어서 있습니다. (D) 번데기를 담은 페트리 접시를 쌓아 조사 시설로 배달하기 위해 고정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 암컷과의 오염 여부를 확인하기 위해 번데기를 성교하십시오. 해부 범위에서 프로브를 사용하여 각 번데기를 회전시켜 복부 표면에 남성의 성별을 나타내는 큰 크기의 생식기 엽 (그림 3)이 있는지 확인합니다. 암컷을 나타내는 축소되거나 작은 생식기 엽이있는 번데기를 제거하고 버리고 올바른 수를 유지하기 위해 동일한 수의 수컷 번데기로 교체하십시오.
   참고 : 운영 프로그램에서이 단계는 많은 수의 모기와 방사선 조사 후 분리, 이동, 조사 및 케이지 준비가 모두 제한된 시간으로 하루 만에 완료된다는 사실 때문에 실용적이지 않습니다. 엄선된 페트리 접시의 샘플 품질 검사는 특히 SIT 프로그램 개발의 초기 단계에서 수행할 수 있습니다.

그림 3 : 생식기 엽을 사용한 번데기 섹스. (A) 복부 및 (B) 암컷 () 및 수컷 (♀ ♂) Aedes aegypti 번데기의 측면도, 생식기 엽은 성적 이형성을 나타내는 것으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 바닥을 페트리 접시의 상단으로 덮고 실험실 테이프로 고정합니다. 테이프로 붙인 페트리 접시를 조사 챔버에 맞는 크기의 스택에 탄성 밴드로 묶고 라벨이 붙은 3.8L 재밀봉 가능한 백 안에 밀봉합니다(그림 2D). 번데기가 >1 시간 동안 덮이지 않도록하십시오.

4. 수컷 Aedes aegypti 번데기의 방사선 조사

1. 1cm² 정사각형의 필름을 자르고 각 사각형을 개별 봉투에 넣어 동일한 로트에서 선량 측정 필름을 준비하십시오.
   알림: 매일 사용되는 모든 필름은 동시에 절단됩니다. 이것은 저장에 의해 유도되는 소량의 변동을 줄입니다. 각 스택에 필요한 사각형 수는 1 + (페트리 접시 수)입니다.
2. 실험실 타이머, 실험실 테이프, 영구 마커, 준비된 선량 측정 필름 봉투, 선량 측정 배지 및 주요 정보를 추적하기 위한 체크리스트가 포함된 실험실 노트 시트가 포함된 조사 시설에 가져갈 키트를 준비합니다(그림 4).

도 4: 용량 반응 세트에 대해 완성된 실험실 책 개요-IR 시트. 빨간색 윤곽선(빨간색 화살표로 표시)으로 표시된 텍스트 상자는 여러 섹션에 대한 유용한 메모를 나타내고 주요 정보를 반복합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 번데기를 조사 시설로 운반하십시오. 3.3 단계의 수컷 번데기의 페트리 접시를 단열 용기에 넣고 운송 중에 직사광선을 피하고 에어컨과 함께 보관하십시오.
4. 조사기에서 조사를 위해 페트리 접시 더미를 준비하십시오. 조사 챔버에 맞도록 적절한 수의 페트리 접시를 쌓고 각 접시 사이와 스택의 상단과 하단을 중앙에 배치하는 선량 측정 필름 엔벨로프를 사용합니다. 봉투와 전체 스택을 실험실 테이프로 고정하여 유출을 방지하고 챔버에 스택을 쉽게 배치할 수 있습니다.
5. 수컷 번데기의 페트리 접시를 조사하십시오. 페트리 접시의 스택을 챔버 내의 단단한 금속 메쉬 상에 배치하여 특정 조사 유닛(²¹)의 이전 선량-맵핑에 기초하여 최적의 노출 원뿔을 위한 정확한 높이에 위치시킨다. 조사기의 턴테이블을 활성화하고 조사하는 동시에 실험실 타이머를 시작합니다. 원하는 투여량을 달성하기 위해 적절한 간격으로 조사한다(실시예는 표 2에 나타내었다).
   알림: 이 프로토콜은 세슘-137 조사기( 재료 표 참조)와 50Gy의 목표 용량을 기반으로 합니다. Cs-137은 시간이 지남에 따라 붕괴되기 때문에 알라닌 선량계를 사용하여 선량 반응 시리즈를 수행하고 일상적인 선량 측정을위한 방사성 변색 필름과 조사 된 샘플의 약 10 %에서 알라닌을 보충하여 선량률을 매년 조정합니다. 8.8 Gy/min의 현재 선량률을 감안할 때, 50 Gy의 목표 선량을 달성하려면 5분, 41초의 노출이 필요합니다. 일상적인 필름 선량 측정은 단계 4.7에 설명된 바와 같이 발생합니다. 알라닌 펠릿 선량 측정은 텍사스 A & M 대학의 국립 전자빔 연구 센터 또는 미국 메릴랜드 주 게이 더스 버그에있는 국립 표준 기술 연구소에서 수행됩니다.

복용량 (Gy)	시간 (8.8 Gy / 분 기준)
0	해당 없음
10	1분 8초
30	3분 24초
50	5분 41초
65	7분 23초
85	9분 39초
100	11분 22초
110	12분 30초

표 2: 세슘-137 조사기의 투여 시간 예.

6. 규정 된 시간이 경과하면 조사기에서 페트리 접시를 제거하고 스택을 조심스럽게 분해하십시오. 모든 페트리 접시와 필름 봉투에 스택의 날짜와 위치를 표시하십시오. 봉투를 밀봉하고 용량 측정을 위해 보관하십시오. 페트리 접시를 절연 용기에 다시 포장하여 주 실험실로 다시 운반하십시오.
   알림: 조사 중에 성충이 나왔는지 여부를 기록하고 번데기를 사육 케이지에 넣을 때 성인이 탈출하지 않도록 영향을 받은 페트리 접시에 표시하십시오(5.2단계).
7. 노출 후 약 24시간 후에 필름을 측정하여 선량 측정 필름으로 조사량을 확인합니다. 선량 측정 판독기를 활성화하고 실온과 평형을 이루십시오. 리더와 함께 제공된 집게를 사용하여 필름을 로드하고 동일한 배치에서 조사된 필름과 조사되지 않은 빈 필름을 읽기 위한 제조업체의 지침을 따릅니다. 판독값 사이에 필름이 없는 리더기를 영점으로 만들고 그림 5에 표시된 예제 데이터 시트와 같이 데이터를 기록합니다.
   알림: 이 프로토콜은 ND0.5 및 ND1.0 QA 필터 세트 표준을 기반으로 합니다. 무광택면이 작업자를 향하도록 필름을 측정하는 것이 중요합니다.

그림 5: 예제 데이터로 채워진 선량 측정 데이터 시트. 열 머리글은 운영자에게 나중에 분석할 수 있도록 주요 데이터를 캡처하라는 메시지를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 조사된 수컷 Aedes aegypti 번데기를 성체로 사육

1. 30cm x 30cm x 30cm의 작은 플라스틱 사육 케이지를 청소하고 준비하여 주 실험실로 돌아올 때 번데기를 조사 할 준비가되도록하십시오. 조사 된 수컷 번데기의 페트리 접시 2 개마다 사육 케이지 1 개를 준비하십시오. 각 사육 케이지에 460mL의 수돗물과 10 % 자당 용액 용기가 들어있는 반쯤 채워진 플라스틱 컵을 1.1.3 단계에 설명 된대로 비축합니다.
2. 조사 시설에서 돌아온 후 조사 된 번데기를 준비된 사육장으로 즉시 옮깁니다. 물병을 짜서 각 페트리 접시의 번데기를 각 사육 케이지의 플라스틱 컵에 있는 460mL의 물로 조심스럽게 씻습니다. 24 시간 후, 컵을 영양 공급원이 들어있는 새롭고 깨끗한 사육 케이지로 옮기고 성인 수컷 조사 Aedes aegypti의 남은 폐쇄를 기다립니다.
   알림: 조사 과정에서 번데기가 나온 경우 전단지와 함께 페트리 접시를 빈 케이지에 연 다음 5.2단계를 계속합니다. 이 새장에서 수집 된 수컷은 버립니다. 번데기는 수컷이 같은 코호트의 암컷보다 먼저 출현하고 출현 일을 격리하면 암컷 오염 발생률을 줄이고 수컷의 정확한 노화를 보장 할 수 있기 때문에 24 시간 후에 새로운 사육 케이지로 옮겨집니다.

6. 조사 성인 Aedes aegypti 남성 표시 및 무게 측정

참고: 프로토콜의 이 섹션에서는 두 사람이 작업을 수행한다고 가정합니다. 1명에 대해서는 6.4를 참조한다.

