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摘要

本报告描述了从生物样本中分离和净化硫化甘油（GAGs）的技术，以及一种聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，以接近其大小。GAG通过静电与蛋白质的相互作用，促进组织结构并影响信号过程。GAG 聚合物长度有助于它们对认知配体的结合亲和力。

摘要

硫化甘油（GAGs），如硫酸肝（HS）和硫酸软骨蛋白（CS），在生物体中随处可见，在各种基本生物结构和过程中起着至关重要的作用。作为聚合物，GAG 作为聚氨酯混合物存在，其中含有聚糖链，范围从 4000 Da 到 40，000 DA 不等。在这些链条中存在着硫化领域，赋予负电荷模式，促进与认知蛋白配体的正电荷残留物的相互作用。GAG 的硫化域必须足够长度，以便进行这些静电相互作用。要了解GAG在生物组织中的功能，研究者必须能够分离、净化和测量GAG的大小。本报告描述了一种实用且多功能的聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，该技术可利用该技术解决从各种生物组织类型中分离出来的 GAG 之间的相对较小的尺寸差异。

引言

糖氨糖（GAGs）是线性多糖的多样化家族，是生物体中无处不在的元素，有助于许多基本的生理过程1。硫酸肝素 （HS） 和软骨素硫酸盐 （CS） 等 GAG 可能会在多糖链的不同位置硫化，从而提供负电荷的地理域。这些GAG，当系在细胞表面的蛋白质称为蛋白糖，投射到细胞外空间，并结合识别配体，允许调节两个 cis-（利甘附着在同一细胞）和跨（利甘附着在相邻细胞）信号过程2。此外，GAG还作为结构元素在组织中发挥关键作用，如球状地下室膜3、血管内皮糖碱4和肺上皮糖糖6，以及结缔组织（如软骨6）。

GAG多糖链的长度因其生物背景而有很大差异，可以通过高度复杂的酶调控系统7动态延长、切割和修改。重要的是，GAG聚合物链的长度大大有助于它们对配体的结合亲和力，并随后对它们的生物功能8，9。因此，确定内源性GAG的功能需要对其大小进行欣赏。不幸的是，与蛋白质和核酸不同，很少有现成的技术来检测和测量GAG，这在历史上导致对这一多样化多糖家族的生物作用的调查相对有限。

本文描述了如何从大多数生物组织中分离和净化GAG，并描述了如何使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）来评估具有相当程度特异性的分离聚合物的长度。与其他高度复杂的（通常基于质谱）的糖电方法不同，这种方法可以使用标准的实验室设备和技术。因此，这种实际方法可以扩大调查人员确定本地GAG的生物作用及其与上下文重要配体的相互作用的能力。

研究方案

根据科罗拉多大学机构动物护理和使用委员会批准的协议，本协议中分析的所有生物样本均来自小鼠。

1. 肝硫酸盐隔离

  1. 组织样本的脱皮
    注:脱脂是富含脂肪组织的可选步骤。
    1. 制作甲醇和二氯甲烷的1:1混合物。每个样品准备约 500 μL;较大的组织块可能需要高达 1 mL。
    2. 将每个组织样本放入一个小玻璃容器中，盖上盖子，以进行熟食。
      注:样本质量可能因感兴趣的组织和实验需求而异。50 毫克或更少通常足以达到足够的 GAG 产量，但最终用户可能需要进行一些优化。
    3. 在每个玻璃容器中加入 500 微升甲醇:二氯甲烷溶液并混合。确保所有固体组织样本完全淹没在溶剂中。
      注:使用血清移液器或塑料锥形管混合和处理甲醇/二氯甲烷溶液:其他塑料可能会溶解。
    4. 将样品放在摇床（固定机架）的化学烟气罩中，轻轻搅拌1小时。
    5. 在 4°C 下搅拌样品，在 17，000 x g 下混合和离心机 5 分钟。
    6. 小心地移除有机溶剂分数（超高溶剂）。这是脂质分数 - 它不包含 GAG，可以丢弃。
      注意:尽量不要打扰组织，因为小块可能会丢失。最好将一些有机层留在样品容器中，而不是冒着样品丢失的风险。
    7. 将玻璃容器的盖子打开，让它在引擎盖中蒸发过夜。更改下一步的管子，因为这些管子无法继续加工。
    8. 一旦溶剂混合物完全蒸发，继续机械分解（如果残留样品为>50毫克）或Actinase E消化（<50毫克）。
  2. 固体组织的机械分解（可选;用于较大的组织样本）
    注意:大多数较小的固体组织（约50毫克或更少）应在消化过程中完全溶解。但是，较大的样品需要机械分解。
    1. 将样品放入适当尺寸的聚丙烯管中，并将封闭的聚丙烯管放入液氮中，从而冻结感兴趣的样品。让样品冻结，直到完全固体。
    2. 使用干净的砂浆和刺，将冷冻样品研磨成粉末状的稠度。
    3. 直接进行行动酶 E 消化（第 1.4 步）。
  3. 样品脱盐和浓度
    注:这是一个可选步骤，仅需要稀释液体组织样本（例如支气管-藻类厕所液（BALF）或等离子体）。
    1. 将液体样本池入适当的实验组（例如，通过生物复制或实验组）
    2. 将总样本量放入 500 μL 离心滤芯柱中，分子重量截止 （MWCO） 为 3，000 Da。
    3. 在室温下旋转 30 分钟，温度为 14，000 x g。 如果所需的样品量超过离心滤芯列的容量，则根据需要重复重复。
    4. 用 400 μL 的去离子过滤水清洗每根柱子 3 倍。丢弃流过。
    5. 倒置过滤器，在 2，000 x g 的新鲜、标记适当的收集管中旋转 1 分钟。冻结在 -80 °C 或继续下一步。
  4. 行动酶 E 消化
    注意:此步骤需要消化并最终从样品中去除蛋白质污染物。
    1. 混合样品 1:1 与重组的Actinase E到所需的浓度为10毫克/毫升。添加适当的体积10倍消化缓冲浓缩物。期望最终浓度:0.005 M醋酸钙和0.01M醋酸钠，pH 7.5。例如:190 微升液体样品，190 微升 20 毫克/毫克 Actinase E，20 微升 0.05 M 醋酸钙，0.1 M 醋酸钠。
    2. 轻轻搅拌样品混合，然后在 55 °C 下消化 48-72 小时（整个组织最多 7 天）。
    3. 加热至 80 °C 15-20 分钟，加热灭活 Actinase E。
    4. 将样品冻结在 -80 °C 或继续踩 1.5。
  5. 样品脱盐和浓度
    注:如果在生物样品中预期感兴趣的GAG质量较低，或者如果可取的消耗品试剂（即离心滤柱）的保存是可取的，则可以将样品集中在一起，以产生每个实验组的单一浓缩物（例如，通过生物复制或实验组）。
    1. 将总样品量放入 500 μL 离心滤芯中，MWCO 为 3，000 Da。
    2. 在室温下旋转 30 分钟，温度为 14，000 x g。 如果所需的样品体积超过离心滤芯的容量，则根据需要重复重复。
    3. 用 400 μL 去离子过滤水清洗每根柱子 3 倍。丢弃流过。
    4. 倒置滤镜，在 2，000 x g 的新鲜、标签适当的收集管（通常包含离心滤芯列中）中旋转 1 分钟。冻结在 -80 °C 或继续下一步。
  6. 干燥
    1. 要么将第 1.5.5 步的溶解样品放在旋转真空浓缩器中过夜，要么将下面详细描述的样品进行放牧。
    2. 在 -80 °C 或浸入液氮中彻底冷冻样品。
    3. 皮尔斯样品盖与18G针，并放置在嗜血室。根据需要添加纸巾进行包装。
    4. 将嗜血室修复为嗜血剂，并冷冻干燥过夜（至少 -40 °C，0.135 托尔）
  7. Cation 交换列
    1. 在高达 400 μL 的 8 M 尿素、2% CHAPS 溶液中重新使用干燥样品（或者，如果将样品集中起来，则重新吸收到最大 （400/n） μL，其中 n = 所需池中的样本数量。尽可能少地使用洗涤剂溶液。
    2. 用 400 μL 的 8 M 尿素、2% 的 CHAPS 解决方案等价放离子交换 （IEX） 列。在室温下旋转 5 分钟，2，000 x g。
    3. 将 400 μL 的样品/池样本加载到 IEX 列中。旋转5分钟，2000 x g。
    4. 用 400 微升 8 M 尿素洗 3 倍， 2% CHAPS 溶液。每次旋转 5 分钟，2，000 x g。
    5. Elute 3x 与 400 μL 的 0.2 M Nacl 。旋转 5 分钟，每克 2，000 x 克 。这是低亲和力分数 - 如果需要，可以保留用于质量控制目的。
    6. Elute 3x 与 400 μL 的 2.7 M （16%） Nacl 。旋转 5 分钟，每克 2，000 x 克 。这个分数将包含感兴趣的孤立的糖 - 保留这一切！
    7. 要干燥每个脱盐分数，加入甲醇高达80伏，并在4°C的夜间孵育。以 2，000 x g旋转每个样品 5 分钟。恢复固体残留物，因为这是干燥的去盐糖。
      注:或者，跳过此步骤，继续第 1.8 步，在没有甲醇的情况下脱盐。
  8. 样品脱盐和浓度
    1. 如有必要，将分数（从 1.7.6）池池到适当的实验组（例如，通过生物复制或实验组）。
    2. 将总样品量放入 500 μL 离心滤芯中，MWCO 为 3，000 Da。
    3. 在室温下旋转 30 分钟，温度为 14，000 x g。 如果所需的样品体积超过离心滤芯的容量，则根据需要重复重复。
    4. 用 400 μL 去离子过滤水清洗每根柱子 3 倍。丢弃流过。直接进入第 1.9 步。
  9. 软骨素消化
    注:此步骤的目的是删除最终用户不感兴趣的 GAG。在这种情况下，软骨素酶用于去除软骨素。在用于生成 代表性结果 （支气管-藻类厕所液和整个肺）的组织中，消化硫酸软骨素将硫酸肝作为主要残留GAG。最终用户可能需要根据其实验目标添加额外的消化步骤。
    1. 将 350 μL 的消化缓冲器（50 mM 醋酸铵，2 mM 氯化钙调整为 pH 7.0）装载到离心滤芯柱上，而不接触膜。
    2. 添加 5 μL 重组软骨素 ABC。
    3. 将样品管放入 37 °C 烤箱中，孵育 1 小时。
    4. 将柱子翻过来，放入标记适当的收集管中。旋转1分钟在2000×g。
    5. 将样品加热至 80 °C，15-20 分钟，使软骨酶 ABC 失活。
  10. 样品脱盐和浓度
    1. 如有必要，池软骨素将第1.9.5步的样本消化成适当的实验组（例如，通过生物复制或实验组）
    2. 将总样品量放入 500 μL 离心滤芯柱中，MWCO 为 3，000 Da。
    3. 在室温下旋转 30 分钟，温度为 14，000 x g。 如果所需的样品量超过离心滤芯的容量，则根据需要重复重复。
    4. 用 400 μL 去离子过滤水清洗每根柱子 3 倍。丢弃流过。
    5. 反向过滤器和旋转 1 分钟，在 2，000 x g 新鲜，适当标记的收集管。冻结在 -80 °C 或继续下一步。
  11. 干燥
    注:在此步骤中，需要干燥，以便样品可以在尽可能少的水量和运行缓冲器中重新使用。
    1. 要么将从第 1.10.5 步中消化的软骨素直接放在旋转真空浓缩器中过夜，要么将嗜血症如下:
    2. 在 -80 °C 或浸入液氮中彻底冷冻样品。
    3. 皮尔斯样品盖与18G针，并放置在嗜血室。根据需要添加纸巾进行包装。
    4. 将嗜血室修复为嗜血剂，并冷冻干燥过夜（至少 40 °C，0.135 托尔）

2. 分离和纯化糖氨糖的聚丙烯酰胺凝胶电泳

  1. 提前准备聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE） 所需的解决方案 （表 1）。
    注意:根据样品中预期的糖甘油的大小，选择溶解凝胶溶液的丙烯酰胺百分比。建议 15% 用于解决较大的碎片（长度大于 30 个脱糖子单位）;22% 用于较小的碎片（长度为 <20 个脱糖子单位）。
  2. 将空盒式磁带放入 PAGE 储罐中。将溶解凝胶铸造如下:在 15 mL 管中，混合 10 mL 的溶胶溶液、60 微升 10% 的说服铵（必须新鲜准备）和 10 微升的 TEMED（最后添加 TEMED）。轻轻倒置管子 2-3 倍。使用移液器快速将上述 10 mL 溶液添加到盒式磁带中。覆盖 2 mL 的去离子、过滤水，让解析凝胶聚合 30 分钟。
    注:使用总体积约为 12mL 的 13.3 x 8.7 厘米（宽度 x 长度）1.0 毫米厚的铸造盒式磁带，为垂直 PAGE 系统优化了以下 PAGE 协议。其他盒式磁带系统可以使用，但可能需要最终用户进行优化。
  3. 溶解凝胶完全聚合后，丢弃覆盖水并投下堆叠凝胶如下:在 15 mL 管中，混合 3 mL 的堆叠凝胶溶液，90 μL 的 10% 氨化汞说服酸盐（必须新鲜准备），3 μL 的 TEMED（最后添加 TEMED）。
  4. 轻轻倒置管子 2-3 倍。使用移液器快速将堆叠凝胶溶液添加到凝固的溶胶上;填充盒式磁带到边缘。完全插入梳子包含与设置。允许堆叠凝胶聚合 30 分钟。
  5. 凝胶聚合后，确保磁带条从盒式磁带底部取出，并将盒式磁带放回 PAGE 罐装配件中。
  6. 分别用上室和下室缓冲填充上室和下腔。
  7. 将第 1.11.4 步的干燥样品溶解在最小必要量的去离子、过滤水中（最多是 PAGE 凝胶中井体积的 50%）。将 1:1 与样品加载缓冲器混合。将样品和 HS 寡糖"梯子"（参见 表 1）加载到凝胶中。
  8. 在 100 V 下预运行凝胶 5 分钟。然后在 200 V 下运行凝胶 20-25 分钟（用于 15% 聚丙烯酰胺解析凝胶）、40-50 分钟（用于 18% 聚丙烯酰胺解析凝胶）、90-100 分钟（用于 22% 聚丙烯酰胺解析凝胶）。
    注意:可能需要对 200 V 运行时间进行一些优化。苯酚红色在长度为 2 聚合物亚单位的肝素寡糖之前迁移（即聚合程度 2 或 dp2）:溴酚蓝色在 dp10 - dp14 之前迁移。当电压施加时，将取得最佳效果，使酚红带几乎（但不完全）迁移到凝胶底部。相应地调整运行时间。

3. 银染色协议

  1. 提前准备银渍所需的所有解决方案（表2）。
    注意:在 PAGE 凝胶被染色、开发并放置在停止溶液中之前，不要直接触摸它。相反，使用清洁的塑料或玻璃工具操纵凝胶。直接处理凝胶会导致手指打印变形和污渍后凝胶上的其他可见的伪影。
  2. 运行完成后，拆解盒式磁带，在装满去离子化过滤水的清洁中型容器中提取凝胶。
    注意:为了避免直接处理凝胶，请使用移液器尖端或其他塑料物体在浸入水中时轻轻剥去胶水。凝胶可能很脆弱 - 小心处理。
    1. 丢弃水。在阿尔西安蓝色染色溶液中涂上凝胶 5 分钟。
    2. 丢弃阿尔西亚蓝色污渍。快速冲洗/清洗 2-3 倍，用去离子化的过滤水，直到大部分阿尔西亚蓝色染色液被移除。
    3. 允许在摇杆上过夜去污。确保有充足的去离子化，过滤的水，以确保任何残留的污渍被完全冲出凝胶过夜。
    4. 在 50% 甲醇中清洗凝胶（总计 40 分钟，更改溶液 2-3 倍）。
    5. 在去离子过滤水中清洗凝胶 30 分钟。丢弃水并重复 3 次，总共 2 小时，每次更换水。
    6. 在新鲜、干净的容器中，将凝胶涂在硝酸银染色溶液中 30 分钟。
    7. 快速冲洗/清洗 2-3 倍的去离子、过滤水，以完全去除银渍溶液。
    8. 在去离子过滤水中洗30分钟。丢弃水并重复 2 次，总共 90 分钟，每次更换水浴。
    9. 丢弃水并添加开发解决方案。
    10. 添加开发解决方案后，仔细观察凝胶并注意带的外观。根据污渍的质量和加载样品的质量，开发可能需要几秒钟到几分钟的时间。
    11. 一旦所需的频段可见，立即丢弃开发的解决方案，并短暂地使用停止溶液进行洗涤。
    12. 丢弃停止溶液洗涤，代之以新的停止溶液。允许在摇床或摇床上浸泡 1 小时。
    13. 在去离子的过滤水中清洗过夜（但是，凝胶可以在停止溶液洗涤后立即成像）。

结果

阿尔西安蓝用于染色硫化GAG 10:此信号通过使用随后的银色污渍 11放大。 图1 提供了银染色开发过程的视觉演示。如前所示，当开发剂穿透聚丙烯酰胺凝胶时，代表电泳分离的 GAG 的阿尔西亚蓝色信号被放大。通常，开发过程将减少银色和阿尔西亚蓝色染色的GAG在密度依赖的方式，每个频段的边缘减少第一，而更密集的染色区域在中心将染?...

讨论

GAG 在许多不同的生物过程中发挥着核心作用。硫化 GAG（如 HS 和 CS）的主要功能之一是与配体交互并绑定，这可以改变下游信号功能。GAG 与认知配体结合亲和力的一个重要决定因素是 GAG 聚合物链的长度 8、9、14。 因此，研究人员必须能够合理精确地定义从感兴趣的生物样本中分离出来的GAG链的大小。为了实用，该技术应能够...

披露声明

作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。

致谢

这项工作由F31 HL143873-01（WBL），R01 HL125371（RJL和EPS）资助

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Accuspin Micro17 benchtop microcentrifugethermoFisher Scientific13-100-675Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate
Acrylamide (solid)thermoFisher ScientificBP170-100Electrophoresis grade
Actinase ESigma AldrichP5147Protease mix from S. griseus
Alcian Blue 8GX (solid)thermoFisher ScientificAC400460100
Ammonium acetate (solid)thermoFisher ScientificA639-500Molecular biology grade
Ammonium hydroxide (liquid)thermoFisher ScientificA669S-500certified ACS
Ammonium persulfate (solid)thermoFisher ScientificBP179-25electrophoresis grade
Barnstead GenPure Pro Water Purification SystemThermoFisher Scientific10-451-217PKGAny water deionizing/ purification system is an acceptable substitute
Boric acid (solid)thermoFisher ScientificA73-500Molecular biology grade
Bromphenol blue (solid)thermoFisher ScientificB392-5
Calcium acetate (solid)ThermoFisher Scientific18-609-432Molecular biology grade
Calcium chloride (solid)ThermoFisher ScientificAC349610250Molecular biology grade
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)ThermoFisher Scientific28299
Chondroitinase ABCSigma AldrichC3667
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)Bio-Rad3459901Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)Bio-Rad1656019any comparable vertical gel PAGE system will work)
Dichloromethane (liquid)thermoFisher ScientificAC610931000certified ACS
EDTA disodium salt (solid)thermoFisher Scientific02-002-786Molecular biology grade
Glacial acetic acid (liquid)thermoFisher ScientificA35-500Certified ACS
Glycine (solid)thermoFisher ScientificG48-500Electrophoresis grade
Heparanase I/IIISigma AldrichH3917From Flavobacterium heparinum
Heparin derived decasaccharide (dp10)galen scientificHO10
Heparin derived hexasaccharde (dp6)Galen scientificHO06
Heparin derived oligosaccharide (dp20)galen scientificHO20
Hydrochloric acid (liquid)thermoFisher ScientificA466-250
LyophilizerLabconco7752020Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator
Methanol (liquid)thermoFisher ScientificA412-500Certified ACS
Molecular Imager Gel Doc XR SystemBio-Rad170-8170Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid)thermoFisher ScientificBP171-25Electrophoresis grade
Phenol red (solid)thermoFisher ScientificP74-10Free acid
Q Mini H Ion Exchange ColumnVivapureVS-IX01QH24Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11
Silver nitrate (solid)thermoFisher ScientificS181-25certified ACS
Sodium Acetate (solid)ThermoFisher ScientificS210-500Molecular biology grade
Sodium chloride (solid)thermoFisher ScientificS271-500Molecular biology grade
Sodium hydroxide (solid)thermoFisher ScientificS392-212
Sucrose (solid)thermoFisher ScientificBP220-1Molecular biology grade
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine)thermoFisher ScientificBP150-20Electrophoresis grade
Tris base (solid)thermoFisher ScientificBP152-500Molecular biology grade
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoffAmiconUFC500324Larger volume filter units may be used, depending on sample size. 
Urea (solid)ThermoFisher Scientific29700
Vacufuge PlusEppendorf22820001Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volumethermoFisher Scientific569-0020Alternative volumes and filter materials acceptable

参考文献

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