Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

דו"ח זה מתאר טכניקות לבודד ולטהר גליקוסאמינוגליקנים גופרתיים (GAGs) מדגימות ביולוגיות וגישה אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד בערך בגודלם. GAGs לתרום מבנה רקמות להשפיע על תהליכי איתות באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית עם חלבונים. אורך פולימר GAG תורם לזיקה המחייבת שלהם לליגנדים קוגנטיים.

Abstract

גליקוסאמינוגליקאנים גופרתיים (GAGs) כגון הפריאן סולפט (HS) וכונדרואיטין סולפט (CS) נמצאים בכל מקום באורגניזמים חיים וממלאים תפקיד קריטי במגוון מבנים ותהליכים ביולוגיים בסיסיים. כפולימרים, GAGs קיימים כתערובת פולידיספרס המכילה שרשראות פוליסכריד שיכולות לנוע בין 4000 Da ליותר מ -40,000 Da. בתוך שרשראות אלה קיימים תחומים של גופרית, המעניקים דפוס של מטען שלילי המאפשר אינטראקציה עם שאריות טעונות חיוביות של ליגנד חלבון קוגנייט. תחומים גופרתיים של GAGs חייב להיות באורך מספיק כדי לאפשר אינטראקציות אלקטרוסטטיות אלה. כדי להבין את הפונקציה של GAGs ברקמות ביולוגיות, החוקר חייב להיות מסוגל לבודד, לטהר, ולמדוד את הגודל של GAGs. דו"ח זה מתאר טכניקה מעשית ורב-תכליתית המבוססת על אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד שניתן למנף כדי לפתור הבדלים קטנים יחסית בגודל בין GAGs מבודדים ממגוון סוגי רקמות ביולוגיות.

Introduction

גליקוסאמינוגליקנס (GAGs) הם משפחה מגוונת של פוליסכרידים ליניאריים שהם יסוד בכל מקום באורגניזמים חיים ותורמים לתהליכים פיזיולוגיים בסיסיים רבים1. GAGs כגון הפריאן גופרתי (HS) וכונדרואיטין סולפט (CS) עשוי להיות גופרתי בעמדות שונות לאורך שרשרת הפוליסכריד, והענקת תחומים גיאוגרפיים של מטען שלילי. GAGs אלה, כאשר קשורים חלבונים פני התא המכונה proteoglycans, להקרין לתוך החלל החוץ תאי ונקשרים ליגנדים מודעים, המאפשר את הרגולציה של שני cis- (ליגנד מחובר לאותו תא) ו trans- (ליגנד מחובר לתא השכן) תהליכי איתות2. יתר על כן, GAGs גם לבצע תפקידים קריטיים כמו אלמנטים מבניים ברקמות כגוןקרוםהמרתף glomerular 3 , גליקוקליקס אנדותל וסקולרי4 וגליקוקליקס אפיתל ריאתי5, וברקמות חיבור כגון סחוס6.

אורך שרשראות הפוליסכריד GAG משתנה באופן משמעותי בהתאם להקשר הביולוגי שלה וניתן להאריך אותו באופן דינמי, לבקע ולשנותו על ידי מערכת רגולטורית אנזימטית מורכבת מאוד7. חשוב לציין, אורך שרשראות הפולימר GAG תורם באופן משמעותי לזיקתן המחייבת לליגנדים, ולאחר מכן לתפקוד הביולוגי שלהם8,9. מסיבה זו, קביעת הפונקציה של GAG אנדוגני דורש הערכה של גודלו. למרבה הצער, שלא כמו חלבונים וחומצות גרעין, מעט מאוד טכניקות זמינות קיימות כדי לזהות ולמדוד GAGs, אשר מבחינה היסטורית הביא חקירה מוגבלת יחסית לתוך התפקידים הביולוגיים של משפחת פוליסכריד מגוונת זו.

מאמר זה מתאר כיצד לבודד ולטהר GAGs מרוב הרקמות הביולוגיות, וגם, מתאר כיצד להשתמש אלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide (PAGE) כדי להעריך את אורך הפולימרים המבודדים עם מידה לא מבוטלת של ספציפיות. בניגוד לגישות גליקומוניות אחרות, מורכבות מאוד (ולעתים קרובות מבוססות ספקטרומטריית מסה), ניתן להשתמש בשיטה זו באמצעות ציוד מעבדה וטכניקות סטנדרטיות. גישה מעשית זו עשויה, אם כן, להרחיב את יכולתם של החוקרים לקבוע את התפקיד הביולוגי של GAGs ילידים ואת האינטראקציה שלהם עם ליגנדים חשובים מבחינה הקשרית.

Protocol

כל הדגימות הביולוגיות שניתחו בפרוטוקול זה התקבלו מעכברים, על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת קולורדו מוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בוועדה.

1. בידוד גופרתי של הפרין

  1. הזיון של דגימות רקמה
    הערה: הזיון הוא צעד אופציונלי עבור רקמות עשירות בשומן.
    1. הפוך תערובת 1:1 של מתנול ודיכלורומתאן. הכן כ 500 μL לדגימה; חתיכות גדולות יותר של רקמה עשויות לדרוש עד 1 מ"ל.
    2. מניחים כל דגימת רקמה במיכל זכוכית קטן עם מכסה להזיות.
      הערה: מסת המדגם עשויה להשתנות לכל רקמה של עניין וצרכים ניסיוניים. 50 מ"ג או פחות הוא בדרך כלל מספיק עבור תשואה GAG נאותה, אבל כמה אופטימיזציה עשויה להידרש על ידי משתמש הקצה.
    3. הוסף 500 μL של פתרון מתנול:dichloromethane לכל מיכל זכוכית לערבב. ודא שכל דגימות הרקמה המוצקה שקועות לחלוטין בממס.
      הערה: השתמש פיפטות סרולוגיות או צינורות חרוט פלסטיק לערבב ולטפל פתרון מתנול / דיכלורומתאן; פלסטיק אחר עלול להתמוסס.
    4. מניחים דגימות על שייקר (בארון מאובטח) במכסה אדים כימי ומסעירים בעדינות למשך שעה אחת.
    5. תסעירו את הדגימות לערבב ולצנטריפוגה ב-17,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    6. בזהירות pipette את שבר ממס אורגני (supernatant). זהו שבר השומנים - הוא אינו מכיל GAGs וניתן להשליך אותו.
      הערה: נסה לא להפריע לרקמה מכיוון שחלקים קטנים עלולים ללכת לאיבוד. עדיף להשאיר חלק מהשכבה האורגנית במיכל המדגם, במקום להסתכן באובדן המדגם.
    7. השאירו את המכסה של מיכל הזכוכית פתוח ולתת לו להתאדות לילה בשכונה. לשנות את הצינור לשלב הבא כמו צינורות אלה לא ישרדו עיבוד נוסף.
    8. לאחר תערובת הממס התאדה לחלוטין, להמשיך התפוררות מכנית (אם מדגם שיורית הוא >50 מ"ג) או אקטינאז E העיכול (< 50 מ"ג).
  2. התפוררות מכנית של רקמה מוצקה (אופציונלי; עבור דגימות רקמה גדולות יותר)
    הערה: רוב החלקים הקטנים יותר של רקמה מוצקה (כ 50 מ"ג או פחות) צריך להתמוסס לחלוטין במהלך שלב העיכול. עם זאת, דגימות גדולות יותר ידרשו התפוררות מכנית.
    1. דגימות פלאש להקפיא עניין על ידי הצבת אותם בצינור פוליפרופילן בגודל מתאים והנחת הצינור הסגור לתוך חנקן נוזלי. אפשר לדגימה לקפוא עד מוצק לחלוטין.
    2. בעזרת מרגמה ועלי נקיים, טוחנים דגימות קפואות למרקם דמוי אבקה.
    3. המשך ישירות לעיכול אקטינאז E (שלב 1.4).
  3. התפלה וריכוז לדוגמה
    הערה: זהו צעד אופציונלי ונדרש רק עבור דגימות רקמה נוזלית לדלל (למשל, נוזל שטיפה ברונכו-כתשית (BALF) או פלזמה).
    1. דגימות נוזליות בריכה לקבוצות ניסוי מתאימות (למשל, לפי שכפול ביולוגי, או קבוצת ניסוי)
    2. מקם את נפח הדגימה הכולל בעמודת מסנן צנטריפוגלית של 500 μL עם חיתוך משקל מולקולרי (MWCO) של 3,000 Da.
    3. ספין במשך 30 דקות ב 14,000 x g בטמפרטורת החדר. חזור על הפעולה לפי הצורך אם אמצעי האחסון לדוגמה הרצוי חורג מהקיבולת של עמודת המסנן הצנטריפוגלית.
    4. לשטוף כל עמודה 3x עם 400 μL של deionized, מים מסוננים. זרוק את הזרימה דרכה.
    5. הפוך את המסנן וסיבוב במשך 1 דקות ב 2,000 x g בצינורות אוסף טריים, מתויג כראוי. להקפיא ב -80 °C (70 °F) או להמשיך לשלב הבא.
  4. אקטינאז E עיכול
    הערה: שלב זה נדרש כדי לעכל ובסופו של דבר להסיר מזהמי חלבון מהדגימה שלך.
    1. מערבבים דגימות 1:1 עם רקומביננטי Actinase E לריכוז הרצוי של 10 מ"ג /מ"ל. הוסף נפח מתאים של תרכיז מאגר עיכול פי 10. הריכוז הסופי הרצוי: 0.005 M סידן אצטט ו 0.01 M נתרן אצטט, pH 7.5. לדוגמה: 190 μL של מדגם נוזלי, 190 μL של 20 מ"ג / מ"ל אקטינאז E, 20 μL של 0.05 M סידן אצטט, 0.1 M נתרן אצטט.
    2. דגימות נסערות בעדינות לערבב, ולאחר מכן לעכל במשך 48-72 שעות ב 55 °C (עד 7 ימים עבור רקמה שלמה).
    3. מחממים ל-80°C במשך 15-20 דקות כדי לחמם את אקטינאז E.
    4. להקפיא את המדגם ב -80 °C (5 °F) או להמשיך שלב 1.5.
  5. התפלה וריכוז לדוגמה
    הערה: אם מסה נמוכה של GAG של עניין צפוי במדגם הביולוגי, או אם שימור של ריאגנטים מתכלים (כלומר, עמודות מסנן צנטריפוגלי) רצוי, דגימות ניתן לאגד כדי לייצר תרכיז יחיד לכל קבוצה ניסיונית (למשל, על ידי שכפול ביולוגי, או קבוצת ניסוי).
    1. מקם את נפח הדגימה הכולל בעמודת מסנן צנטריפוגלית של 500 μL עם MWCO של 3,000 Da.
    2. ספין במשך 30 דקות ב 14,000 x g בטמפרטורת החדר. חזור על הפעולה לפי הצורך, אם נפח המדגם הרצוי חורג מהקיבולת של עמודת המסנן הצנטריפוגלי.
    3. לשטוף כל עמודה 3x עם 400 μL deionized, מים מסוננים. זרוק את הזרימה דרכה.
    4. הפוך מסנן וסיבוב במשך 1 דקות ב 2,000 x g בצינורות איסוף טריים, מתויג כראוי (כלול בדרך כלל עם עמודות מסנן צנטריפוגלי). להקפיא ב -80 °C (70 °F) או להמשיך לשלב הבא.
  6. ייבוש
    1. או למקם את הדגימות מומסות בשלב 1.5.5 ברכז ואקום סיבובי לילה או ליופיל את הדגימות כמפורט להלן.
    2. להקפיא דגימות ביסודיות או לילה ב -80 °C (80 °F) או על ידי טבילה בחנקן נוזלי.
    3. פירס מכסה מדגם עם מחט 18 G ומניחים בתא הליופיליזר. יש להוסיף מגבות נייר לאריזה לפי הצורך.
    4. לתקן תא ליופיליזר ליופיליזר ולהקפיא יבש לילה (לפחות -40 °C (50 °F, 0.135 Torr)
  7. עמודת חילופי cation
    1. דגימות מיובשות resuspend ב עד 400 μL של 8 M urea, פתרון CHAPS 2% (או, אם דגימות איגום, resuspend למקסימום של (400/n) μL, שבו n = מספר הדגימות במאגר הרצוי. השתמש מעט ככל האפשר של פתרון דטרגנט ככל האפשר.
    2. שידוי העמודה חילופי cation (IEX) עם 400 μL של 8 M אוריאה, פתרון CHAPS 2%. ספין במשך 5 דקות ב 2,000 x g בטמפרטורת החדר.
    3. טען 400 μL של דוגמאות לדוגמה/מקבצים במאגר לעמודה IEX. ספין במשך 5 דקות ב 2,000 x g.
    4. לשטוף 3x עם 400 μL של 8 M אוריאה, 2% פתרון CHAPS. ספין במשך 5 דקות ב 2,000 x g בכל פעם.
    5. Elute 3x עם 400 μL של 0.2 M NaCl. ספין במשך 5 דקות ב 2,000 x g כל אחד. זהו שבר הזיקה הנמוכה - ניתן לשמור על כך למטרות בקרת איכות אם תרצה.
    6. Elute 3x עם 400 μL של 2.7 M (16%) NaCl. ספין במשך 5 דקות ב 2,000 x g כל אחד. שבר זה יכיל את הגליקוזאמינוגליקנים המבודדים של עניין - שמור את כל זה!
    7. כדי להתפלת כל שבר מלוטש, להוסיף מתנול עד 80 וולט% ודגרה ב 4 °C (55 °F) לילה. ספין כל דגימה במשך 5 דקות ב 2,000 x g. לשחזר את שאריות מוצק כמו זה מיובש דה מלוח גליקוזאמינוגליקן.
      הערה: לחלופין, דלג על שלב זה והמשיך לשלב 1.8 כדי להדיח את האלאט ללא מתנול.
  8. התפלה וריכוז לדוגמה
    1. במידת הצורך, הבריכה חמקה שברים (מ- 1.7.6) לקבוצות ניסוי מתאימות (למשל, לפי שכפול ביולוגי, או קבוצת ניסוי).
    2. מקם את נפח הדגימה הכולל בעמודת מסנן צנטריפוגלית של 500 μL עם MWCO של 3,000 Da.
    3. ספין במשך 30 דקות ב 14,000 x g בטמפרטורת החדר. חזור על הפעולה לפי הצורך, אם נפח המדגם הרצוי חורג מהקיבולת של עמודת המסנן הצנטריפוגלי.
    4. לשטוף כל עמודה 3x עם 400 μL deionized, מים מסוננים. זרוק את הזרימה. המשך ישירות לשלב 1.9.
  9. עיכול כונדרויטין
    הערה: מטרת שלב זה היא להסיר GAGs לא עניין למשתמש הקצה. במקרה זה, כונדרויתינאז משמש להסרת כונדרויטין. ברקמות המשמשות ליצירת תוצאות מייצגות (נוזל שטיפה סימפונות-כתשי וריאה שלמה), עיכול כונדרויטין סולפט משאיר הפרין סולפט כשרידים העיקריים של GAG. משתמשי קצה ייתכן שיהיה צורך להוסיף צעדי עיכול נוספים בהתאם למטרות הניסיוניות שלהם.
    1. טען 350 μL של חיץ העיכול (50 mM אמוניום אצטט עם 2 mM סידן כלורי מותאם pH 7.0) לעמוד מסנן צנטריפוגלי מבלי לגעת בממברנה.
    2. הוסף 5 μL של כונדרוינאז רקומביננטי ABC.
    3. מניחים את צינור הדגימות לתוך תנור 37 מעלות צלזיוס ודגורה במשך 1 שעה.
    4. הפוך את העמודה והצב לצינורות איסוף המסומנים כראוי. ספין במשך 1 דקות ב 2000 x g.
    5. מחממים דגימות ל 80 °C (55°F) במשך 15-20 דקות כדי לאימת כונדרוינאז ABC.
  10. התפלה וריכוז לדוגמה
    1. במידת הצורך, כונדרויטין הבריכה עיכל דגימות החל מהשלב 1.9.5 לקבוצות ניסוי מתאימות (למשל, לפי שכפול ביולוגי, או קבוצת ניסוי)
    2. מקם את נפח הדגימה הכולל בעמודת מסנן צנטריפוגלית של 500 μL עם MWCO של 3,000 Da.
    3. ספין במשך 30 דקות ב 14,000 x g בטמפרטורת החדר. חזור על הפעולה לפי הצורך אם נפח הדגימה הרצוי חורג מהקיבולת של עמודת המסנן הצנטריפוגלית.
    4. לשטוף כל עמודה 3x עם 400 μL deionized, מים מסוננים. זרוק את הזרימה דרכה.
    5. הפוך מסנן וסיבוב במשך 1 דקות ב 2,000 x גרם בצינורות איסוף טריים, מתויג כראוי. להקפיא ב -80 °C (70 °F) או להמשיך לשלב הבא.
  11. ייבוש
    הערה: בשלב זה, הייבוש נחוץ כך שניתן יהיה תוחם מחדש את הדגימות בכמות הקטנה ביותר האפשרית של מים ומאגר פועל.
    1. או למקם את דגימות מעוכל כונדרויטין בשלב 1.10.5 ישירות ברכז ואקום סיבובי לילה או ליופילי כדלקמן:
    2. להקפיא דגימות ביסודיות או לילה ב -80 °C (80 °F) או על ידי טבילה בחנקן נוזלי.
    3. פירס מכסה מדגם עם מחט 18 G ומניחים בתא הליופיליזר. יש להוסיף מגבות נייר לאריזה לפי הצורך.
    4. לתקן תא ליופיליזר ליופיליזר ולהקפיא יבש לילה (לפחות 40 °C (40 °F, 0.135 Torr)

2. אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד של גליקוזאמינוגליקאנים מבודדים ומטוהרים

  1. הכן פתרונות הדרושים לאלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד (PAGE) מראש(טבלה 1).
    הערה: בחר את אחוז אקרילאמיד של פתרון ג'ל פתרון בהתאם לגודל של glycosaminoglycans צפוי להיות במדגם. 15% מומלץ לפתרון מקטעים גדולים יותר (אורך של יותר מ- 30 פריטים לא-פריטים); 22% עבור קטעים קטנים יותר (<20 יחידות משנה מפורקות).
  2. מקם קלטת ריקה במיכל PAGE. להטיל את הג'ל פתרון כדלקמן: בצינור 15 מ"ל, לערבב 10 מ"ל של פתרון ג'ל פתרון פתרון, 60 μL של 10% אמוניום אסולפט (חייב להיות מוכן טרי), ו 10 μL של TEMED (להוסיף TEMED אחרון). הפוך את הצינור בעדינות 2-3x. השתמש ב- pipette כדי להוסיף במהירות את פתרון 10 מ"ל לעיל לקלטת. כיסוי עם 2 מ"ל של מים מסוננים ומסוננים ומאפשרים לג'ל פתרון לפולימר במשך 30 דקות.
    הערה: פרוטוקול PAGE הבא עבר מיטוב למערכת PAGE אנכית באמצעות קלטות יציקה בעובי של כ- 13.3 x 8.7 ס"מ (רוחב x אורך) בעובי 1.0 מ"מ עם נפח כולל של כ- 12 מ"ל. ניתן להשתמש במערכות קלטות אחרות אך עשויות לדרוש מיטוב על-ידי משתמש הקצה.
  3. לאחר הג'ל לפתרון יש פולימר מלא, להשליך את המים overlaid ולהטיל את ג'ל הערימה כדלקמן: בצינור 15 מ"ל, לערבב 3 מ"ל של פתרון ג'ל לערום, 90 μL של 10% אמוניום אסולפט (חייב להיות מוכן טרי), 3 μL של TEMED (להוסיף TEMED אחרון).
  4. הפוך את הצינור בעדינות 2-3x. השתמש pipette כדי להוסיף במהירות את פתרון ג'ל לערום מעל ג'ל פתרון מוצק; מלא קלטת עד אפס מקום. הוסף מסרק מלא הכלול בגדר. אפשר ג'ל לערום פילמור במשך 30 דקות.
  5. לאחר שהג'ל הפך לפולימרי, ודאו שרצועת הקלטת מוסרת מתחתית הקלטת, והחזירו את הקלטת למכלול הטנק PAGE.
  6. מלאו את התאים העליונים והתחתונים במאגר התא העליון והתחתון, בהתאמה.
  7. ממיסים את הדגימות היבשות בשלב 1.11.4 בנפח המינימלי הדרוש של מים מסוננים דה-יונים (לכל היותר, 50% מנפח הבארות בג'ל PAGE). ערבבו 1:1 עם מאגר טעינה לדוגמה. טען את הדגימות ואת HS אוליגוסכריד "סולמות" (ראה טבלה 1)לתוך הג'ל.
  8. יש להפעיל מראש את הג'ל למשך 5 דקות ב-100 V. לאחר מכן להפעיל את הג'ל ב 200 V במשך 20-25 דקות (עבור 15% ג'ל פתרון polyacrylamide), 40-50 דקות (עבור 18% ג'ל פתרון polyacrylamide), 90-100 דקות (עבור 22% ג'ל לפתרון polyacrylamide).
    הערה: ייתכן שיהיה צורך במיטוב מסוים של זמן הריצה של 200 V. פנול אדום נודד לפני הפרין אוליגוסכרידים כי הם 2 subunits פולימר אורך (כלומר, דרגת פילמור 2, או dp2); כחול ברומופנול נודד לפני dp10-dp14. התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר המתח מוחל כך הלהקה האדומה פנול נודד כמעט, אבל לא ממש, לתחתית הג'ל. התאם את זמן הריצה בהתאם.

3. פרוטוקול כתמי כסף

  1. הכן מראש את כל הפתרונות הדרושים להכתמת כסף(טבלה 2).
    הערה: אין לגעת ישירות בג'ל הדף עד שהוא מוכתם, פותח ומונח בתמיסת עצירה. במקום זאת, לתפעל את הג'ל באמצעות כלי פלסטיק או זכוכית נקיים. טיפול ישיר בג'ל יגרום לעיוותים בהדפסת אצבע וממצאים גלויים אחרים על הג'ל לאחר הכתמתו.
  2. לאחר השלמת הריצה, לפרק את הקסטה ולחלץ ג'ל במיכל נקי ובינוני-גדול מלא במים מסוננים.
    הערה: כדי להימנע מטיפול ישיר בג'ל, השתמש בקצה פיפטה או בחפץ פלסטיק אחר כדי לקלף בעדינות את הג'ל מהקלטת בזמן שהוא שקוע במים. ג'ל עשוי להיות שביר - לטפל בזהירות.
    1. זרוק את המים. מכתימים את הג'ל בתמיסת הכתמים הכחולה האלקית למשך 5 דקות.
    2. השלך כתם כחול אלקיאני. יש לשטוף/לשטוף/לשטוף במהירות 2-3x במים מסוננים ומסוננים עד להסרת רוב תמיסת הכתמים הכחולה האלקית.
    3. אפשר להתיר כתמים במים מסוננים דה-יוניזציה למשך הלילה על רוקר. ודאו שיש נפח רב של מים מסוננים ומסוננים כדי להבטיח שכל כתם שיורית יישטף לחלוטין מהג'ל למשך הלילה.
    4. ג'ל כביסה ב 50% מתנול (40 דקות בסך הכל, שינוי פתרון 2-3x).
    5. לשטוף ג'ל במים מסוננים deionized במשך 30 דקות. להשליך מים ולחזור על 3 זמן נוסף עבור סך של 2 שעות, החלפת המים בכל פעם.
    6. במיכל טרי ונקי, מכתימים את הג'ל במשך 30 דקות בתמיסת כתמי חנקות מכסף.
    7. שטפו/שטפו/שטפו במהירות 2-3x במים מסוננים ומסוננים כדי להסיר באופן מלא את תמיסת כתמי הכסף.
    8. לשטוף במשך 30 דקות במים מסוננים. להשליך מים ולחזור 2x במשך סך של 90 דקות, החלפת אמבט המים בכל פעם.
    9. להשליך מים ולהוסיף פתרון מתפתח.
    10. לאחר פיתוח פתרון מתווסף, בזהירות להתבונן ג'ל ולצפות את המראה של להקות. בהתאם לאיכות הכתם ומסת המדגם שנטען, הפיתוח יכול להימשך בין כמה שניות למספר דקות.
    11. ברגע הרצועות הרצויות גלויים, מיד להשליך פתרון פיתוח לשטוף לזמן קצר עם פתרון להפסיק.
    12. יש להשליך את שטיפת פתרון העצירה ולהחליף בתמיסת עצירה טרייה. אפשר להשרות במשך שעה על רוקר או שייקר.
    13. לשטוף במים מסוננים deionized לילה (עם זאת, הג'ל ניתן לדמיין מיד לאחר להפסיק לשטוף את הפתרון).

תוצאות

כחול אלקי משמש להכתמת GAGs גופרית 10; אות זה מוגבר על ידי שימוש בכתם כסף 11לאחר מכן . איור 1 מספק הדגמה חזותית של תהליך פיתוח כתמי הכסף. כפי שהוכח, האות הכחול האלקי המייצג GAGs מופרדים על ידי אלקטרופורזה מוגבר כמו הסוכן המתפתח חודר ג'ל polyacrylamide. בדרך כלל, התה...

Discussion

לגאגים יש תפקיד מרכזי בתהליכים ביולוגיים רבים ומגוונים. אחת הפונקציות העיקריות של GAGs גופרתי (כגון HS ו- CS) היא לקיים אינטראקציה עם ליגנדים ולאגד, אשר יכול לשנות פונקציות איתות במורד הזרם. גורם חשוב של זיקה מחייבת GAG לליגנדים מודעים הוא אורך שרשרת הפולימר GAG 8,9

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL ו- EPS)

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Accuspin Micro17 benchtop microcentrifugethermoFisher Scientific13-100-675Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate
Acrylamide (solid)thermoFisher ScientificBP170-100Electrophoresis grade
Actinase ESigma AldrichP5147Protease mix from S. griseus
Alcian Blue 8GX (solid)thermoFisher ScientificAC400460100
Ammonium acetate (solid)thermoFisher ScientificA639-500Molecular biology grade
Ammonium hydroxide (liquid)thermoFisher ScientificA669S-500certified ACS
Ammonium persulfate (solid)thermoFisher ScientificBP179-25electrophoresis grade
Barnstead GenPure Pro Water Purification SystemThermoFisher Scientific10-451-217PKGAny water deionizing/ purification system is an acceptable substitute
Boric acid (solid)thermoFisher ScientificA73-500Molecular biology grade
Bromphenol blue (solid)thermoFisher ScientificB392-5
Calcium acetate (solid)ThermoFisher Scientific18-609-432Molecular biology grade
Calcium chloride (solid)ThermoFisher ScientificAC349610250Molecular biology grade
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)ThermoFisher Scientific28299
Chondroitinase ABCSigma AldrichC3667
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)Bio-Rad3459901Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)Bio-Rad1656019any comparable vertical gel PAGE system will work)
Dichloromethane (liquid)thermoFisher ScientificAC610931000certified ACS
EDTA disodium salt (solid)thermoFisher Scientific02-002-786Molecular biology grade
Glacial acetic acid (liquid)thermoFisher ScientificA35-500Certified ACS
Glycine (solid)thermoFisher ScientificG48-500Electrophoresis grade
Heparanase I/IIISigma AldrichH3917From Flavobacterium heparinum
Heparin derived decasaccharide (dp10)galen scientificHO10
Heparin derived hexasaccharde (dp6)Galen scientificHO06
Heparin derived oligosaccharide (dp20)galen scientificHO20
Hydrochloric acid (liquid)thermoFisher ScientificA466-250
LyophilizerLabconco7752020Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator
Methanol (liquid)thermoFisher ScientificA412-500Certified ACS
Molecular Imager Gel Doc XR SystemBio-Rad170-8170Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid)thermoFisher ScientificBP171-25Electrophoresis grade
Phenol red (solid)thermoFisher ScientificP74-10Free acid
Q Mini H Ion Exchange ColumnVivapureVS-IX01QH24Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11
Silver nitrate (solid)thermoFisher ScientificS181-25certified ACS
Sodium Acetate (solid)ThermoFisher ScientificS210-500Molecular biology grade
Sodium chloride (solid)thermoFisher ScientificS271-500Molecular biology grade
Sodium hydroxide (solid)thermoFisher ScientificS392-212
Sucrose (solid)thermoFisher ScientificBP220-1Molecular biology grade
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine)thermoFisher ScientificBP150-20Electrophoresis grade
Tris base (solid)thermoFisher ScientificBP152-500Molecular biology grade
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoffAmiconUFC500324Larger volume filter units may be used, depending on sample size. 
Urea (solid)ThermoFisher Scientific29700
Vacufuge PlusEppendorf22820001Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volumethermoFisher Scientific569-0020Alternative volumes and filter materials acceptable

References

  1. LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
  2. Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
  3. Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
  4. Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
  5. Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
  6. Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
  7. Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
  8. Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
  9. Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
  10. Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
  11. Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
  12. Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
  13. Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
  14. Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
  15. Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
  16. Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
  17. Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
  18. Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
  19. Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved