Rilevazione di glicosaminoglicani mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide e colorazione dell'argento

Riepilogo

Questo rapporto descrive le tecniche per isolare e purificare i glicosaminoglicani solfati (GAG) da campioni biologici e un approccio di elettroforesi su gel di poliacrilammide per approssimarne le dimensioni. I GAG contribuiscono alla struttura dei tessuti e influenzano i processi di segnalazione attraverso l'interazione elettrostatica con le proteine. La lunghezza del polimero GAG contribuisce alla loro affinità di legame per i ligandi affini.

Abstract

I glicosaminoglicani solfati (GAG) come l'eparina solfato (HS) e il solfato di condroitina (CS) sono onnipresenti negli organismi viventi e svolgono un ruolo fondamentale in una varietà di strutture e processi biologici di base. Come polimeri, i GAG esistono come una miscela polidispersa contenente catene di polisaccaridi che possono variare da 4000 Da a ben oltre 40.000 Da. All'interno di queste catene esistono domini di solfatazione, che conferiscono un modello di carica negativa che facilita l'interazione con residui caricati positivamente di ligandi proteici affini. I domini solfatati dei GAG devono essere di lunghezza sufficiente per consentire queste interazioni elettrostatiche. Per comprendere la funzione dei GAG nei tessuti biologici, lo sperimentatore deve essere in grado di isolare, purificare e misurare le dimensioni dei GAG. Questo rapporto descrive una tecnica pratica e versatile basata sull'elettroforesi su gel di poliacrilammide che può essere sfruttata per risolvere differenze di dimensioni relativamente piccole tra i GAG isolati da una varietà di tipi di tessuto biologico.

Introduzione

I glicosaminoglicani (GAG) sono una famiglia diversificata di polisaccaridi lineari che sono un elemento onnipresente negli organismi viventi e contribuiscono a molti processi fisiologici di base¹. GAG come eparina solfato (HS) e condroitin solfato (CS) possono essere solfatati in posizioni distinte lungo la catena dei polisaccaridi, impartendo domini geografici di carica negativa. Questi GAG, quando legati a proteine della superficie cellulare note come proteoglicani, si proiettano nello spazio extracellulare e si legano a ligandi affini, consentendo la regolazione dei processi di segnalazione cis- (ligando attaccato alla stessa cellula) e trans- (ligando attaccato alla cellula vicina)². Inoltre, i GAG svolgono anche ruoli critici come elementi strutturali in tessuti come la membrana basale glomerulare^3,il glicocalyx⁴ endoteliale vascolare e il glicocalyx epiteliale polmonare⁵e nei tessuti connettivi come la cartilagine^6.

La lunghezza delle catene di polisaccaridi GAG varia sostanzialmente a seconda del suo contesto biologico e può essere dinamicamente allungata, scissa e modificata da un sistema di regolazione enzimatico altamente complesso⁷. È importante sottolineare che la lunghezza delle catene polimeriche GAG contribuisce in modo sostanziale alla loro affinità di legame per i ligandi e, successivamente, alla loro funzione biologica^8,9. Per questo motivo, la determinazione della funzione di un GAG endogeno richiede l'apprezzamento delle sue dimensioni. Sfortunatamente, a differenza delle proteine e degli acidi nucleici, esistono pochissime tecniche prontamente disponibili per rilevare e misurare i GAG, il che ha storicamente portato a un'indagine relativamente limitata sui ruoli biologici di questa diversa famiglia di polisaccaridi.

Questo articolo descrive come isolare e purificare i GAG dalla maggior parte dei tessuti biologici e, inoltre, descrive come utilizzare l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) per valutare la lunghezza dei polimeri isolati con un discreto grado di specificità. A differenza di altri approcci glicemici altamente complessi (e spesso basati sulla spettrometria di massa), questo metodo può essere impiegato utilizzando apparecchiature e tecniche di laboratorio standard. Questo approccio pratico può, quindi, espandere la capacità degli investigatori di determinare il ruolo biologico dei GAG nativi e la loro interazione con ligandi contestualmente importanti.

Protocollo

Tutti i campioni biologici analizzati in questo protocollo sono stati ottenuti da topi, secondo protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Colorado.

1. Isolamento del solfato di eparina

1. Delipidazione di campioni di tessuto
   NOTA: La delipidazione è un passaggio facoltativo per i tessuti ricchi di grasso.
   1. Fare una miscela 1: 1 di metanolo e diclorometano. Preparare circa 500 μL per campione; pezzi di tessuto più grandi possono richiedere fino a 1 ml.
   2. Posizionare ogni campione di tessuto in un piccolo contenitore di vetro con un coperchio per la delipidazione.
      NOTA: La massa del campione può variare in base al tessuto di interesse e alle esigenze sperimentali. 50 mg o meno sono in genere sufficienti per un'adeguata resa GAG, ma una certa ottimizzazione può essere richiesta dall'utente finale.
   3. Aggiungere 500 μL della soluzione di metanolo:diclorometano a ciascun contenitore di vetro e mescolare. Assicurarsi che tutti i campioni di tessuto solido siano completamente immersi nel solvente.
      NOTA: utilizzare pipette sierologiche o tubi conici di plastica per miscelare e maneggiare la soluzione di metanolo/diclorometano; altre materie plastiche possono dissolversi.
   4. Posizionare i campioni su uno shaker (in un rack fissato) in una cappa chimica e agitare delicatamente per 1 ora.
   5. Agitare i campioni per mescolare e centrifugare a 17.000 x g per 5 minuti a 4 °C.
   6. Pipettare con cura la frazione organica del solvente (surnatante). Questa è la frazione lipidica - non contiene GAG e può essere scartata.
      NOTA: Cerca di non disturbare il tessuto poiché piccoli pezzi potrebbero andare persi. È preferibile lasciare parte dello strato organico nel contenitore del campione, piuttosto che rischiare la perdita del campione.
   7. Lasciare aperto il coperchio del contenitore di vetro e lasciarlo evaporare per una notte nel cofano. Cambia il tubo per il passaggio successivo poiché quei tubi non sopravviveranno a un'ulteriore elaborazione.
   8. Una volta che la miscela di solvente è completamente evaporata, procedere alla disintegrazione meccanica (se il campione residuo è >50 mg) o alla digestione dell'Actinasi E (< 50 mg).
2. Disintegrazione meccanica del tessuto solido (opzionale; per campioni di tessuto più grandi)
   NOTA: La maggior parte dei pezzi più piccoli di tessuto solido (circa 50 mg o meno) dovrebbe dissolversi completamente durante la fase di digestione. Tuttavia, campioni più grandi richiederanno la disintegrazione meccanica.
   1. Flash-freeze campioni di interesse posizionandoli in un tubo di polipropilene di dimensioni appropriate e posizionando il tubo chiuso in azoto liquido. Lasciare che il campione si congeli fino a completo solidità.
   2. Usando un mortaio pulito e un pestello, macinare i campioni congelati in una consistenza simile alla polvere.
   3. Procedere direttamente alla digestione dell'Actinasi E (Fase 1.4).
3. Dissaliziazione e concentrazione del campione
   NOTA: questa è una fase facoltativa e richiesta solo per i campioni di tessuto liquido diluito (ad esempio, liquido di lavaggio bronco-alveolare (BALF) o plasma).
   1. Raggruppare campioni liquidi in gruppi sperimentali appropriati (ad esempio, per replica biologica o gruppo sperimentale)
   2. Posizionare il volume totale del campione in una colonna filtrante centrifuga da 500 μL con un cut-off a peso molecolare (MWCO) di 3.000 Da.
   3. Girare per 30 minuti a 14.000 x g a temperatura ambiente. Ripetere se necessario se il volume del campione desiderato supera la capacità della colonna del filtro centrifugo.
   4. Lavare ogni colonna 3 volte con 400 μL di acqua deionizzata e filtrata. Scartare il flusso attraverso.
   5. Invertire il filtro e ruotare per 1 minuto a 2.000 x g in tubi di raccolta freschi e opportunamente etichettati. Congelare a -80 °C o procedere al passaggio successivo.
4. Actinasi E digestione
   NOTA: questo passaggio è necessario per digerire e infine rimuovere i contaminanti proteici dal campione.
   1. Mescolare i campioni 1:1 con Actinase E ricombinante alla concentrazione desiderata di 10 mg/ml. Aggiungere il volume appropriato di 10x concentrato tampone di digestione. Concentrazione finale desiderata: 0,005 M acetato di calcio e 0,01 M acetato di sodio, pH 7,5. Ad esempio: 190 μL di campione liquido, 190 μL di Actinasi E da 20 mg/mL, 20 μL da 0,05 M acetato di calcio, 0,1 M acetato di sodio.
   2. Agitare delicatamente i campioni per mescolare, quindi digerire per 48-72 ore a 55 °C (fino a 7 giorni per il tessuto intero).
   3. Riscaldare a 80 °C per 15-20 minuti per riscaldare l'inattivazione dell'Actinasi E.
   4. Congelare il campione a -80 °C o continuare con il punto 1.5.
5. Dissaliziazione e concentrazione del campione
   NOTA: Se nel campione biologico è prevista una bassa massa del GAG di interesse, o se è auspicabile la conservazione dei reagenti consumabili (cioè colonne di filtro centrifugo), i campioni possono essere raggruppati per produrre un singolo concentrato per gruppo sperimentale (ad esempio, per replica biologica o gruppo sperimentale).
   1. Posizionare il volume totale del campione in una colonna filtrante centrifuga da 500 μL con un MWCO di 3.000 Da.
   2. Girare per 30 minuti a 14.000 x g a temperatura ambiente. Ripetere se necessario, se il volume di campione desiderato supera la capacità della colonna del filtro centrifugo.
   3. Lavare ogni colonna 3 volte con 400 μL di acqua deionizzata e filtrata. Scartare il flusso attraverso.
   4. Invertire il filtro e ruotare per 1 minuto a 2.000 x g in tubi di raccolta freschi e opportunamente etichettati (generalmente inclusi con le colonne del filtro centrifugo). Congelare a -80 °C o procedere al passaggio successivo.
6. Essiccazione
   1. Posizionare i campioni disciolti dal punto 1.5.5 in un concentratore a vuoto rotazionale durante la notte o liofilizzare i campioni come descritto di seguito.
   2. Congelare accuratamente i campioni durante la notte a -80 °C o immergendo in azoto liquido.
   3. Forare i coperchi del campione con un ago da 18 G e posizionare nella camera del liofilizzatore. Aggiungere asciugamani di carta per l'imballaggio secondo necessità.
   4. Fissare la camera del liofilizzatore al liofilizzatore e liofilizzatore durante la notte (almeno -40 °C, 0,135 Torr)
7. Colonna di scambio cationico
   1. Campioni essiccati in soluzione essiccata fino a 400 μL di urea 8 M, soluzione CHAPS al 2% (o, se si accumulano campioni, riconsegregati fino a un massimo di (400/n) μL, dove n = il numero di campioni nel pool desiderato. Utilizzare il minor numero possibile di soluzione detergente.
   2. Equilibrare la colonna di scambio cationico (IEX) con 400 μL di urea 8 M, soluzione CHAPS al 2%. Girare per 5 minuti a 2.000 x g a temperatura ambiente.
   3. Caricare 400 μL di campioni/campioni raggruppati nella colonna IEX. Girare per 5 minuti a 2.000 x g.
   4. Lavare 3x con 400 μL di 8 M di urea, soluzione CHAPS al 2%. Gira per 5 minuti a 2.000 x g ogni volta.
   5. Elute 3x con 400 μL di 0,2 M NaCl. Girare per 5 minuti a 2.000 x g ciascuno. Questa è la frazione a bassa affinità - questa può essere conservata per scopi di controllo qualità, se lo si desidera.
   6. Elute 3x con 400 μL di 2,7 M (16%) NaCl. Girare per 5 minuti a 2.000 x g ciascuno. Questa frazione conterrà i glicosaminoglicani isolati di interesse - tienilo tutto!
   7. Per dissalare ogni frazione eluita, aggiungere metanolo fino all'80 vol% e incubare a 4 °C durante la notte. Ruotare ogni campione per 5 minuti a 2.000 x g. Recuperare il residuo solido in quanto questo viene essiccato glicosaminoglicano disasato.
      NOTA: in alternativa, saltare questo passaggio e procedere al passaggio 1.8 per disacrosare l'eluato senza metanolo.
8. Dissaliziazione e concentrazione del campione
   1. Se necessario, raggruppare le frazioni eluite (da 1.7.6) in gruppi sperimentali appropriati (ad esempio, per replica biologica o gruppo sperimentale).
   2. Posizionare il volume totale del campione in una colonna filtrante centrifuga da 500 μL con un MWCO di 3.000 Da.
   3. Girare per 30 minuti a 14.000 x g a temperatura ambiente. Ripetere se necessario, se il volume di campione desiderato supera la capacità della colonna del filtro centrifugo.
   4. Lavare ogni colonna 3 volte con 400 μL di acqua deionizzata e filtrata. Scartare il flusso attraverso. Procedere direttamente al passaggio 1.9.
9. Digestione della condroitina
   NOTA: lo scopo di questo passaggio è rimuovere i GAG non di interesse per l'utente finale. In questo caso, la condroitinasi viene utilizzata per rimuovere la condroitina. Nei tessuti utilizzati per generare risultati rappresentativi (liquido di lavaggio bronco-alveolare e polmone intero), la digestione del solfato di condroitina lascia eparina solfato come gag residuo primario. Gli utenti finali potrebbero dover aggiungere ulteriori fasi di digestione a seconda dei loro obiettivi sperimentali.
   1. Caricare 350 μL di tampone di digestione (50 mM di acetato di ammonio con 2 mM di cloruro di calcio regolato a pH 7,0) sulla colonna del filtro centrifugo senza toccare la membrana.
   2. Aggiungere 5 μL di condroitinasi ABC ricombinante.
   3. Posizionare la provetta dei campioni in un forno a 37 °C e incubare per 1 ora.
   4. Capovolgere la colonna e posizionare in tubi di raccolta opportunamente etichettati. Girare per 1 min a 2000 x g.
   5. Riscaldare i campioni a 80 °C per 15-20 minuti per inattivare la condroitinasi ABC.
10. Dissaliziazione e concentrazione del campione
    1. Se necessario, raggruppare i campioni di condroitina digeriti dal passo 1.9.5 in gruppi sperimentali appropriati (ad esempio, per replica biologica o gruppo sperimentale)
    2. Posizionare il volume totale del campione in una colonna filtrante centrifuga da 500 μL con un MWCO di 3.000 Da.
    3. Girare per 30 minuti a 14.000 x g a temperatura ambiente. Ripetere se necessario se il volume del campione desiderato supera la capacità della colonna del filtro centrifugo.
    4. Lavare ogni colonna 3 volte con 400 μL di acqua deionizzata e filtrata. Scartare il flusso attraverso.
    5. Invertire il filtro e ruotare per 1 minuto a 2.000 x g in tubi di raccolta freschi e opportunamente etichettati. Congelare a -80 °C o procedere al passaggio successivo.
11. Essiccazione
    NOTA: in questa fase, l'essiccazione è necessaria in modo che i campioni possano essere risuscisi nella minor quantità possibile di acqua e tampone corrente.
    1. Posizionare i campioni digeriti di condroitina dal punto 1.10.5 direttamente in un concentratore di vuoto rotazionale durante la notte o liofilizzare come segue:
    2. Congelare accuratamente i campioni durante la notte a -80 °C o immergendo in azoto liquido.
    3. Forare i coperchi del campione con un ago da 18 G e posizionare nella camera del liofilizzatore. Aggiungere asciugamani di carta per l'imballaggio secondo necessità.
    4. Fissare la camera del liofilizzatore al liofilizzatore e liofilizzatore durante la notte (almeno 40 °C, 0,135 Torr)

2. Elettroforesi su gel di poliacrilammide di glicosaminoglicani isolati e purificati

1. Preparare in anticipo le soluzioni necessarie per l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) (Tabella 1).
   NOTA: Selezionare la percentuale di acrilammide della soluzione di gel risolutivo in base alle dimensioni dei glicosaminoglicani che si prevede siano nel campione. Il 15% è raccomandato per la risoluzione di frammenti più grandi (più di 30 subunità disaccaridi in lunghezza); 22% per frammenti più piccoli (<20 subunità di disaccaridi in lunghezza).
2. Inserire la cassetta vuota nel serbatoio PAGE. Gettare il gel risolutivo come segue: In un tubo da 15 mL, mescolare 10 mL di soluzione di gel risolutivo, 60 μL di persolfato di ammonio al 10% (deve essere preparato al momento) e 10 μL di TEMED (aggiungere TEMED per ultimo). Capovolgere delicatamente il tubo 2-3x. Utilizzare la pipetta per aggiungere rapidamente la soluzione di 10 ml di cui sopra alla cassetta. Sovrapporre con 2 ml di acqua deionizzata e filtrata e lasciare polimerizzare il gel risolutivo per 30 min.
   NOTA: il seguente protocollo PAGE è stato ottimizzato per un sistema PAGE verticale che utilizza cassette di fusione spesse 13,3 x 8,7 cm (larghezza x lunghezza) 1,0 mm con un volume totale di circa 12 ml. Altri sistemi di cassette possono essere utilizzati, ma possono richiedere l'ottimizzazione da parte dell'utente finale.
3. Dopo che il gel risolutivo si è completamente polimerizzato, scartare l'acqua sovrapposta e gettare il gel impilante come segue: in un tubo da 15 ml, mescolare 3 mL della soluzione di gel impilante, 90 μL di persolfato di ammonio al 10% (deve essere preparato al momento), 3 μL di TEMED (aggiungere TEMED per ultimo).
4. Capovolgere delicatamente il tubo 2-3x. Utilizzare una pipetta per aggiungere rapidamente la soluzione di gel impilabile sul gel risolutivo solidificato; riempire la cassetta fino all'orlo. Pettine completamente inserito incluso con il set-up. Lasciare polimerizzare il gel impilante per 30 minuti.
5. Una volta che il gel si è polimerizzato, assicurarsi che la striscia di nastro venga rimossa dal fondo della cassetta e riporre la cassetta nel gruppo del serbatoio PAGE.
6. Riempire le camere superiore e inferiore con il buffer della camera superiore e inferiore, rispettivamente.
7. Sciogliere i campioni essiccati dal punto 1.11.4 nel volume minimo necessario di acqua deionizzata e filtrata (al massimo, il 50% del volume dei pozzi nel gel PAGE). Mescolare 1:1 con il buffer di caricamento del campione. Caricare i campioni e le "scale" oligosaccaridiche HS (vedi Tabella 1) nel gel.
8. Pre-eseguire il gel per 5 minuti a 100 V. Quindi eseguire il gel a 200 V per 20-25 minuti (per un gel risolutivo poliacrilammide al 15%), 40-50 minuti (per un gel risolutivo poliacrilammide al 18%), 90-100 minuti (per gel risolutivo poliacrilammide al 22%).
   NOTA: potrebbe essere necessaria una certa ottimizzazione del tempo di esecuzione di 200 V. Il rosso fenolo migra davanti agli oligosaccaridi dell'eparina che sono 2 subunità polimeriche di lunghezza (cioè grado di polimerizzazione 2 o dp2); bromophenol blue migra davanti a dp10-dp14. I migliori risultati si ottengono quando la tensione viene applicata in modo tale che la banda rossa fenole migri quasi, ma non del tutto, sul fondo del gel. Regola il tempo di esecuzione di conseguenza.

3. Protocollo di colorazione dell'argento

1. Preparare in anticipo tutte le soluzioni necessarie per la colorazione dell'argento (Tabella 2).
   NOTA: non toccare direttamente il gel PAGE fino a quando non è stato macchiato, sviluppato e posto in soluzione di arresto. Invece, manipola il gel usando strumenti di plastica o vetro puliti. Maneggiare direttamente il gel comporterà distorsioni dell'impronta digitale e altri artefatti visibili sul gel dopo la colorazione.
2. Una volta completata la corsa, smontare la cassetta ed estrarre il gel in un contenitore pulito, medio-grande, riempito con acqua deionizzata e filtrata.
   NOTA: per evitare di maneggiare direttamente il gel, utilizzare la punta della pipetta o altro oggetto di plastica per staccare delicatamente il gel dalla cassetta mentre è immerso in acqua. Il gel può essere fragile - maneggiare con attenzione.
   1. Scartare l'acqua. Macchiare il gel in soluzione di colorazione blu Alcian per 5 minuti.
   2. Scartare la macchia blu alcian. Risciacquare/lavare rapidamente 2-3 volte con acqua deionizzata e filtrata fino a quando la maggior parte della soluzione colorante blu Alcian non è stata rimossa.
   3. Lasciare smacchiare in acqua deionizzata e filtrata per una notte sul bilanciere. Assicurarsi che vi sia un ampio volume di acqua deionizzata e filtrata per garantire che qualsiasi macchia residua venga completamente lavata via dal gel durante la notte.
   4. Gel di lavaggio in metanolo al 50% (40 min totali, cambio soluzione 2-3x).
   5. Lavare il gel in acqua deionizzata e filtrata per 30 min. Scartare l'acqua e ripetere altre 3 volte per un totale di 2 ore, sostituendo l'acqua ogni volta.
   6. In un contenitore fresco e pulito, macchiare il gel per 30 minuti in soluzione colorante di nitrato d'argento.
   7. Risciacquare / lavare rapidamente 2-3 volte in acqua deionizzata e filtrata per rimuovere completamente la soluzione colorante all'argento.
   8. Lavare per 30 minuti in acqua deionizzata e filtrata. Scartare l'acqua e ripetere 2 volte per un totale di 90 minuti, sostituendo ogni volta il bagno d'acqua.
   9. Scartare l'acqua e aggiungere la soluzione in via di sviluppo.
   10. Una volta aggiunta la soluzione di sviluppo, osservare attentamente il gel e osservare l'aspetto delle fasce. A seconda della qualità della macchia e della massa del campione caricato, lo sviluppo può richiedere da pochi secondi a diversi minuti.
   11. Non appena le bande desiderate sono visibili, scartare immediatamente la soluzione di sviluppo e lavare brevemente con la soluzione di arresto.
   12. Scartare la soluzione di arresto lavare e sostituirla con una soluzione di arresto fresco. Lasciare in ammollo per 1 ora su un bilanciere o shaker.
   13. Lavare in acqua deionizzata e filtrata durante la notte (tuttavia, il gel può essere ripreso immediatamente dopo aver interrotto il lavaggio con soluzione).

Risultati

Il blu alciano è usato per macchiare i GAG ^{solfati 10}; questo segnale è amplificato dall'uso di una successiva macchia d'argento ¹¹. La Figura 1 fornisce una dimostrazione visiva del processo di sviluppo della colorazione dell'argento. Come dimostrato, il segnale blu di Alcian che rappresenta i GAG separati dall'elettroforesi viene amplificato quando l'agente in via di sviluppo penetra nel gel di poliacrilammide. In genere, il processo di svi...

Discussione

I GAG svolgono un ruolo centrale in molti processi biologici diversi. Una delle funzioni principali dei GAG solfati (come HS e CS) è quella di interagire e legarsi ai ligandi, che possono alterare le funzioni di segnalazione a valle. Un importante determinante dell'affinità di legame GAG ai ligandi affini è la lunghezza della catena polimerica GAG ^8,9,14. Per questo motivo, è importante che i ricercatori siano in grado di de...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge	thermoFisher Scientific	13-100-675	Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate
Acrylamide (solid)	thermoFisher Scientific	BP170-100	Electrophoresis grade
Actinase E	Sigma Aldrich	P5147	Protease mix from S. griseus
Alcian Blue 8GX (solid)	thermoFisher Scientific	AC400460100
Ammonium acetate (solid)	thermoFisher Scientific	A639-500	Molecular biology grade
Ammonium hydroxide (liquid)	thermoFisher Scientific	A669S-500	certified ACS
Ammonium persulfate (solid)	thermoFisher Scientific	BP179-25	electrophoresis grade
Barnstead GenPure Pro Water Purification System	ThermoFisher Scientific	10-451-217PKG	Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute
Boric acid (solid)	thermoFisher Scientific	A73-500	Molecular biology grade
Bromphenol blue (solid)	thermoFisher Scientific	B392-5
Calcium acetate (solid)	ThermoFisher Scientific	18-609-432	Molecular biology grade
Calcium chloride (solid)	ThermoFisher Scientific	AC349610250	Molecular biology grade
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)	ThermoFisher Scientific	28299
Chondroitinase ABC	Sigma Aldrich	C3667
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)	Bio-Rad	3459901	Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)	Bio-Rad	1656019	any comparable vertical gel PAGE system will work)
Dichloromethane (liquid)	thermoFisher Scientific	AC610931000	certified ACS
EDTA disodium salt (solid)	thermoFisher Scientific	02-002-786	Molecular biology grade
Glacial acetic acid (liquid)	thermoFisher Scientific	A35-500	Certified ACS
Glycine (solid)	thermoFisher Scientific	G48-500	Electrophoresis grade
Heparanase I/III	Sigma Aldrich	H3917	From Flavobacterium heparinum
Heparin derived decasaccharide (dp10)	galen scientific	HO10
Heparin derived hexasaccharde (dp6)	Galen scientific	HO06
Heparin derived oligosaccharide (dp20)	galen scientific	HO20
Hydrochloric acid (liquid)	thermoFisher Scientific	A466-250
Lyophilizer	Labconco	7752020	Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator
Methanol (liquid)	thermoFisher Scientific	A412-500	Certified ACS
Molecular Imager Gel Doc XR System	Bio-Rad	170-8170	Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid)	thermoFisher Scientific	BP171-25	Electrophoresis grade
Phenol red (solid)	thermoFisher Scientific	P74-10	Free acid
Q Mini H Ion Exchange Column	Vivapure	VS-IX01QH24	Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11
Silver nitrate (solid)	thermoFisher Scientific	S181-25	certified ACS
Sodium Acetate (solid)	ThermoFisher Scientific	S210-500	Molecular biology grade
Sodium chloride (solid)	thermoFisher Scientific	S271-500	Molecular biology grade
Sodium hydroxide (solid)	thermoFisher Scientific	S392-212
Sucrose (solid)	thermoFisher Scientific	BP220-1	Molecular biology grade
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine)	thermoFisher Scientific	BP150-20	Electrophoresis grade
Tris base (solid)	thermoFisher Scientific	BP152-500	Molecular biology grade
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff	Amicon	UFC500324	Larger volume filter units may be used, depending on sample size.
Urea (solid)	ThermoFisher Scientific	29700
Vacufuge Plus	Eppendorf	22820001	Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume	thermoFisher Scientific	569-0020	Alternative volumes and filter materials acceptable