그림 6: 표시가 있고 조사된 수컷 Aedes aegypti 를 방출 용기에 포장합니다. (A) 마스킹 테이프, 스테이플 및 뜨거운 접착제로 마분지 실린더 측면의 구멍에 고정 된 스토키 네트가 표시된 용기를 방출합니다. 베젤은 측면에 부착된 마스킹 테이프 레이블 뒷면과 함께 제자리에 있습니다. 베젤은 단단히 당겨진 얇은 명주 그물 메쉬 커버를 유지합니다. 탄성 밴드 (보이지 않음)도 베젤 아래의 얇은 명주 그물을 제자리에 고정하고 있습니다. (B) 작은 마분지 컵에 분홍색 염료로 쓰러지는 과정에서 마취된 수컷의 배치. (C) 절연 선적 컨테이너 내부의 4 개의 해제 컨테이너. 스토키네트 슬리브는 선적 컨테이너의 중앙을 향하고 포장재는 방출 용기 주위에 끼워져 있으며 영양 및 수화 공급원은 교차된 탄성 밴드와 테이프 조각으로 단단히 고정된 거꾸로 된 페트리 접시 바닥으로 덮인 각 방출 용기 위에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 마분지 방출 용기를 준비하십시오.
   1. 구멍이 뚜껑으로 덮이지 않도록 바닥에서 1.5-3.0cm에 뚜껑이 있는 원통형 3.9L 카드스톡 용기 측면에 직경 11.5cm의 구멍을 자릅니다(그림 6A).
   2. 40-50cm 길이의 스토키네트를 자르고 6.1.1에서 자른 11.5cm 구멍의 안쪽 주위에 한쪽 끝을 스테이플합니다. 스테이플이 컨테이너 내부에서 스토키네트와 마분지를 통해 경질 압출 폴리스티렌 폼 블록과 같은 적절한 작업 표면으로 강제로 들어갈 수 있도록 열린 표준 사무실 스테이플러를 사용하십시오. 일자 드라이버를 사용하여 스테이플을 압착하여 스토키네트를 구멍 둘레에 단단히 고정하고 압착된 면에 마스킹 테이프를 고정하여 걸림을 방지합니다. 실린더 내부의 스토키네트 가장자리를 뜨거운 접착제로 카드스톡에 밀봉하고 전체 어셈블리에 탈출구가 있는지 교차 확인합니다.
   3. 뚜껑에서 내부 디스크를 제거하여 고정 베젤을 만들고 성인 수컷 Aedes aegypti 모기를 보유 할 수있을만큼 미세한 33cm x 33cm 정사각형의 나일론 얇은 명주 그물을 자릅니다. 메쉬를 실린더의 열린 끝에 놓고 베젤을 메쉬 위에 끼워 틈 없이 제자리에 고정합니다. 메쉬가 베젤 아래로 돌출되도록 메쉬를 아래쪽으로 당겨 메쉬가 열린 끝을 가로질러 가르쳐지도록 하고 돌출된 메쉬를 고무 밴드로 실린더에 단단히 밀봉합니다.
   4. 베젤을 찢지 않고 라벨링 테이프를 쉽게 교체할 수 있도록 8cm 라벨링 테이프로 덮인 베젤 측면에 10cm 마스킹 테이프를 놓습니다.
      알림: 릴리스 컨테이너는 내구성이 뛰어나며 적절한 취급으로 >10x 재사용할 수 있습니다. 표시가 있고 조사된 성인용 수컷 모기의 새로운 배치를 도입하기 전에 스토키네트가 용기에 단단히 부착되어 있는지 확인하고 필요한 경우 즉시 수리하십시오.
2. 계량 및 마킹 스테이션을 준비합니다.
   1. 약 50mg의 마킹 염료를 240mL 마분지 용기에 붓고 염료를 분말 코팅으로 용기의 내부 표면 주위에 고르게 펴 바릅니다. 부드럽게 두드려 과도한 염료를 버립니다. 색상을 분리하기 위해 여러 염료에 명확하게 표시된 컵을 사용하십시오.
   2. 0.0001 g 전자 저울에 100-500 g 계량 보트를 포장하십시오. 데이터 양식을 만듭니다 (표 3). 215.9mm x 355.6mm 복사 용지 4장을 테이프로 붙여서 431.8mm x 711.2mm 작업대를 만듭니다.

릴리스 컨테이너	모기의 무게	케이지 번호	배치의 암컷	남성의 수	릴리스 컨테이너	총 질량
핑크 I	0.024	D1 #1		25	핑크 I	2.03
핑크 I	2.007	D1 #1	7		핑크 II	1.99
핑크 II	1.990	D1 #1			핑크 3	2.03
핑크 3	0.026	D1 #3		25
핑크 3	2.000	D1 #3	18

표 3: 계량 스테이션 데이터 테이블.

3. 형광 안료로 성인 조사 된 남성의 정량화 된 배치를 표시하십시오.
   1. 성인 모기 (2.5-3.5 일령)를 각 사육장에서 흡인기 바이알로 옮깁니다. 5.2 단계에서 사육 케이지에서 영양 공급원을 제거하고 케이지 전체를 큰 CO₂ 챔버에 5-7 분 동안 넣고 용기의 측면을 두드려 사육 케이지에 달라 붙을 수있는 모기를 제거합니다. 노출 시간이 경과 한 후 챔버에서 사육 케이지를 제거하고 모든 성인 모기를 일련의 플라스틱 흡인 바이알에 흡인합니다.
      참고 : 99.5-100 % CO₂ 의 투여는 6 L / min의 유속으로 챔버로 전달 된 조절기, 황동 미늘 및 실리콘 튜브가있는 탱크에서 이루어집니다. 사육 케이지를 청소하는 데 필요한 바이알의 수는 케이지에 있는 모기의 수와 작업자의 숙련도에 따라 다르지만 일반적으로 케이지당 3-5개의 바이알이 필요합니다. 성인 모기를 일괄 적으로 쉽게 관리 할 수 있도록 작은 퀵 체인지 바이알이있는 흡인기를 선택하십시오 (예 : 한쪽 끝에는 20 x 20 메쉬 알루미늄 스크린으로 밀봉 된 60mL 폴리스티렌 수집 바이알을 사용하고 다른 쪽 끝에는 투명 아세테이트 플랩 밸브를 사용하는 것). 모기에 대한 스트레스를 줄이고 프로토콜을 다루기 쉽게 유지하기 위해 모기를 바이알로 옮기는 시간을 줄이기 위해 흡인 전에 전체 케이지를 마취합니다.
   2. 각 사육장에서 모든 성인 모기를 성별로 분류하십시오.
      1. 6.3.1단계의 첫 번째 바이알을 작은 챔버에서_CO2 에 4분 동안 노출시킨 다음, 마취된 모기를 부드럽게 흔들어 6.2.2단계에서 준비한 백지 작업대에 퍼뜨립니다.
      2. 새로운 빈 바이알을 흡인기에 넣고 작업 표면에서 모든 수컷을 조심스럽게 흡인 한 다음이 바이알을 계량 스테이션으로 통과시킵니다 (단계 6.3.3.3). 남겨진 암컷을 집계하고 별도의 바이알에 흡인하여 짓밟힌 수컷과 함께 버립니다.
      3. 6.3.1의 나머지 바이알에 대해 이 과정을 반복하되, 성 분류 공정의 어느 시점에서 25명의 수컷만 있는 별도의 바이알을 생성하여 계량 스테이션으로 전달합니다. 6.3.2단계를 반복합니다. 각 사육장.
         알림: 성별, 무게 측정 및 마킹을 위해 조사된 성인 남성을 처리하는 동안 번데기 성별 분류 및 전체 프로세스의 문제 해결 및 품질 보증을 위한 핵심 데이터인 각 배치의 여성 수를 추적하십시오. 암컷 수가 예상보다 많으면 두 번째 사람이 암컷을 추출하고 주 운영자가 수컷을 흡인해야합니다. 모기 당 평균 체중을 계산하기 위해 각 사육장에서 25 마리의 수컷 샘플을 측정하는 것이 중요하며, 이는 프로토콜이 끝날 때 방출 된 표시된 조사 수컷의 수를 추정하는 데 사용됩니다.
   3. 성인 남성 모기의 무게를 측정하고 염색합니다.
      1. 계량 스테이션에서 섹스 스테이션 (섹션 6.3.2)의 성인 수컷 모기의 첫 번째 바이알을 작은 CO 2 챔버에 2 분 동안 넣고 모기를 6.2.2 단계에서 준비한 타르 계량 보트에 조심스럽게 흔 듭니다. 모기의 무게를 기록하고 모기를 6.2.1에서 준비한 염료 컵에 붓습니다.
      2. 컵을 시계 방향 및 시계 반대 방향으로 1바퀴 천천히 기울이고 회전시켜 모기가 컵 내부 표면의 분말 코팅에 접촉하고 모두 염료를 살짝 뿌립니다(그림 6B). 표시된 모기를 계량 보트에 붓습니다.
      3. 모기가 회복되어 도망 가지 않도록 다음 단계로 신속하게 진행하십시오. 섹션 6.3.2의 모든 바이알이 처리될 때까지 이 단계를 반복합니다.
         참고 : 섹션 25의 각 사육 케이지에 대해 생성 된 6.3.2 마리의 수컷으로 구성된 별도의 바이알에서 수컷의 무게가 기록되고 해당 케이지에서 수컷 당 평균 체중을 계산하는 데 사용됩니다.
   4. 방출 용기에 표시된 방사선 조사 성인 남성을 적재하십시오. 섹션 6.3.3의 끝에서 마취되고, 표시되고, 조사 된 수컷 모기가 들어있는 계량 보트를 약간 접습니다. 채널을 만든 다음이 채널을 stockinette 슬리브를 통해 지시하여 수컷을 방출 용기로 옮깁니다. 약 2.0g 또는 1500-3000 마리의 수컷 모기가 방출 용기에 들어갈 때까지 모기를 계속 추가하고 스토키네트 슬리브를 닫으십시오. 이형 용기의 베젤에 염료 색상, 용기 번호 및 모기의 총 중량으로 라벨링 테이프를 표시하고 이러한 데이터를 6.2.2단계의 양식에 복사합니다.
      알림: 모든 생애 단계에서 모기를 취급하면 스트레스를 유발하고 생존이나 활력을 감소시킬 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명 된 일련의 마취는 모기에 영향을 줄 수 있습니다. 그러나 각 단계에서 마취되지 않은 모기를 추적하고 흡인하려는 시도는 더 큰 스트레스와 지속 불가능한 프로토콜을 유발할 것입니다. 각 방출 용기 내의 모기의 총 중량을 섹션 6.3.3에서 생성된 수컷 모기당 평균 중량으로 나누어 해당 방출 용기 내의 수컷 수의 추정치를 도출하고; 각 방출 용기에는 2g 이하의 수컷이 있어야하며 이는 약 1 개의 대형 사육장에 해당합니다.
4. 단일 작업자를 위한 마킹 프로토콜 수정
   1. 먼저 모든 대형 케이지에 대해 성 분류를 수행하십시오. 각 큰 케이지를 4-5 분 동안 CO₂ 에 노출시키고 모든 모기를 4-5 개의 바이알에 흡인합니다. 각 바이알을 2-3 분 동안_CO2 에 노출시키고 모든 모기를 백지 작업 표면에 기울이고 암컷과 탈리를 제거하고 수컷을 큰 개체군 케이지로 되돌립니다.
   2. 계량 및 마킹
      1. 6.4.1 단계에서 생산 된 첫 번째 수컷 홀딩 케이지로 시작하십시오 : 영양 공급원을 제거하고 큰 CO₂ 챔버에서 수컷을 5-7 분 동안 마취시킵니다. 마취 된 수컷을 별도의 바이알에 골고루 흡인하십시오. 각 홀딩 케이지에 대해 생산된 순서대로 이 단계를 반복합니다.
         알림: 홀딩 케이지 당 약 2-3 개의 혼잡 한 바이알이 생산됩니다. 수컷 케이지를 생산 된 순서대로 처리하면 수컷의 각 케이지에 대한 회복 시간이 최대화됩니다.
      2. 6.4.2.1단계에서 생성된 제1 바이알을 마취한다. 작은_CO2 챔버에서 1-2 분 동안. 백지 작업 표면에 적은 수의 모기를 붓고 25 마리의 수컷 모기를 새 바이알에 흡인 한 다음 6.3.2와 같이 처리하여 해당 케이지의 수컷 당 평균 체중을 결정합니다. 추가 수컷을 소스 바이알로 되돌리거나 나중에 처리하기 위해 새로운 별도의 바이알로 흡인합니다. 칭량, 마킹을 진행하고, 단계 6.3의 나머지 부분에 기재된 바와 같이 제1 바이알 내의 나머지 수컷에 대한 방출 용기로 옮긴다. 6.4.2.2단계를 반복합니다. (25 마리의 수컷을 별도의 바이알에 분리하는 것을 제외하고) 6.4.2.1 단계에서 생산 된 나머지 바이알에 대해. 생산 된 순서대로 6.4.1에서 생산 된 다음 성 분류 양육 케이지로 이동합니다.
         알림: 한 사람과의 작업 흐름은 더 느리고 일부 수컷 모기는 여러 번 마취해야 합니다. 끊임없이 여성 모기를 검색하고 제거하십시오.

7. 포장 및 배송 방출 컨테이너 표시, 방사선 조사, 성인 남성 Aedes aegypti의

1. 선적을 위해 이형 컨테이너를 준비합니다. 이형 용기에 표시된 수컷이 채워지면 메쉬 뚜껑에 10% 자당 용액으로 적신 면봉 4개를 놓고 페트리 접시의 거꾸로 된 바닥으로 덮고 전체 용기 주위와 페트리 접시 위에 뻗어 있는 두 개의 고무 밴드로 제자리에 고정하여 십자가를 형성합니다. 두 개의 고무 밴드의 X 위에 마스킹 테이프를 놓아 거꾸로 된 페트리 접시 위에 고정합니다.
   알림: 10% 자당 용액이 묻은 면봉이 떨어지는 지점까지 포화되지 않도록 하여 용기를 손상시키고 모기를 가두어 죽일 수 있습니다.
2. 카드스톡 릴리스 컨테이너를 압출 폴리스티렌 폼 운송 냉각기에 포장하십시오. 쿨러 뚜껑에 통풍구 4개를 뚫고 면으로 막아 개미를 막고 탈출한 모기를 막습니다. 각 컨테이너의 스토키네트가 중앙을 향하도록 4개의 이형 컨테이너를 선적 냉각기에 똑바로 세웁니다(그림 6C). 각 용기 사이와 중앙에 버블 랩을 밀어 넣어 안정화시킵니다. 배송 냉각기의 나머지 공간을 에어 필로우로 채우거나 4 개의 이형 컨테이너로 구성된 두 번째 레이어를 첫 번째 레이어 바로 위에 쌓고 에어 필로우로 유사하게 안정화하십시오.
   알림: 방출 용기는 흔들 때 움직이지 않도록 충분히 안정화되어야 합니다. 패키지 내부의 온도는 주변 온도입니다.
3. 배송을 위해 배송 쿨러를 준비합니다. 통풍이 잘되는 뚜껑으로 배송 냉각기를 밀봉하고 판지 오버 팩에 넣고 테이프를 닫은 다음 야간 특급을 통해 릴리스 위치로 배송하십시오.

결과

경계하고 적절한 모기 사육은 식민지 케이지에서 수컷과 암컷의 균형 잡힌 가용성, 신선한 자당 용액과 꿀의 유지 관리, 일관된 고품질 혈액 공급으로 구성됩니다. 이러한 조건은 SIT 애벌레 사육 팬에 사용하기에 최적으로 조밀하게 포장 된 계란 시트를 제공합니다. 가장 오래된 것부터 최신까지 쉽게 사용할 수 있도록 체계적인 라벨링과 같이 말린 계란 시트의 적절한 보관 및 사용은 모든 팬에서 균일 한 부화를 지원합니다. 부화하기 전에 모든 유충 사육 팬에 물을 채우면 계란 시트가 해치 용기에 있는 시간이 줄어들고 건강한 발달을 촉진할 수 있습니다. 해치에서 번식까지 유충 팬을 유지 관리하려면 개발 단계 및 환경 변수에 따라 일부 팬이 더 많거나 적은 음식이나 추가 물이 필요할 수 있으므로 식민지 직원의 신중한 참여가 필요합니다. 번데기 성별 분리 예정일까지 발달 단계에 문제가있는 경우 조기 또는 나중에 부화, 음식 조정 또는 인큐베이터 온도 변경과 같은 프로세스 초기에 조정해야합니다.

이 프로토콜의 사육 과정은 제 시간에 부화 한 모든 알을 조사하여 통제 목적으로 사용할 수있는 번데기로 발전시키지 않습니다. 식민지에서 사육 된 모기의 20-50 %는 번데기를 분리해야 할 때까지 여전히 유충입니다. 그러나이 유충은 낭비되지 않고 24 시간 동안 성숙하여 전날 분리 된 암컷 번데기와 결합하여 식민지 케이지로 다시 재활용 할 수있는 추가 번데기를 만듭니다. 식민지 케이지에서 번데기는 성인으로 성숙하고, 짝짓기하고, 혈액을 공급하고, SIT 프로젝트를 유지하는 알을 생산할 수 있습니다.

번데기를 분리하고, 번데기를 페트리 접시에 붓고, 방사선 조사를 하고, 조사 후 성인 케이지에 배치하는 것은 하루 안에 이루어져야 합니다. 따라서 모든 단계를 편안하게 처리 할 수 있도록 적절한 시간을 할당해야합니다. 이형 용기의 조립 및 준비는 마킹 공정 전에 이루어져야합니다. 출하 현장에서 배송 상자를 반품할 때 이형 컨테이너를 검사하고 다음 사용을 위해 준비해야 합니다. 사용하지 않는 동안 젖은 면봉을 버리고, 습식 이형 용기를 환기시키고, 페트리 접시를 청소하고, 메쉬를 교체하고, 용기에서 탄성 밴드를 제거하면 이형 용기의 수명이 크게 연장됩니다.

COVID-19 바이러스 전염병의 전 세계적인 현실을 감안할 때 일반적으로 여러 사람이 작동하는 이 프로토콜은 각 단계에 대해 실험실에서 혼자 작업하는 한 사람이 다룰 수 있도록 수정되었습니다. 1인 시나리오에 의해 가장 방해받는 프로세스의 단계는 성별, 마킹, 계량 및 식민지 사육 유지 관리 단계입니다. 번데기를 한 사람별로 성별로 분리하는 것은 다른 방에서 동시에 작동하는 여러 분리기가있는 경우 충분해야합니다. 직장에서 사회적 거리두기가 발생하는 전염병 상황에서 섹스에서 포장까지의 단계를 완료하려면 여러 스테이션을 장비해야 합니다. 작업자의 속도에 따라 한 사람이 15,000 마리의 모기를 성교하는 데 ~ 4 시간이 걸리고 표시, 무게 측정 및 포장하는 데 1-2 시간이 걸립니다. 2인 시나리오는 마킹을 위해 모기를 마취하는 시간을 줄이고 전체 작업 시간을 줄입니다. 그러나 2 인 시나리오에서도 모기가 진정되는 동안 제한된 작업 시간으로 인해 방출 케이지 당 전체 2.0g의 모기를 할당하는 것이 어려울 수 있습니다. 유충 및 성충 사육 재료를 청소하고 준비하는 과정은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적이지만 팬데믹 기간 동안 개별 작업자가 독립적이고 안전하게 작업할 수 있도록 분할할 수 있습니다.

성인, 표시, 방사선 조사 된 Aedes aegypti 수컷을 방출하는 것은이 프로토콜의 범위를 벗어나지 만 여기에 간략하게 제시됩니다. 표시된, 조사된, 수컷 모기를 방출하는 과정은 표 3에 보고된 바와 같이, 무게(따라서, 추론된 멸균 수컷의 수)에 기초하여 방출 용기의 균일한 방출 분포를 결정하는 것으로 시작한다. 선적이 벡터 제어 구역으로 배달된 후 상자가 열리고 방출 컨테이너의 사망률 또는 상태에 문제가 있는지 평가됩니다. 방출 용기의 모기는 처리 영역으로 운송하기 전에 1-2 시간 동안 주변 온도 및 습도에 적응하도록 허용됩니다. 치료 지역의 방출 부위는 Aedes aegypti의 야생 개체군의 핫스팟에 대한 집중 감시 후 확인됩니다. 방출의시기, 빈도 및 밀도는 종의 생물 경제학뿐만 아니라 기상학, 공공 지원 및 실험실 사육 능력에 의해 균형을 이룹니다.

특정 이형 용기가 특정 이형 부위와 일치하기 때문에 이형 용기를 열기 전에 상단의 메쉬를 절단하여 라벨을 교차 확인하여 작업자가 메쉬를 변형시켜 수컷의 일부가 탈출 할 수 있도록해야합니다. 이 분수 방출 방법은 자유롭게 날아 다니는 모든 수컷이 풀릴 때까지 컨테이너에 할당 된 각 방출 지점에서 반복됩니다. 그런 다음 모든 컨테이너가 처리될 때까지 할당된 각 릴리스 위치의 각 릴리스 컨테이너에 대해 이 프로세스가 반복됩니다. 선택적으로, 모기가 방출 된 후, 자유롭게 떠나지 않은 죽은 또는 장애가있는 모기는 페트리 접시에 수집되고 손으로 계산되도록 라벨링하거나 방출 된 예상 수를 수정하기 위해 무게를 측정 할 수 있습니다. SIT 작업의 효능을 평가하기 위해 대상 지역 및 아마도 비개입 통제 부위에서 야생 Aedes aegypti 의 성체, 알 및 미성숙 단계에 대한 지속적이고 광범위한 감시가 수행됩니다.

토론

방사선을 사용하는 SIT를 특징으로하는 제어 프로그램을 시작하려면 Aedes aegypti의 지역 균주를 확립해야합니다. 이 단계는 매우 중요하며 SIT가 유사한 제어 기술과 진정으로 차별화 될 수 있습니다. 지역 모기 균주에서 프로젝트를 개발함으로써 생성 된 수컷은 환경 변화와 신호에 적응하고 주변의 야생 암컷을 찾아 짝짓기 할 수있는 행동을 할 것입니다. 더욱이, 조사 된 지역 수컷의 방출은 예를 들어 지역 모기 집단에 새로운 대립 유전자를 도입 할 수있는 유전자 변형 모기의 비 국소 균주의 방출과 비교하여 부정적인 여론을 생성하지 않을 수 있습니다.

방대한 양의 모기를 기르기 위해 상당한 자원을 소비하여 그 중 절반 정도를 통제 목적으로 사용할 수 있도록하는 것은 Aedes aegypti SIT 프로그램의 한계입니다. 번데기가 준비 될 때 유충의 성숙을보다 정의 된 기간으로 압축하기 위해 사육 프로토콜을 개선해야합니다. 이렇게 하면 최적의 분리 시간에 더 많은 번데기를 수집할 수 있습니다. 그러나 처리할 번데기를 추가하면 번데기를 수집할 때 더 많은 암컷이 번데기를 할 위험이 증가하므로 암컷이 수컷과 함께 페트리 접시에 들어가 풀려날 가능성이 높아집니다. 조사된 암컷 Aedes aegypti 번데기의 수명, 혈액 공급 행동 및 산란 행동은 성인에서 감소하지만 조사된 수컷과 함께 암컷을 부수적으로 방출하는 것은 좋은 전략이 아닙니다²². 따라서 실수로 분리, 조사, 표시 및 남성과 함께 방출되는 여성의 수를 최소화하는 것이 우선 순위로 남아 있어야합니다.

SIT 프로그램의 성공은 궁극적으로 식민지에서 자란 방사선 조사 된 수컷의 성공적인 배우자 경쟁에 달려 있습니다. 남성 경쟁력을 유지하려면 철저한 실험적으로 유도 된 복용량 선택과 개체군에서 무균 : 야생 남성의 추정 비율을 최대화해야합니다. 용량 선택은 수명, 생식력, 번식력 및 번데기 사망률을 포함하는 몇 가지 주요 요인에 의해 결정됩니다. 수컷 모기는 방사선이 증가함에 따라 0에 접근하는 점근적 생식 곡선을 나타내는 것으로 관찰되었습니다(KJL, RLA, SCB 미공개 데이터). 동시에, 수컷 모기의 수명과 활동 수준은 방사선 량이 증가함에 따라 기하 급수적으로 감소합니다 (KJL, RLA, SCB 미공개 데이터). 따라서 남성에서 99.9 %의 불임을 산출하는 용량을 확인하는 것보다 생존을 지원하면서 낮은 불임 비율에 초점을 맞추는 것이 좋습니다. 방사선 조사된 수컷의 수명이나 번데기 사망률을 조사하지 않은 수컷의 수명이나 번데기 사망률을 구별하지 않는 용량 범위가 확인되면 수컷을 압도적으로 무균 상태이지만 경쟁력 있게 만드는 선량을 식별하기 위해 생식력에 대한 추가 평가를 수행해야 합니다.

동시에, 인구의 수컷 모기 수를 방출 된 수컷의 수와 비교하는 것이 중요합니다. 이는 SIT 프로그램의 개시 전, 도중 및 후에 동일한 위치로부터 반복적으로 표적 방출 영역 내부 및 주변의 다양한 위치로부터 수컷을 수집함으로써 달성 될 수있다. 야생 수컷 모기와 방출 모기의 비율을 평가하기 위해 표시, 방출, 재 포획 연구를 수행해야합니다. 표시, 방출, 재 포획 연구는 특정 지점에서 알려진 수의 표시된 모기를 방출하고 나중에 초기 방출 지점을 둘러싼 근접한 지점에서 다시 포획하는 것에 의존합니다. 방출 지점으로부터 멀리 떨어진 곳에서 포획 된 수컷과 야생 수컷의 수를 비교함으로써, 그 지역의 수컷의 일반적인 야생 개체군을 추정 할 수 있으므로 불임 수컷의 경쟁 비율이 방출 될 수 있습니다²³. 무균 : 야생 수컷의 비율을 최대화하는 것은 더 많은 무균 수컷을 방출하거나 소스 감소, 미성숙 통제 또는 성인 살해 처리와 같은 고전적인 통제 수단으로 야생 개체수를 줄임으로써 달성 할 수 있습니다.

무균 남성 방출의 효과를 측정하기 위해 성인 컬렉션을 비 개입 영역과 연대순으로 비교할 수 있습니다. 불임 수컷이 풀려나고 한 지역에서 수집 된 수컷과 암컷의 수가 비교 가능한 비 개입 지역에 비해 감소함에 따라, 방출 된 불임 수컷이 지역 비옥 한 수컷을 성공적으로 능가했기 때문이라고 가정 할 수 있습니다. 이 효과는 개입 부위와 비 개입 부위 모두에 배치 된 산란 트랩 컵에서도 관찰 될 수 있습니다. 알은 여전히 개입 부위에서 생산될 수 있지만 비개입 부위의 알보다 부화 횟수가 적으면 암컷이 불임 수컷과 교미하기 때문에 수정되지 않는다는 가설을 세울 수 있습니다. 수정되지 않은 난자의 점점 더 많은 산란은 결국 개입 부위 ^8,24에서 암컷의 비대체로 인한 산란 감소로 이어질 수 있습니다.

SIT 기술 및 프로그램의 미래 방향은 자연스럽게 의학적으로 중요한 모기 종으로 확장됩니다. 예를 들어,이 기술은 Aedes aegypti와 Aedes albopictus의 매우 유사한 생물 경제학을 고려할 때 Aedes albopictus를 제어하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 관심있는 다른 질병 벡터 모기 종은 Culex quinquefasciatus, Culex tarsalis 및 다양한 Anopheles 종을 포함한다. 이 기술의 효능을 향상시키는 것은 유전자 조작이나 인공 선택을 통해 달성 할 수있는 주어진 시간에 생산 된 수컷 번데기의 용량을 늘리고 정력, 생식력 또는 수명을 증가시킴으로써 달성 할 수있는 수컷 경쟁력을 향상시키는 데 달려 있습니다.

궁극적으로 SIT 프로그램은 모기를 통제하기위한 은색 총알이 아닙니다. 대신 IVM 프로그램과 같은 다른 제어 기술 모음의 도구로, 기술 간의 약점을 교차 보완합니다. 예를 들어, 화학적 통제는 신속하고 저렴한 통제를 제공하는 반면, 내성 및 비 표적 사망률의 발달을 촉진합니다. SIT는 종 특이적이며 내성을 생성할 가능성이 없는 반면, SIT 수컷은 벡터 통제 구역 외부에서 이주하는 개체군을 통제하기 위해 영구적으로 생산되고 방출되어야 합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-1/8" wrench (1" (1 inch) = 2.54 cm)	Craftsman	CMMT44707
1/2 pint cardstock cup (1/2 pint = 236.5 mL)	Science Supplies WLE corp	1/2 pint
1/4" tubing - tygon	Hudson Extrusions	LLDPE1/8 X 1/4 BLK	to attach to CO2 gas regulator
1/8" brass barb w/ MIP connection	B&K	BHB-85NLB	to attach to CO2 gas regulator
1000 mL graduated plastic beakers with handle	Thermo Scientific	1223-1000
3000 mL graduated plastic beakers with handle	Thermo Scientific	1223-3000
Adult large cage	Bioquip	1450D
Aspirator vials	Bioquip	2809V
Bovine liver powder	MP Biomedicals	290039601
Brewers yeast	MP Biomericals	02903312-CF
CO2 regulator	Randor	64003038
CO2 tank (20# canister)	Praxair	CDBEVCARB20
Collection basin	Treasure Gurus	KI-ENAMELBOWL	for separator
Cotton balls - large	Fisher Scientific	22-456-883
Deli cups w/lids - 470 mL	Pactiv DELItainer	PCTYSD2516
Deli cups w/lids - 1900 mL	Berry Global	T60764
DoseReader 4			ND0.5 and ND1.0 QA Filter Set standards
Dosimetry film	Far West Technology, Inc.
Filter paper	Millipore	AP10045S0
Flashlight aspirator	Bioquip	2809D
Forceps - fine featherweight	Bioquip	4748 or 4750	featherweight
GAFchromic			radiochromic film
Gammator M	Radiation Machinery Corporation, Parsippany, NJ		Cesium-137 irradiator
Hand held mechanical aspirator	Clarke Mosquito	13500
Lambskin condoms	Trojan	Naturalamb
Large CO2 chamber	Sterilite	Walmart # 568789514
Larval rearing pans	Blue Ridge Thermoforming	01-FG-400-3N-ABS	Dimensions: 22.375 x 17.5 x 3 (inches)
Magnets - 20# pull	Master magnetics	MHHH20BX
Marking dye	Dayglo	ECO-11	Aurora Pink
Marking dye	Dayglo	ECO-17	Saturn Yellow
Mesh	Falk		T301
Pasture pipettes	Thermo Scientific	02-708-006
Petri dishes - large	VWR International	25384-090 CS
Petri dishes - small (60 mm x 15 mm)	Fisher Brand	FB0875713A
Pupa separator	J.W. Hock	1512
Red rubber hose	Welch	331040-5
Release containers	Science Supplies WLE corp	1 gallon
Rubber bands - cross #19	Alliance	ALL37196
Rubber bands - latitude #64	Skillcraft	NSN0589974
Scale	Ohaus	H-4737
Seed germination paper - Heavy stock 76#	Anchor Paper	#76
Shipping coolers- 16 x 13 x 12.5"	MrBoxonline.com	Husky Foam Cooler kit
Sieve #20	Advantech	20BS8F
Sieve #30	Advantech	30BS8F
Small cage - Bug Dorm	MegaView	Bug Dorm-1
Small CO2 chamber	Mainstays	Walmart # 562922221
Souffle cup lid	SOLO	41165277456
Souffle cups - 4 oz (1 oz = 29.6 mL)	SOLO	41165024104
Sponge	ocelo	MMM7274FD
Squeeze bottle	Dynalon	3UUP6
Stereoscope	Meiji Techno	EMZ-5
Stockinette	BSN Medical	30-1006
Styrofoam			extruded polystyrene foam
Tropical fish flake food	Tetra	4.52 pound
Vaccum chamber - desiccator	BelArt	T9FB892757
Weigh boats	Globe Scientific	3621