JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا التقرير تقنيات عزل وتنقية الجليكوسامينوغليكانات الكبريتية (GAGs) من العينات البيولوجية ونهج إلكتروفورسيس هلام البولي أكريلاميد لتقريب حجمها. تساهم GAGs في بنية الأنسجة والتأثير على عمليات الإشارات عبر التفاعل الكهروستاتيكي مع البروتينات. يساهم طول البوليمر GAG في تقاربها الملزم للليجانات cognate.

Abstract

الكبريتات الجليكوسامينوغليكان (GAGs) مثل كبريتات الهيباران (HS) وكبريتات شوندرويتين (CS) موجودة في كل مكان في الكائنات الحية وتلعب دورا حاسما في مجموعة متنوعة من الهياكل والعمليات البيولوجية الأساسية. كما البوليمرات، GAGs موجودة كخليط متعدد الأضلاع التي تحتوي على سلاسل البوليساكريد التي يمكن أن تتراوح بين 4000 دا إلى أكثر من 40،000 دا. داخل هذه السلاسل توجد مجالات الكبريت، مما يمنح نمطا من الشحنة السلبية التي تسهل التفاعل مع بقايا مشحونة إيجابيا من ليغند البروتين cognate. يجب أن تكون المجالات الكبريتية من GAGs من طول كاف للسماح لهذه التفاعلات الكهربائية. لفهم وظيفة GAGs في الأنسجة البيولوجية ، يجب أن يكون المحقق قادرا على عزل وتنقية وقياس حجم GAGs. يصف هذا التقرير تقنية عملية ومتعددة الاستخدامات تعتمد على جل البولي أكريلاميد تعتمد على الكهروفورسيس والتي يمكن الاستفادة منها لحل الاختلافات الصغيرة نسبيا في الحجم بين GAGs المعزولة عن مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة البيولوجية.

Introduction

الجليكوسامينوغليكان (GAGs) هي عائلة متنوعة من السكريات الخطية التي هي عنصر في كل مكان في الكائنات الحية وتساهم في العديد من العمليات الفسيولوجية الأساسية1. ويمكن كبريتات GAGs مثل كبريتات الهيباران (HS) وكبريتات شوندرويتين (CS) في مواقع متميزة على طول سلسلة البوليساكريد ، مما يضفي مجالات جغرافية من الشحنة السلبية. هذه GAGs، عندما المربوطة إلى البروتينات سطح الخلية المعروفة باسم البروتيوغليكان، المشروع في الفضاء خارج الخلية وربط ليغاندس cognate، مما يسمح لتنظيم كل من رابطة الدول المستقلة- (ligand تعلق على نفس الخلية) وعبر -(ligand تعلق على الخلية المجاورة) عمليات الإشارة2. وعلاوة على ذلك، GAGs أيضا أداء الأدوار الحاسمة كعناصر هيكلية في الأنسجة مثل غشاء الطابق السفلي الكبيبي3،والغليكولايل البطانيةالوعائية 4 والظهارية الرئوية الجليكوكاليك5،وفي الأنسجة الضامة مثل الغضاريف6.

يختلف طول سلاسل الكمامات متعددة الشاريد بشكل كبير وفقا لسياقها البيولوجي ويمكن إطالته بشكل ديناميكي ، وتكبيله ، وتعديله بواسطة نظام تنظيمي أنزيمي معقد للغاية7. الأهم من ذلك ، فإن طول سلاسل البوليمر GAG يساهم بشكل كبير في تقاربها الملزم للليجاند ، وبالتالي ، إلى وظيفتها البيولوجية8،9. ولهذا السبب، فإن تحديد وظيفة GAG الداخلي يتطلب تقديرا لحجمها. لسوء الحظ ، على عكس البروتينات والأحماض النووية ، لا يوجد سوى عدد قليل جدا من التقنيات المتاحة بسهولة للكشف عن GAGs وقياسها ، مما أدى تاريخيا إلى تحقيق محدود نسبيا في الأدوار البيولوجية لهذه العائلة المتنوعة من السكريات المتعددة.

