Detecção de glicosaminoglicanos por Electrophoresis gel poliacrilamida e coloração de prata

Resumo

Este relatório descreve técnicas para isolar e purificar glicosaminoglycanos sulfatos (GAGs) de amostras biológicas e uma abordagem de eletroforese de gel de poliacrilamida para aproximar seu tamanho. Os GAGs contribuem para a estrutura tecidual e influenciam os processos de sinalização através da interação eletrostática com proteínas. O comprimento do polímero GAG contribui para sua afinidade vinculante para ligantes cognatos.

Resumo

Glicosaminoglicanos sulfatos (GAGs) como sulfato de heparan (HS) e sulfato de condroitina (CS) são onipresentes em organismos vivos e desempenham um papel crítico em uma variedade de estruturas e processos biológicos básicos. Como polímeros, os GAGs existem como uma mistura de polidisperse contendo cadeias de polissacarídeos que podem variar de 4000 Da a bem mais de 40.000 Da. Dentro dessas cadeias existem domínios de sulfatação, conferindo um padrão de carga negativa que facilita a interação com resíduos carregados positivamente de ligantes proteicos cognatos. Os domínios sul-americanos dos GAGs devem ter comprimento suficiente para permitir essas interações eletrostáticas. Para entender a função dos GAGs em tecidos biológicos, o pesquisador deve ser capaz de isolar, purificar e medir o tamanho dos GAGs. Este relatório descreve uma técnica prática e versátil baseada em gel de poliacrilamida baseada em eletroforese que pode ser aproveitada para resolver diferenças relativamente pequenas de tamanho entre GAGs isolados de uma variedade de tipos de tecidos biológicos.

Introdução

Os glicosaminoglicanos (GAGs) são uma família diversificada de polissacarídeos lineares que são um elemento onipresente em organismos vivos e contribuem para muitos processos fisiológicos básicos¹. GaGs como sulfato de heparan (HS) e sulfato de condroitina (CS) podem ser sulfatados em posições distintas ao longo da cadeia de polissacarídeos, transmitindo domínios geográficos de carga negativa. Esses GAGs, quando amarrados a proteínas da superfície celular conhecidas como proteoglycans, projetam-se no espaço extracelular e se ligam a ligantes cognatos, permitindo a regulação tanto dos processos de sinalização cis- (ligantes ligados à mesma célula) quanto trans( ligantes ligados à célula vizinha) processos de sinalização². Além disso, os GAGs também desempenham papéis críticos como elementos estruturais em tecidos como a membrana glomerular do porão^3,o glicocalyx endotelial vascular⁴ e a glicocalyx epitelial^{pulmonar 5}, e em tecidos conjuntivos tais cartilagem⁶.

O comprimento das cadeias de polissacarídeos GAG varia substancialmente de acordo com seu contexto biológico e pode ser dinamicamente alongado, cortado e modificado por um sistema regulatório enzimático altamente complexo⁷. É importante ressaltar que o comprimento das cadeias de polímeros GAG contribui substancialmente para sua afinidade vinculante com ligantes e, posteriormente, para sua função biológica^8,9. Por essa razão, a determinação da função de um GAG endógeno requer a valorização de seu tamanho. Infelizmente, ao contrário de proteínas e ácidos nucleicos, existem muito poucas técnicas prontamente disponíveis para detectar e medir GAGs, o que historicamente resultou em uma investigação relativamente limitada sobre os papéis biológicos desta diversificada família polissacarídeo.

Este artigo descreve como isolar e purificar GAGs da maioria dos tecidos biológicos, e, também, descreve como usar a eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) para avaliar o comprimento dos polímeros isolados com um grau justo de especificidade. Em contraste com outras abordagens glicomicicas altamente complexas (e muitas vezes baseadas em espectrometria de massa), este método pode ser empregado usando equipamentos e técnicas de laboratório padrão. Essa abordagem prática pode, portanto, expandir a capacidade dos investigadores de determinar o papel biológico dos GAGs nativos e sua interação com ligantes contextualmente importantes.

Protocolo

Todas as amostras biológicas analisadas neste protocolo foram obtidas a partir de camundongos, sob protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Colorado.

1. Isolamento de sulfato heparano

1. Delipidação de amostras de tecido
   NOTA: A delipidação é um passo opcional para tecidos ricos em gordura.
   1. Faça uma mistura de 1:1 de metanol e diclorometano. Preparar aproximadamente 500 μL por amostra; pedaços maiores de tecido podem exigir até 1 mL.
   2. Coloque cada amostra de tecido em um pequeno recipiente de vidro com uma tampa para delipidação.
      NOTA: A massa amostral pode variar de acordo com o tecido de interesse e necessidades experimentais. 50 mg ou menos é normalmente suficiente para o rendimento adequado do GAG, mas alguma otimização pode ser necessária pelo usuário final.
   3. Adicione 500 μL da solução de metanol:diclorometano a cada recipiente de vidro e misture. Certifique-se de que todas as amostras de tecido sólido estão completamente submersas em solvente.
      NOTA: Use pipetas sorológicas ou tubos cônicos plásticos para misturar e manusear a solução de metanol/diclorometano; outros plásticos podem dissolver.
   4. Coloque amostras em um agitador (em rack seguro) em um capô de fumaça química e agitar suavemente por 1h.
   5. Agitar as amostras para misturar e centrífugas a 17.000 x g por 5 min a 4 °C.
   6. Pipeta cuidadosamente a fração de solvente orgânico (supernasteante). Esta é a fração lipídica - não contém GAGs e pode ser descartada.
      NOTA: Tente não perturbar o tecido, pois pequenos pedaços podem ser perdidos. É preferível deixar parte da camada orgânica no recipiente de amostra, em vez de arriscar a perda da amostra.
   7. Deixe a tampa do recipiente de vidro aberta e deixe-a evaporar durante a noite no capô. Troque o tubo para o próximo passo, pois esses tubos não sobreviverão a mais processamento.
   8. Uma vez que a mistura de solventes tenha evaporado completamente, proceda à desintegração mecânica (se a amostra residual for >50 mg) ou digestão Actinase E (< 50 mgs).
2. Desintegração mecânica do tecido sólido (opcional; para amostras de tecido maior)
   NOTA: A maioria dos pedaços menores de tecido sólido (aproximadamente 50 mg ou menos) deve dissolver-se completamente durante a etapa de digestão. No entanto, amostras maiores exigirão desintegração mecânica.
   1. Amostras de interesse congelantes piscando colocando-as em um tubo de polipropileno de tamanho apropriado e colocando o tubo fechado em nitrogênio líquido. Deixe a amostra congelar até ficar completamente sólida.
   2. Usando uma argamassa limpa e pilão, triture amostras congeladas em uma consistência em pó.
   3. Prossiga diretamente para digestão Actinase E (Passo 1.4).
3. Desalting e concentração de amostras
   NOTA: Este é um passo opcional e apenas necessário para amostras de tecido líquido diluído (por exemplo, bronco-alveolar fluido de lavage (BALF) ou plasma).
   1. Biolou amostras líquidas em grupos experimentais apropriados (por exemplo, por replicação biológica ou grupo experimental)
   2. Coloque o volume total da amostra em uma coluna de filtro centrífugo de 500 μL com um corte de peso molecular (MWCO) de 3.000 Da.
   3. Gire por 30 min a 14.000 x g em temperatura ambiente. Repita conforme necessário se o volume amostral desejado exceder a capacidade da coluna do filtro centrífugo.
   4. Lave cada coluna 3x com 400 μL de água desionizada e filtrada. Descarte o fluxo através.
   5. Inverta o filtro e gire por 1 min a 2.000 x g em tubos de coleta frescos e apropriadamente rotulados. Congele a -80 °C ou siga para o próximo passo.
4. Digestão Actinase E
   NOTA: Esta etapa é necessária para digerir e, finalmente, remover contaminantes proteicos da sua amostra.
   1. Misture amostras 1:1 com Actinase E recombinante para uma concentração desejada de 10 mg/mL. Adicione o volume apropriado do concentrado tampão de digestão de 10x. Concentração final desejada: acetato de cálcio de 0,005 M e acetato de sódio de 0,01 M, pH 7,5. Por exemplo: 190 μL de amostra líquida, 190 μL de 20 mg/mL Actinase E, 20 μL de acetato de cálcio de 0,05 M, acetato de sódio de 0,1 M.
   2. Agitar amostras suavemente para misturar, em seguida, digerir por 48-72 h a 55 °C (até 7 dias para tecido inteiro).
   3. Aqueça a 80 °C por 15-20 min para aquecer a ativação Actinase E.
   4. Congele a amostra a -80 °C ou continue a passo 1,5.
5. Desalting e concentração de amostras
   NOTA: Se uma baixa massa de interesse da GAG for antecipada na amostra biológica, ou se a conservação de reagentes consumíveis (ou seja, colunas de filtro centrífugo) é desejável, as amostras podem ser agrupadas para produzir um único concentrado por grupo experimental (por exemplo, por replicação biológica ou grupo experimental).
   1. Coloque o volume total da amostra em uma coluna de filtro centrífugo de 500 μL com um MWCO de 3.000 Da.
   2. Gire por 30 min a 14.000 x g em temperatura ambiente. Repita conforme necessário, se o volume amostral desejado exceder a capacidade da coluna do filtro centrífugo.
   3. Lave cada coluna 3x com 400 μL de água desionizada e filtrada. Descarte o fluxo através.
   4. Inadvertida filtro e giro por 1 min a 2.000 x g em tubos de coleta frescos e apropriadamente rotulados (geralmente incluídos com as colunas do filtro centrífuga). Congele a -80 °C ou siga para o próximo passo.
6. Dessecação
   1. Coloque as amostras dissolvidas da etapa 1.5.5 em um concentrador de vácuo rotacional durante a noite ou liofilize as amostras conforme detalhado abaixo.
   2. Congele as amostras completamente durante a noite em -80 °C ou mergulhando em nitrogênio líquido.
   3. Pierce amostra tampas com uma agulha de 18 G e coloque na câmara de lyophilizer. Adicione toalhas de papel para embalar conforme necessário.
   4. Fixar câmara de liofilizador para liofilizador e congelar durante a noite (pelo menos -40 °C, 0,135 Torr)
7. Coluna de troca de cation
   1. Amostras dessecadas de ressuspend em até 400 μL de 8 M de ureia, solução CHAPS de 2% (ou, se agrupando amostras, resuspend a um máximo de (400/n) μL, onde n = o número de amostras na piscina desejada. Use o mínimo possível da solução de detergente.
   2. Equilibre a coluna de troca de cation (IEX) com 400 μL de 8 M de ureia, solução CHAPS de 2%. Gire por 5 min a 2.000 x g em temperatura ambiente.
   3. Carregar 400 μL de amostras/amostras agrupadas na coluna IEX. Gire por 5 min a 2.000 x g.
   4. Lave 3x com 400 μL de 8 M de ureia, solução CHAPS de 2%. Gire por 5 min a 2.000 x g todas as vezes.
   5. Elute 3x com 400 μL de 0,2 M NaCl. Gire por 5 min a 2.000 x g cada. Esta é a fração de baixa afinidade - esta pode ser retida para fins de controle de qualidade, se desejar.
   6. Elute 3x com 400 μL de 2,7 M (16%) NaCl. Gire por 5 min a 2.000 x g cada. Esta fração conterá os glicosaminoglicanos isolados de interesse - guarde tudo!
   7. Para desalar cada fração elucidada, adicione metanol até 80 vol% e incubar a 4 °C durante a noite. Gire cada amostra por 5 min a 2.000 x g. Recupere o resíduo sólido, pois este é glicosaminogligliglicano seco.
      NOTA: Alternativamente, pule esta etapa e prossiga para a etapa 1.8 para desaderar o elunato sem metanol.
8. Desalting e concentração de amostras
   1. Se necessário, o pool eluia frações (de 1,7.6) em grupos experimentais apropriados (por exemplo, por réplica biológica ou grupo experimental).
   2. Coloque o volume total da amostra em uma coluna de filtro centrífugo de 500 μL com um MWCO de 3.000 Da.
   3. Gire por 30 min a 14.000 x g em temperatura ambiente. Repita conforme necessário, se o volume amostral desejado exceder a capacidade da coluna do filtro centrífugo.
   4. Lave cada coluna 3x com 400 μL de água desionizada e filtrada. Descarte o fluxo através. Prossiga diretamente para a etapa 1.9.
9. Digestão de condroitina
   NOTA: O objetivo desta etapa é remover GAGs não de interesse do usuário final. Neste caso, a condroitina é usada para remover a condroitina. Nos tecidos utilizados para a geração de Resultados Representativos (fluido de lavage bronco-alveolar e pulmão inteiro), a digestão do sulfato de condroitina deixa o sulfato heparan como a GAG residual primária. Os usuários finais podem precisar adicionar etapas adicionais de digestão, dependendo de seus objetivos experimentais.
   1. Carregar 350 μL de tampão de digestão (acetato de amônio de 50 mM com cloreto de cálcio de 2 mM ajustado ao pH 7.0) à coluna do filtro centrífuga sem tocar na membrana.
   2. Adicione 5 μL de condroitinase recombinante ABC.
   3. Coloque o tubo de amostras em um forno de 37 °C e incubar por 1h.
   4. Vire a coluna e coloque em tubos de coleta devidamente rotulados. Gire por 1 min a 2000 x g.
   5. Amostras de calor a 80 °C por 15-20 min para inativar condroitinase ABC.
10. Desalting e concentração de amostras
    1. Se necessário, a condroitina da piscina digeriu amostras da etapa 1.9.5 em grupos experimentais apropriados (por exemplo, por replicação biológica ou grupo experimental)
    2. Coloque o volume total da amostra em uma coluna de filtro centrífugo de 500 μL com um MWCO de 3.000 Da.
    3. Gire por 30 min a 14.000 x g em temperatura ambiente. Repita conforme necessário se o volume amostral desejado exceder a capacidade da coluna do filtro centrífugo.
    4. Lave cada coluna 3x com 400 μL de água desionizada e filtrada. Descarte o fluxo através.
    5. Inadvertidamente filtro e gire por 1 min a 2.000 x g em tubos de coleta frescos e devidamente rotulados. Congele a -80 °C ou siga para o próximo passo.
11. Dessecação
    NOTA: Nesta etapa, é necessário dessecação para que as amostras possam ser resuspendidas na menor quantidade possível de água e tampão de corrente.
    1. Coloque as amostras digeridas da condroitina a partir da etapa 1.10.5 diretamente em um concentrador de vácuo rotacional durante a noite ou liofilize da seguinte forma:
    2. Congele as amostras completamente durante a noite em -80 °C ou mergulhando em nitrogênio líquido.
    3. Pierce amostra tampas com uma agulha de 18 G e coloque na câmara de lyophilizer. Adicione toalhas de papel para embalar conforme necessário.
    4. Fixar câmara de liofilizador para liofilizador e congelar seco durante a noite (pelo menos 40 °C, 0,135 Torr)

2. Eletroforese de gel de poliacrilamida de glicosaminoglycanos isolados e purificados

1. Prepare as soluções necessárias para a eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) com antecedência(Tabela 1).
   NOTA: Selecione a acrilamida por cento da solução de gel de resolução, dependendo do tamanho dos glicosaminoglicanos esperados para estar na amostra. Recomenda-se 15% para a resolução de fragmentos maiores (maiores que 30 subunidades descaramento em comprimento); 22% para fragmentos menores (<20 subunidades descaramento em comprimento).
2. Coloque o vazio no tanque PAGE. Molde o gel de resolução da seguinte forma: Em tubo de 15 mL, misture 10 mL de solução de gel de resolução, 60 μL de 10% de persulfeto de amônio (deve ser preparado recentemente) e 10 μL de TEMED (adicionar TEMED por último). Inverta o tubo suavemente 2-3x. Use a pipeta para adicionar rapidamente a solução acima de 10 mL ao. Sobreposição com 2 mL de água desionizada e filtrada e permitir que o gel de resolução polimerize por 30 minutos.
   NOTA: O protocolo PAGE a seguir foi otimizado para um sistema PAGE vertical usando de fundição de 13,3 x 8,7cm (largura x comprimento) de 1,0 mm de espessura com um volume total de aproximadamente 12mL. Outros sistemas de podem ser usados, mas podem exigir otimização pelo usuário final.
3. Após o gel de resolução ter polimerizado totalmente, descarte a água sobreposta e lance o gel de empilhamento da seguinte forma: em um tubo de 15 mL, misture 3 mL da solução de gel de empilhamento, 90 μL de persulfito de amônio de 10% (deve ser preparado recentemente), 3 μL de TEMED (adicionar por último TEMED).
4. Inverta o tubo suavemente 2-3x. Use uma pipeta para adicionar rapidamente a solução de gel de empilhamento sobre o gel de resolução solidificado; preencher para borda. Insira totalmente o pente incluído com a configuração. Deixe o gel de empilhamento polimerizar por 30 minutos.
5. Uma vez que o gel tenha polimerizado, certifique-se de que a tira de fita seja removida da parte inferior do e coloque o de volta no conjunto do tanque PAGE.
6. Encha as câmaras superior e inferior com tampão de câmara superior e inferior, respectivamente.
7. Dissolva as amostras secas da etapa 1.11.4 no volume mínimo necessário de água desionizada e filtrada (no máximo, 50% do volume dos poços no gel PAGE). Misture 1:1 com o tampão de carga da amostra. Carregue as amostras e as "escadas" de oligossacarídeo hs (ver Tabela 1) no gel.
8. Pré-executar o gel por 5 min a 100 V. Em seguida, execute o gel a 200 V por 20-25 min (para um gel de resolução de poliacrilamida de 15%) ), 40-50 min (para um gel de resolução de poliacrilamida de 18%)
   NOTA: Alguma otimização do tempo de execução de 200 V pode ser necessária. O vermelho fenol migra à frente de oligossacarídeos de heparina que são 2 subunidades de polímeros em comprimento (ou seja, grau de polimerização 2, ou dp2); o azul bromofenol migra antes do dp10-dp14. Os melhores resultados são obtidos quando a tensão é aplicada de tal forma que a faixa vermelha fenol migra quase, mas não completamente, para o fundo do gel. Ajuste o tempo de execução de acordo.

3. Protocolo de coloração de prata

1. Prepare todas as soluções necessárias para a coloração de prata com antecedência(Tabela 2).
   NOTA: Não toque diretamente no gel PAGE até que ele tenha sido manchado, desenvolvido e colocado em solução stop. Em vez disso, manipule o gel usando ferramentas de plástico ou vidro limpas. O manuseio direto do gel resultará em distorções de impressão digital e outros artefatos visíveis no gel após a coloração.
2. Uma vez concluída a execução, desmonte o e o extrato de gel em um recipiente limpo, médio-grande, cheio de água desionizada e filtrada.
   NOTA: Para evitar manusear diretamente o gel, use a ponta da pipeta ou outro objeto plástico para retirar suavemente o gel da fita enquanto estiver submerso na água. O gel pode ser frágil - manuseie com cuidado.
   1. Descarte a água. Manche o gel na solução de coloração azul alciano por 5 min.
   2. Descarte a mancha azul alciana. Enxágüe/lave rapidamente 2-3x com água filtrada desionizada até que a maior parte da solução de coloração azul alciano tenha sido removida.
   3. Deixe des colorigar em água desionizada e filtrada durante a noite no roqueiro. Certifique-se de que há um grande volume de água filtrada e desionizada para garantir que qualquer mancha residual seja totalmente lavada do gel durante a noite.
   4. Lave gel em 50% de metanol (40 min total, mude a solução 2-3x).
   5. Lave gel em água desionizada e filtrada por 30 minutos. Descarte a água e repita mais 3 vezes para um total de 2h, substituindo a água cada vez.
   6. Em um recipiente fresco e limpo, manche o gel por 30 min em solução de coloração de nitrato de prata.
   7. Enxágüe/lave rapidamente 2-3x em água filtrada desionizada para remover totalmente a solução de coloração de prata.
   8. Lave por 30 minutos em água desionizada e filtrada. Descarte a água e repita 2x por um total de 90 minutos, substituindo o banho de água cada vez.
   9. Descarte a água e adicione a solução de desenvolvimento.
   10. Uma vez adicionada a solução em desenvolvimento, observe cuidadosamente o gel e observe o aparecimento de bandas. Dependendo da qualidade da mancha e da massa da amostra carregada, o desenvolvimento pode levar de alguns segundos a vários minutos.
   11. Assim que as bandas desejadas estiverem visíveis, descarte imediatamente a solução de desenvolvimento e lave brevemente com a solução stop.
   12. Descarte a solução stop lavar e substitua por uma solução de parada fresca. Deixe de molho por 1h em um roqueiro ou agitador.
   13. Lave em água desionizada e filtrada durante a noite (no entanto, o gel pode ser imageado imediatamente após a lavagem da solução stop).

Resultados

O azul alciano é usado para manchar GAGs ^{sulfatos 10}; este sinal é amplificado pelo uso de uma mancha de prata subsequente ¹¹. A Figura 1 fornece uma demonstração visual do processo de desenvolvimento de manchas de prata. Como demonstrado, o sinal azul alciano representando GAGs separados por eletroforese é amplificado à medida que o agente em desenvolvimento penetra o gel de poliacrilamida. Normalmente, o processo de desenvolvimento redu...

Discussão

Os GAGs desempenham um papel central em muitos processos biológicos diversos. Uma das principais funções dos GAGs sulfatados (como HS e CS) é interagir e ligar-se aos ligantes, o que pode alterar as funções de sinalização a jusante. Um importante determinante da afinidade de ligação gag com ligantes cognatos é o comprimento da cadeia de polímeros GAG ^8,9,14. Por essa razão, é importante que os pesquisadores possam ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge	thermoFisher Scientific	13-100-675	Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate
Acrylamide (solid)	thermoFisher Scientific	BP170-100	Electrophoresis grade
Actinase E	Sigma Aldrich	P5147	Protease mix from S. griseus
Alcian Blue 8GX (solid)	thermoFisher Scientific	AC400460100
Ammonium acetate (solid)	thermoFisher Scientific	A639-500	Molecular biology grade
Ammonium hydroxide (liquid)	thermoFisher Scientific	A669S-500	certified ACS
Ammonium persulfate (solid)	thermoFisher Scientific	BP179-25	electrophoresis grade
Barnstead GenPure Pro Water Purification System	ThermoFisher Scientific	10-451-217PKG	Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute
Boric acid (solid)	thermoFisher Scientific	A73-500	Molecular biology grade
Bromphenol blue (solid)	thermoFisher Scientific	B392-5
Calcium acetate (solid)	ThermoFisher Scientific	18-609-432	Molecular biology grade
Calcium chloride (solid)	ThermoFisher Scientific	AC349610250	Molecular biology grade
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)	ThermoFisher Scientific	28299
Chondroitinase ABC	Sigma Aldrich	C3667
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)	Bio-Rad	3459901	Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)	Bio-Rad	1656019	any comparable vertical gel PAGE system will work)
Dichloromethane (liquid)	thermoFisher Scientific	AC610931000	certified ACS
EDTA disodium salt (solid)	thermoFisher Scientific	02-002-786	Molecular biology grade
Glacial acetic acid (liquid)	thermoFisher Scientific	A35-500	Certified ACS
Glycine (solid)	thermoFisher Scientific	G48-500	Electrophoresis grade
Heparanase I/III	Sigma Aldrich	H3917	From Flavobacterium heparinum
Heparin derived decasaccharide (dp10)	galen scientific	HO10
Heparin derived hexasaccharde (dp6)	Galen scientific	HO06
Heparin derived oligosaccharide (dp20)	galen scientific	HO20
Hydrochloric acid (liquid)	thermoFisher Scientific	A466-250
Lyophilizer	Labconco	7752020	Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator
Methanol (liquid)	thermoFisher Scientific	A412-500	Certified ACS
Molecular Imager Gel Doc XR System	Bio-Rad	170-8170	Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid)	thermoFisher Scientific	BP171-25	Electrophoresis grade
Phenol red (solid)	thermoFisher Scientific	P74-10	Free acid
Q Mini H Ion Exchange Column	Vivapure	VS-IX01QH24	Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11
Silver nitrate (solid)	thermoFisher Scientific	S181-25	certified ACS
Sodium Acetate (solid)	ThermoFisher Scientific	S210-500	Molecular biology grade
Sodium chloride (solid)	thermoFisher Scientific	S271-500	Molecular biology grade
Sodium hydroxide (solid)	thermoFisher Scientific	S392-212
Sucrose (solid)	thermoFisher Scientific	BP220-1	Molecular biology grade
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine)	thermoFisher Scientific	BP150-20	Electrophoresis grade
Tris base (solid)	thermoFisher Scientific	BP152-500	Molecular biology grade
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff	Amicon	UFC500324	Larger volume filter units may be used, depending on sample size.
Urea (solid)	ThermoFisher Scientific	29700
Vacufuge Plus	Eppendorf	22820001	Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume	thermoFisher Scientific	569-0020	Alternative volumes and filter materials acceptable