توضح هذه المقالة كيفية عزل وتنقية GAGs من معظم الأنسجة البيولوجية ، وتصف أيضا كيفية استخدام البولي أكريلاميد هلام electrophoresis (PAGE) لتقييم طول البوليمرات المعزولة بدرجة معقولة من التحديد. وعلى النقيض من النهج الجليكومية الأخرى البالغة التعقيد (والتي غالبا ما تكون قائمة على قياس الطيف الكتلي)، يمكن استخدام هذه الطريقة باستخدام معدات وتقنيات مختبرية قياسية. ولذلك، فإن هذا النهج العملي قد يوسع قدرة المحققين على تحديد الدور البيولوجي لغاغس الأصلية وتفاعلها مع الليجاندات ذات الأهمية السياقية.

Protocol

تم الحصول على جميع العينات البيولوجية التي تم تحليلها في هذا البروتوكول من الفئران، بموجب بروتوكولات وافقت عليها لجنة العناية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة كولورادو.

1. عزل كبريتات الهيباران

  1. تهذي عينات الأنسجة
    ملاحظة: Delipidation هو خطوة اختيارية للأنسجة الغنية بالدهون.
    1. جعل خليط 1:1 من الميثانول وديكلوروميثان. إعداد ما يقرب من 500 ميكرولتر لكل عينة؛ قد تتطلب قطع أكبر من الأنسجة ما يصل إلى 1 مل.
    2. ضع كل عينة نسيج في وعاء زجاجي صغير مع غطاء للتهذي.
      ملاحظة: قد تختلف كتلة العينة حسب الأنسجة ذات الاهتمام والاحتياجات التجريبية. 50 ملغ أو أقل عادة ما تكون كافية لغلة GAG كافية, ولكن قد تكون هناك حاجة إلى بعض الأمثل من قبل المستخدم النهائي.
    3. إضافة 500 ميكرولتر من الميثانول: حل ثنائي كلورو الميثان لكل حاوية زجاجية ومزيج. تأكد من أن جميع عينات الأنسجة الصلبة مغمورة بالكامل في المذيبات.
      ملاحظة: استخدام ماصة المصلية أو أنابيب مخروطية بلاستيكية لخلط ومعالجة الميثانول / ثنائي كلورو الميثان؛ قد تذوب المواد البلاستيكية الأخرى.
    4. ضع عينات على شاكر (في حامل آمن) في غطاء أبخرة كيميائي وحرض بلطف لمدة ساعة واحدة.
    5. حرض العينات على الخلط والطرد المركزي عند 17000 × غرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    6. ماصة بعناية من كسر المذيبات العضوية (supernatant). هذا هو كسر الدهون - لا يحتوي على GAGs ويمكن التخلص منه.
      ملاحظة: حاول عدم إزعاج الأنسجة حيث يمكن فقدان القطع الصغيرة. من الأفضل ترك بعض الطبقة العضوية في حاوية العينة ، بدلا من المخاطرة بفقدان العينة.
    7. اترك غطاء الحاوية الزجاجية مفتوحا واتركه يتبخر بين عشية وضحاها في غطاء محرك السيارة. تغيير أنبوب للخطوة التالية لأن تلك الأنابيب لن البقاء على قيد الحياة مزيد من المعالجة.
    8. بمجرد أن يتبخر خليط المذيبات بالكامل ، انتقل إلى التفكك الميكانيكي (إذا كانت العينة المتبقية >50 ملغ) أو هضم Actinase E (< 50 ملغ).
  2. التفكك الميكانيكي للأنسجة الصلبة (اختياري؛ لعينات الأنسجة الكبيرة)
    ملاحظة: معظم القطع الصغيرة من الأنسجة الصلبة (حوالي 50 ملغ أو أقل) يجب أن تذوب تماما أثناء خطوة الهضم. ومع ذلك، سوف تتطلب عينات أكبر تفكك ميكانيكي.
    1. عينات فلاش تجميد الفائدة عن طريق وضعها في أنبوب البولي بروبلين الحجم المناسب ووضع أنبوب مغلق في النيتروجين السائل. السماح للعينة لتجميد حتى الصلبة تماما.
    2. باستخدام هاون نظيفة والحشرات، طحن العينات المجمدة في اتساق مسحوق مثل.
    3. انتقل مباشرة إلى عملية الهضم Actinase E (الخطوة 1.4).
  3. عينة تحلية وتركيز
    ملاحظة: هذه خطوة اختيارية ولا تتطلب سوى عينات الأنسجة السائلة المخففة (على سبيل المثال، سائل الحمم الهوائية القصبي -الحويصلات الهوائية (BALF) أو البلازما).
    1. تجميع عينات سائلة في مجموعات تجريبية مناسبة (على سبيل المثال، عن طريق التكرار البيولوجي، أو المجموعة التجريبية)
    2. ضع إجمالي حجم العينة في عمود فلتر طرد مركزي سعة 500 ميكرولتر مع خفض الوزن الجزيئي (MWCO) يبلغ 3000 دا.
    3. تدور لمدة 30 دقيقة في 14،000 × ز في درجة حرارة الغرفة. كرر حسب الحاجة إذا تجاوز حجم العينة المطلوب سعة عمود عامل التصفية الطرد المركزي.
    4. اغسل كل عمود 3x مع 400 ميكرولتر من الماء المصفى. تجاهل التدفق من خلال.
    5. عكس مرشح وتدور لمدة 1 دقيقة في 2000 × ز في أنابيب جمع الطازجة، وصفت بشكل مناسب. تجميد عند -80 درجة مئوية أو المضي قدما إلى الخطوة التالية.
  4. أكتيناسي E الهضم
    ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة لهضم وإزالة ملوثات البروتين من العينة في نهاية المطاف.
    1. مزيج عينات 1:1 مع أكتيناسي E المؤتلف إلى التركيز المطلوب من 10 ملغم / مل. إضافة حجم مناسب من التركيز العازلة الهضم 10x. التركيز النهائي المطلوب: 0.005 M خلات الكالسيوم و 0.01 M خلات الصوديوم، الأس الحموضة 7.5. على سبيل المثال: 190 ميكرولتر من العينة السائلة، 190 ميكرولتر من 20 ملغم/مل أكتيناسي E، 20 ميكرولتر من خلات الكالسيوم 0.05 م، 0.1 م خلات الصوديوم.
    2. يهيج عينات بلطف أن يمزج, بعد ذلك هضم ل 48-72 ح في 55 °C (حتى 7 أيام للأنسجة كاملة).
    3. الحرارة إلى 80 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة لتسخين أكتيناسي E.
    4. تجميد العينة عند -80 درجة مئوية أو الاستمرار في الخطوة 1.5.
  5. عينة تحلية وتركيز
    ملاحظة: إذا كان من المتوقع وجود كتلة منخفضة من GAG ذات الأهمية في العينة البيولوجية، أو إذا كان من المستحسن حفظ الكواشف الاستهلاكية (أي أعمدة فلتر الطرد المركزي)، يمكن تجميع العينات لإنتاج تركيز واحد لكل مجموعة تجريبية (على سبيل المثال، عن طريق التكرار البيولوجي، أو المجموعة التجريبية).
    1. ضع إجمالي حجم العينة في عمود فلتر طرد مركزي سعة 500 ميكرولتر مع MWCO يبلغ 3000 دا.
    2. تدور لمدة 30 دقيقة في 14،000 × ز في درجة حرارة الغرفة. كرر حسب الحاجة، إذا تجاوز حجم العينة المطلوب سعة عمود فلتر الطرد المركزي.
    3. غسل كل عمود 3x مع 400 ميكرولتر deionized، والمياه المصفاة. تجاهل التدفق من خلال.
    4. عكس مرشح وتدور لمدة 1 دقيقة في 2000 × ز في أنابيب جمع الطازجة ، وصفت بشكل مناسب (المدرجة عموما مع أعمدة تصفية الطرد المركزي). تجميد عند -80 درجة مئوية أو المضي قدما إلى الخطوة التالية.
  6. الجفاف
    1. إما وضع عينات المذاب من الخطوة 1.5.5 في التركيز فراغ التناوب بين عشية وضحاها أو lyophilize العينات كما هو مفصل أدناه.
    2. تجميد العينات جيدا إما بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية أو عن طريق غمس في النيتروجين السائل.
    3. بيرس عينة الأغطية مع إبرة 18 G ومكان في غرفة الليتوفيلي. إضافة مناشف ورقية للتعبئة حسب الحاجة.
    4. إصلاح غرفة الليوفيلييزر إلى الليوفيليزر وتجميد الجافة بين عشية وضحاها (على الأقل -40 درجة مئوية، 0.135 تور)
  7. عمود تبادل Cation
    1. Resuspend المجففة عينات في ما يصل إلى 400 ميكرولتر من 8 M اليوريا، 2٪ CHAPS الحل (أو، إذا جمع العينات، resuspend إلى حد أقصى (400/n) ميكرولتر، حيث ن = عدد العينات في بركة المطلوب. استخدام أقل قدر ممكن من محلول المنظفات.
    2. توازن تبادل cation (IEX) العمود مع 400 ميكرولتر من 8 M اليوريا، 2٪ CHAPS الحل. تدور لمدة 5 دقائق في 2000 × ز في درجة حرارة الغرفة.
    3. تحميل 400 ميكرولتر من عينات عينة / مجمعة في العمود IEX. تدور لمدة 5 دقائق في 2000 × ز.
    4. غسل 3x مع 400 ميكرولتر من 8 M اليوريا، 2٪ CHAPS الحل. تدور لمدة 5 دقائق في 2000 × ز في كل مرة.
    5. Elute 3x مع 400 ميكرولتر من 0.2 م NaCl. تدور لمدة 5 دقائق في 2000 × غرام لكل منهما. هذا هو كسر تقارب منخفض - وهذا يمكن الاحتفاظ بها لأغراض مراقبة الجودة إذا رغبت في ذلك.
    6. Elute 3x مع 400 ميكرولتر من 2.7 M (16٪) NaCl. تدور لمدة 5 دقائق في 2000 × غرام لكل منهما. هذا الكسر سوف تحتوي على الجليكوسامينوغليكان معزولة من الفائدة - الحفاظ على كل ذلك!
    7. لإزالة كل جزء من الكسور، أضف الميثانول حتى 80 فول٪ واحتضنه عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تدور كل عينة لمدة 5 دقائق في 2000 × ز. استرداد بقايا الصلبة كما يتم تجفيف هذا جليكوسامينوغليكان دي المملحة.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، تخطي هذه الخطوة ثم انتقل إلى الخطوة 1.8 إلى إزالة الملح eluate بدون الميثانول.
  8. عينة تحلية وتركيز
    1. إذا لزم الأمر، تجمع الكسور الملتوية (من 1.7.6) في مجموعات تجريبية مناسبة (على سبيل المثال، عن طريق التكرار البيولوجي، أو المجموعة التجريبية).
    2. ضع إجمالي حجم العينة في عمود فلتر طرد مركزي سعة 500 ميكرولتر مع MWCO يبلغ 3000 دا.
    3. تدور لمدة 30 دقيقة في 14،000 × ز في درجة حرارة الغرفة. كرر حسب الحاجة، إذا تجاوز حجم العينة المطلوب سعة عمود فلتر الطرد المركزي.
    4. غسل كل عمود 3x مع 400 ميكرولتر deionized، والمياه المصفاة. تجاهل التدفق من خلاله. انتقل مباشرة إلى الخطوة 1.9.
  9. هضم شوندرويتين
    ملاحظة: الغرض من هذه الخطوة هو إزالة GAGs غير ذات أهمية للمستخدم النهائي. في هذه الحالة، يتم استخدام شوندرويتيناس لإزالة شوندرويتين. في الأنسجة المستخدمة لتوليد النتائج التمثيلية (broncho-alveolar lavage fluid والرئة بأكملها) ، فإن هضم كبريتات شوندرويتين يترك كبريتات الهيباران كغاغة رئيسية متبقية. قد يحتاج المستخدمون النهائيون إلى إضافة خطوات هضم إضافية اعتمادا على أهدافهم التجريبية.
    1. تحميل 350 ميكرولتر من العازلة الهضم (خلات الأمونيوم 50 mM مع 2 mM كلوريد الكالسيوم تعديلها إلى درجة الحموضة 7.0) إلى عمود تصفية الطرد المركزي دون لمس الغشاء.
    2. إضافة 5 ميكرولتر من chondroitinase ABC المؤتلف.
    3. ضع أنبوب العينات في فرن 37 درجة مئوية واحتضنه لمدة ساعة واحدة.
    4. قم بتحويل العمود ووضعه إلى أنابيب تجميع تحمل تسمية مناسبة. تدور لمدة 1 دقيقة في 2000 x ز.
    5. عينات الحرارة إلى 80 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة لتثبيط chondroitinase ABC.
  10. عينة تحلية وتركيز
    1. إذا لزم الأمر، تجمع chondroitin هضم عينات من الخطوة 1.9.5 إلى مجموعات تجريبية مناسبة (على سبيل المثال، عن طريق تكرار البيولوجية، أو مجموعة تجريبية)
    2. ضع إجمالي حجم العينة في عمود فلتر طرد مركزي سعة 500 ميكرولتر مع MWCO يبلغ 3000 دا.
    3. تدور لمدة 30 دقيقة في 14،000 × ز في درجة حرارة الغرفة. كرر حسب الحاجة إذا تجاوز حجم العينة المطلوب سعة عمود فلتر الطرد المركزي.
    4. غسل كل عمود 3x مع 400 ميكرولتر deionized، والمياه المصفاة. تجاهل التدفق من خلال.
    5. عكس مرشح وتدور لمدة 1 دقيقة في 2000 × ز في أنابيب جمع الطازجة ، وصفت بشكل مناسب. تجميد عند -80 درجة مئوية أو المضي قدما إلى الخطوة التالية.
  11. الجفاف
    ملاحظة: في هذه الخطوة، الجفاف ضروري بحيث يمكن إعادة إنفاق العينات في أصغر كمية ممكنة من المياه ومخازن مؤقتة قيد التشغيل.
    1. إما وضع عينات chondroitin هضم من الخطوة 1.10.5 مباشرة في التركيز فراغ التناوب بين عشية وضحاها أو lyophilize على النحو التالي:
    2. تجميد العينات جيدا إما بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية أو عن طريق غمس في النيتروجين السائل.
    3. بيرس عينة الأغطية مع إبرة 18 G ومكان في غرفة الليتوفيلي. إضافة مناشف ورقية للتعبئة حسب الحاجة.
    4. إصلاح غرفة الليوفيلييزر إلى الليوفيليزر وتجميد الجافة بين عشية وضحاها (على الأقل 40 درجة مئوية، 0.135 تور)

2. البولي أكريلاميد هلام الكهربائي من الجليكوسامينوغليكان المعزولة والمنقية

  1. إعداد الحلول اللازمة لداء إلكتروفورسيس هلام البولي أكريلاميد (PAGE) مقدما (الجدول 1).
    ملاحظة: حدد النسبة المئوية من الأكريلاميد لحل محلول الجل اعتمادا على حجم الجليكوسامينوغليكان المتوقع أن تكون في العينة. يوصى ب 15٪ لحل الأجزاء الأكبر (أكبر من 30 وحدة فرعية من وحدات فك الشاريد في الطول)؛ 22٪ للأجزاء الأصغر (<20 وحدة فرعية من فصل الأحرف في الطول).
  2. ضع كاسيت فارغ في خزان PAGE. يلقي هلام حل على النحو التالي: في أنبوب 15 مل، مزيج 10 مل من حل هلام حل، 60 ميكرولتر من 10٪ كبريتات الأمونيوم (يجب أن تكون مستعدة حديثا)، و 10 ميكروغرام من TEMED (إضافة TEMED الماضي). عكس أنبوب بلطف 2-3x. استخدام ماصة لإضافة بسرعة الحل أعلاه 10 مل إلى كاسيت. تراكب مع 2 مل من المياه المصفاة، deionized والسماح للجل حل لبوليمرة لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: تم تحسين بروتوكول PAGE التالي لنظام PAGE عمودي باستخدام أشرطة صب سمكها 13.3 × 8.7 سم (العرض × الطول) بحجم 1.0 مم بحجم إجمالي يبلغ 12 مل تقريبا. يمكن استخدام أنظمة كاسيت أخرى ولكن قد تتطلب التحسين من قبل المستخدم النهائي.
  3. بعد حل هلام قد بلمرة تماما، تجاهل الماء مضاف ويلقي هلام التراص على النحو التالي: في أنبوب 15 مل، مزيج 3 مل من محلول هلام التراص، 90 ميكروغرام من 10٪ كبريتات الأمونيوم (يجب أن تكون مستعدة حديثا)، 3 ميكرولتر من TEMED (إضافة TEMED الماضي).
  4. عكس أنبوب بلطف 2-3x. استخدام ماصة لإضافة بسرعة حل هلام التراص على هلام حل صلبة; ملء كاسيت إلى حافة. إدراج مشط بالكامل المدرجة مع إعداد. السماح للهلام التراص لبوليمرة لمدة 30 دقيقة.
  5. بمجرد أن يبوليمر الجل ، تأكد من إزالة شريط الشريط من أسفل الكاسيت ، ووضع الكاسيت مرة أخرى في تجميع خزان PAGE.
  6. املأ الغرف العلوية والسفلية بحاجز الغرفة العلوي والسفلي، على التوالي.
  7. حل العينات المجففة من الخطوة 1.11.4 في الحد الأدنى من الحجم اللازم من المياه المجففة، وإزالة التأين (على الأكثر، 50٪ من حجم الآبار في هلام PAGE). خلط 1:1 مع عينة تحميل المخزن المؤقت. تحميل العينات وHS oligosaccharide "سلالم" (انظر الجدول 1)في هلام.
  8. قبل تشغيل هلام لمدة 5 دقائق في 100 V. ثم تشغيل هلام في 200 V لمدة 20-25 دقيقة (ل15٪ هلام حل البولي أكريلاميد)، 40-50 دقيقة (ل18٪ هلام حل البولي أكريلاميد)، 90-100 دقيقة (ل22٪ هلام حل البولي أكريلاميد).
    ملاحظة: قد يكون بعض الأمثل من وقت التشغيل 200 V الضرورية. فينول الأحمر يهاجر قبل أوليغوساكاريد الهيبارين التي هي 2 وحدات فرعية البوليمر في الطول (أي درجة البلمرة 2، أو dp2)؛ بروموفينول الأزرق يهاجر قبل dp10-dp14. يتم الحصول على أفضل النتائج عندما يتم تطبيق الجهد بحيث تهاجر الفرقة الحمراء الفينول تقريبا، ولكن ليس تماما، إلى الجزء السفلي من هلام. ضبط وقت التشغيل وفقا لذلك.

3. بروتوكول تلطيخ الفضة

  1. إعداد جميع الحلول اللازمة لتلطيخ الفضة مقدما (الجدول 2).
    ملاحظة: لا تلمس جل PAGE مباشرة حتى يتم تلطيخه وتطويره ووضعه في محلول الإيقاف. بدلا من ذلك، التعامل مع هلام باستخدام أدوات نظيفة من البلاستيك أو الزجاج. سيؤدي التعامل المباشر مع الجل إلى تشوهات في بصمة الإصبع وغيرها من القطع الأثرية المرئية على الجل بعد التلطيخ.
  2. بمجرد الانتهاء من تشغيل، تفكيك كاسيت واستخراج هلام في وعاء نظيف، متوسطة الحجم مليئة المياه المؤينة، وتصفيتها.
    ملاحظة: لتجنب التعامل مباشرة مع الجل، استخدم طرف ماصة أو غيرها من الكائنات البلاستيكية لتقشير بلطف هلام بعيدا عن كاسيت في حين غمرت في الماء. هلام قد تكون هشة - التعامل بعناية.
    1. تجاهل الماء. وصمة عار الجل في محلول تلطيخ الأزرق Alcian لمدة 5 دقائق.
    2. تجاهل البقعة الزرقاء الألسيان. شطف بسرعة / غسل 2-3x مع المياه المصفاة، deionized حتى تمت إزالة معظم محلول تلطيخ الأزرق Alcian.
    3. السماح لإزالة وصمة عار في المياه deionized، تصفية بين عشية وضحاها على الروك. تأكد من وجود كمية وافرة من المياه المصفاة والغينة لضمان غسل أي بقعة متبقية بالكامل من الجل بين عشية وضحاها.
    4. غسل هلام في الميثانول 50٪ (40 دقيقة المجموع، تغيير الحل 2-3x).
    5. غسل هلام في الماء deionized، تصفية لمدة 30 دقيقة. تجاهل الماء وكرر 3 المزيد من الوقت لما مجموعه 2 ساعة، واستبدال الماء في كل مرة.
    6. في وعاء نظيف طازج، قم بصبغ الجل لمدة 30 دقيقة في محلول تلطيخ نترات الفضة.
    7. شطف بسرعة / غسل 2-3x في المياه deionized، تصفية لإزالة تماما الحل تلطيخ الفضة.
    8. يغسل لمدة 30 دقيقة في الماء المتأين والمصفى. تجاهل الماء وتكرار 2x لما مجموعه 90 دقيقة، واستبدال حمام الماء في كل مرة.
    9. تجاهل المياه وإضافة حل النامية.
    10. بمجرد إضافة حل النامية، ومراقبة بعناية هلام ومشاهدة لظهور العصابات. اعتمادا على نوعية وصمة عار وكتلة العينة المحملة، يمكن أن يستغرق التطوير في أي مكان من بضع ثوان إلى عدة دقائق.
    11. بمجرد أن تكون العصابات المطلوبة مرئية ، تجاهل على الفور تطوير الحل وغسل لفترة وجيزة مع حل التوقف.
    12. تجاهل وقف غسل محلول واستبدالها مع محلول وقف جديدة. السماح لنقع لمدة 1 ساعة على الروك أو شاكر.
    13. غسل في المياه deionized، تصفية بين عشية وضحاها (ومع ذلك، يمكن تصوير هلام مباشرة بعد وقف غسل الحل).

النتائج

يستخدم الأزرق الألسيان ل وصمة عار GAGs كبريتيد 10; يتم تضخيم هذه الإشارة باستخدام بقعة فضية لاحقة 11. الشكل 1 يوفر عرضا مرئيا لعملية تطوير تلطيخ الفضة. كما هو موضح، يتم تضخيم الإشارة الزرقاء الألسيان تمثل GAGs مفصولة الكهربائي كما وكيل النامية تخترق هلا?...

Discussion

تلعب مجموعات GAGs دورا مركزيا في العديد من العمليات البيولوجية المتنوعة. واحدة من الوظائف الرئيسية لغاغات كبريتات (مثل HS و CS) هو التفاعل مع وربط ليغاندس، والتي يمكن أن تغير وظائف الإشارات المصب. محدد مهم لتقارب GAG ملزمة لgnate ligands هو طول سلسلة البوليمر GAG 8،9،

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل F31 HL143873-01 (WBL) ، R01 HL125371 (RJL و EPS)

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Accuspin Micro17 benchtop microcentrifugethermoFisher Scientific13-100-675Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate
Acrylamide (solid)thermoFisher ScientificBP170-100Electrophoresis grade
Actinase ESigma AldrichP5147Protease mix from S. griseus
Alcian Blue 8GX (solid)thermoFisher ScientificAC400460100
Ammonium acetate (solid)thermoFisher ScientificA639-500Molecular biology grade
Ammonium hydroxide (liquid)thermoFisher ScientificA669S-500certified ACS
Ammonium persulfate (solid)thermoFisher ScientificBP179-25electrophoresis grade
Barnstead GenPure Pro Water Purification SystemThermoFisher Scientific10-451-217PKGAny water deionizing/ purification system is an acceptable substitute
Boric acid (solid)thermoFisher ScientificA73-500Molecular biology grade
Bromphenol blue (solid)thermoFisher ScientificB392-5
Calcium acetate (solid)ThermoFisher Scientific18-609-432Molecular biology grade
Calcium chloride (solid)ThermoFisher ScientificAC349610250Molecular biology grade
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)ThermoFisher Scientific28299
Chondroitinase ABCSigma AldrichC3667
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)Bio-Rad3459901Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)Bio-Rad1656019any comparable vertical gel PAGE system will work)
Dichloromethane (liquid)thermoFisher ScientificAC610931000certified ACS
EDTA disodium salt (solid)thermoFisher Scientific02-002-786Molecular biology grade
Glacial acetic acid (liquid)thermoFisher ScientificA35-500Certified ACS
Glycine (solid)thermoFisher ScientificG48-500Electrophoresis grade
Heparanase I/IIISigma AldrichH3917From Flavobacterium heparinum
Heparin derived decasaccharide (dp10)galen scientificHO10
Heparin derived hexasaccharde (dp6)Galen scientificHO06
Heparin derived oligosaccharide (dp20)galen scientificHO20
Hydrochloric acid (liquid)thermoFisher ScientificA466-250
LyophilizerLabconco7752020Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator
Methanol (liquid)thermoFisher ScientificA412-500Certified ACS
Molecular Imager Gel Doc XR SystemBio-Rad170-8170Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid)thermoFisher ScientificBP171-25Electrophoresis grade
Phenol red (solid)thermoFisher ScientificP74-10Free acid
Q Mini H Ion Exchange ColumnVivapureVS-IX01QH24Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11
Silver nitrate (solid)thermoFisher ScientificS181-25certified ACS
Sodium Acetate (solid)ThermoFisher ScientificS210-500Molecular biology grade
Sodium chloride (solid)thermoFisher ScientificS271-500Molecular biology grade
Sodium hydroxide (solid)thermoFisher ScientificS392-212
Sucrose (solid)thermoFisher ScientificBP220-1Molecular biology grade
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine)thermoFisher ScientificBP150-20Electrophoresis grade
Tris base (solid)thermoFisher ScientificBP152-500Molecular biology grade
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoffAmiconUFC500324Larger volume filter units may be used, depending on sample size. 
Urea (solid)ThermoFisher Scientific29700
Vacufuge PlusEppendorf22820001Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volumethermoFisher Scientific569-0020Alternative volumes and filter materials acceptable

References

  1. LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
  2. Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
  3. Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
  4. Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
  5. Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
  6. Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
  7. Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
  8. Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
  9. Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
  10. Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
  11. Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
  12. Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
  13. Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
  14. Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
  15. Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
  16. Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
  17. Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
  18. Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
  19. Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved