Détection des glycosaminoglycanes par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et coloration à l’argent

Résumé

Ce rapport décrit des techniques pour isoler et purifier les glycosaminoglycanes sulfatés (GAN) à partir d’échantillons biologiques et une approche d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour approximer leur taille. Les GG contribuent à la structure des tissus et influencent les processus de signalisation via l’interaction électrostatique avec les protéines. La longueur du polymère GAG contribue à leur affinité de liaison pour les ligands apparentés.

Résumé

Les glycosaminoglycanes sulfatés (GAG) tels que le sulfate d’héparane (HS) et le sulfate de chondroïtine (CS) sont omniprésents dans les organismes vivants et jouent un rôle essentiel dans une variété de structures et de processus biologiques de base. En tant que polymères, les GAG existent sous la forme d’un mélange polydispersé contenant des chaînes de polysaccharides pouvant aller de 4000 Da à plus de 40 000 Da. Au sein de ces chaînes existent des domaines de sulfatation, conférant un modèle de charge négative qui facilite l’interaction avec les résidus chargés positivement de ligands protéiques apparentés. Les domaines sulfatés des GAG doivent être d’une longueur suffisante pour permettre ces interactions électrostatiques. Pour comprendre la fonction des GG dans les tissus biologiques, l’investigateur doit être en mesure d’isoler, de purifier et de mesurer la taille des GG. Ce rapport décrit une technique pratique et polyvalente basée sur l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide qui peut être exploitée pour résoudre des différences de taille relativement faibles entre les GAN isolés à partir d’une variété de types de tissus biologiques.

Introduction

Les glycosaminoglycanes (GAG) sont une famille diversifiée de polysaccharides linéaires qui sont un élément omniprésent dans les organismes vivants et contribuent à de nombreux processus physiologiques de base¹. Les GIG tels que le sulfate d’héparane (HS) et le sulfate de chondroïtine (CS) peuvent être sulfatés à des positions distinctes le long de la chaîne polysaccharidique, conférant des domaines géographiques de charge négative. Ces GAG, lorsqu’ils sont attachés à des protéines de surface cellulaire connues sous le nom de protéoglycanes, se projettent dans l’espace extracellulaire et se lient à des ligands apparentés, permettant la régulation des processus de signalisation cis- (ligand attaché à la même cellule) et trans- (ligand attaché à la cellule voisine)². En outre, les GGA jouent également un rôle essentiel en tant qu’éléments structurels dans des tissus tels que la membrane basale glomérulaire^3,le glycocalyx endothélial vasculaire⁴ et le glycocalyx épithélial pulmonaire^5,et dans les tissus conjonctifs tels que le cartilage^6.

La longueur des chaînes polysaccharidiques GAG varie considérablement en fonction de son contexte biologique et peut être allongée dynamiquement, clivée et modifiée par un système de régulation enzymatique très complexe^7. Il est important de savoir que la longueur des chaînes polymères GAG contribue de manière substantielle à leur affinité de liaison pour les ligands et, par la suite, à leur fonction biologique^8,9. Pour cette raison, la détermination de la fonction d’un GAG endogène nécessite une appréciation de sa taille. Malheureusement, contrairement aux protéines et aux acides nucléiques, il existe très peu de techniques facilement disponibles pour détecter et mesurer les GAG, ce qui a historiquement donné lieu à des recherches relativement limitées sur les rôles biologiques de cette famille diversifiée de polysaccharides.

Cet article décrit comment isoler et purifier les GG de la plupart des tissus biologiques et, également, décrit comment utiliser l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) pour évaluer la longueur des polymères isolés avec un certain degré de spécificité. Contrairement à d’autres approches glycomiques très complexes (et souvent basées sur la spectrométrie de masse), cette méthode peut être utilisée à l’aide d’équipements et de techniques de laboratoire standard. Cette approche pratique peut donc élargir la capacité des chercheurs à déterminer le rôle biologique des GG natifs et leur interaction avec des ligands contextuellement importants.

Protocole

Tous les échantillons biologiques analysés dans le cadre de ce protocole ont été obtenus sur des souris, selon des protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Colorado.

1. Isolement du sulfate d’héparane

1. Délipidation d’échantillons de tissus
   REMARQUE: La délipidation est une étape facultative pour les tissus riches en graisse.
   1. Faire un mélange 1:1 de méthanol et de dichlorométhane. Préparer environ 500 μL par échantillon; de plus gros morceaux de tissu peuvent nécessiter jusqu’à 1 mL.
   2. Placez chaque échantillon de tissu dans un petit récipient en verre avec un couvercle pour la délipidation.
      REMARQUE : La masse de l’échantillon peut varier selon les tissus d’intérêt et les besoins expérimentaux. 50 mg ou moins sont généralement suffisants pour un rendement GAG adéquat, mais une certaine optimisation peut être requise par l’utilisateur final.
   3. Ajouter 500 μL de la solution méthanol:dichlorométhane dans chaque récipient en verre et mélanger. Assurez-vous que tous les échantillons de tissus solides sont complètement immergés dans le solvant.
      REMARQUE: Utilisez des pipettes sérologiques ou des tubes coniques en plastique pour mélanger et manipuler la solution de méthanol / dichlorométhane; d’autres plastiques peuvent se dissoudre.
   4. Placer les échantillons sur un agitateur (dans une grille sécurisée) dans une hotte à fumée chimique et agiter doucement pendant 1 h.
   5. Agiter les échantillons pour les mélanger et centrifuger à 17 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
   6. Pipettez soigneusement la fraction de solvant organique (surnageant). C’est la fraction lipidique - elle ne contient pas de GAG et peut être jetée.
      REMARQUE: Essayez de ne pas déranger le tissu car de petits morceaux pourraient être perdus. Il est préférable de laisser une partie de la couche organique dans le récipient de l’échantillon, plutôt que de risquer la perte de l’échantillon.
   7. Laissez le couvercle du récipient en verre ouvert et laissez-le s’évaporer pendant la nuit dans la hotte. Changez le tube pour l’étape suivante car ces tubes ne survivront pas à un traitement ultérieur.
   8. Une fois que le mélange de solvants s’est complètement évaporé, procéder à la désintégration mécanique (si l’échantillon résiduel est >50 mg) ou à la digestion de l’actinase E (< 50 mg).
2. Désintégration mécanique des tissus solides (facultatif; pour les échantillons de tissus plus grands)
   REMARQUE: La plupart des petits morceaux de tissu solide (environ 50 mg ou moins) devraient se dissoudre complètement pendant l’étape de digestion. Cependant, les échantillons plus grands nécessiteront une désintégration mécanique.
   1. Congeler les échantillons d’intérêt en les plaçant dans un tube en polypropylène de taille appropriée et en plaçant le tube fermé dans de l’azote liquide. Laissez l’échantillon geler jusqu’à ce qu’il soit complètement solide.
   2. À l’aide d’un mortier et d’un pilon propres, broyer les échantillons congelés en une consistance semblable à de la poudre.
   3. Passez directement à la digestion de l’Actinase E (étape 1.4).
3. Dessalage et concentration des échantillons
   REMARQUE: Il s’agit d’une étape facultative et requise uniquement pour les échantillons de tissu liquide dilué (par exemple, le liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF) ou le plasma).
   1. Regrouper les échantillons liquides en groupes expérimentaux appropriés (p. ex., par réplique biologique ou groupe expérimental)
   2. Placer le volume total de l’échantillon dans une colonne filtrante centrifuge de 500 μL avec un seuil de poids moléculaire (MWCO) de 3 000 Da.
   3. Tourner pendant 30 min à 14 000 x g à température ambiante. Répétez l’opération au besoin si le volume d’échantillon souhaité dépasse la capacité de la colonne de filtre centrifuge.
   4. Lavez chaque colonne 3x avec 400 μL d’eau déionisée et filtrée. Jetez le flux à travers.
   5. Inverser le filtre et tourner pendant 1 min à 2 000 x g dans des tubes de collecte frais et correctement étiquetés. Congelez à -80 °C ou passez à l’étape suivante.
4. Digestion de l’actinase E
   REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour digérer et finalement éliminer les contaminants protéiques de votre échantillon.
   1. Mélanger les échantillons 1:1 avec l’Actinase E recombinante à une concentration souhaitée de 10 mg/mL. Ajouter le volume approprié de concentré tampon de digestion 10x. Concentration finale souhaitée : 0,005 M d’acétate de calcium et 0,01 M d’acétate de sodium, pH 7,5. Par exemple : 190 μL d’échantillon liquide, 190 μL de 20 mg/mL d’actinase E, 20 μL d’acétate de calcium de 0,05 M, 0,1 M d’acétate de sodium.
   2. Agiter doucement les échantillons pour les mélanger, puis les digérer pendant 48 à 72 h à 55 °C (jusqu’à 7 jours pour les tissus entiers).
   3. Chauffer à 80 °C pendant 15-20 min pour inactiver l’Actinase E.
   4. Congeler l’échantillon à -80 °C ou continuer à l’étape 1.5.
5. Dessalage et concentration des échantillons
   REMARQUE : Si l’échantillon biologique prévoit une faible masse du GAG d’intérêt ou si la conservation de réactifs consommables (c.-à-d. colonnes filtrantes centrifuges) est souhaitable, les échantillons peuvent être regroupés pour produire un seul concentré par groupe expérimental (p. ex., par réplique biologique ou groupe expérimental).
   1. Placer le volume total de l’échantillon dans une colonne filtrante centrifuge de 500 μL avec un MWCO de 3 000 Da.
   2. Tourner pendant 30 min à 14 000 x g à température ambiante. Répétez l’opération si nécessaire si le volume d’échantillon souhaité dépasse la capacité de la colonne de filtre centrifuge.
   3. Lavez chaque colonne 3x avec 400 μL d’eau désionisée et filtrée. Jetez le flux à travers.
   4. Inverser le filtre et filer pendant 1 min à 2 000 x g dans des tubes de collecte frais et correctement étiquetés (généralement inclus avec les colonnes filtrantes centrifuges). Congelez à -80 °C ou passez à l’étape suivante.
6. Dessiccation
   1. Placez les échantillons dissous de l’étape 1.5.5 dans un concentrateur à vide rotatif pendant la nuit ou lyophilisez les échantillons comme indiqué ci-dessous.
   2. Congeler soigneusement les échantillons pendant la nuit à -80 °C ou en trempant dans de l’azote liquide.
   3. Percer les couvercles d’échantillon avec une aiguille de 18 G et placer dans la chambre de lyophilisation. Ajoutez des serviettes en papier pour l’emballage au besoin.
   4. Fixer la chambre du lyophilisateur au lyophilisateur et lyophiliser pendant la nuit (au moins -40 °C, 0,135 Torr)
7. Colonne d’échange de cations
   1. Remise en caisse des échantillons desséchés jusqu’à 400 μL d’urée 8 M, solution CHAPS à 2 % (ou, si l’on remettez en commun les échantillons, remettez en caisse jusqu’à un maximum de (400/n) μL, où n = le nombre d’échantillons dans le pool souhaité. Utilisez le moins possible de la solution détergente.
   2. Équilibrer la colonne d’échange cationiques (IEX) avec 400 μL d’urée 8 M, solution CHAPS à 2%. Tourner pendant 5 min à 2 000 x g à température ambiante.
   3. Chargez 400 μL d’échantillons/échantillons groupés dans la colonne IEX. Tourner pendant 5 min à 2 000 x g.
   4. Laver 3x avec 400 μL d’urée 8 M, solution CHAPS à 2%. Tourner pendant 5 min à 2 000 x g à chaque fois.
   5. Elute 3x avec 400 μL de 0,2 M NaCl. Tourner pendant 5 min à 2 000 x g chacun. Il s’agit de la fraction de faible affinité - elle peut être conservée à des fins de contrôle de la qualité si vous le souhaitez.
   6. Elute 3x avec 400 μL de 2,7 M (16%) NaCl. Tourner pendant 5 min à 2 000 x g chacun. Cette fraction contiendra les glycosaminoglycanes isolés d’intérêt - gardez-le tous!
   7. Pour dessaler chaque fraction éluée, ajouter du méthanol jusqu’à 80 % vol. et incuber à 4 °C pendant la nuit. Faire tourner chaque échantillon pendant 5 min à 2 000 x g. Récupérez le résidu solide car il s’agit de glycosaminoglycane desséché et desserré.
      REMARQUE: Vous pouvez également sauter cette étape et passer à l’étape 1.8 pour déstenter l’éluat sans méthanol.
8. Dessalage et concentration des échantillons
   1. Si nécessaire, regrouper les fractions (à partir du point 1.7.6) en groupes expérimentaux appropriés (p. ex., par réplique biologique ou groupe expérimental).
   2. Placer le volume total de l’échantillon dans une colonne filtrante centrifuge de 500 μL avec un MWCO de 3 000 Da.
   3. Tourner pendant 30 min à 14 000 x g à température ambiante. Répétez l’opération si nécessaire si le volume d’échantillon souhaité dépasse la capacité de la colonne de filtre centrifuge.
   4. Lavez chaque colonne 3x avec 400 μL d’eau désionisée et filtrée. Jetez le flux à travers. Passez directement à l’étape 1.9.
9. Digestion de la chondroïtine
   REMARQUE: Le but de cette étape est de supprimer les GG qui n’intéressent pas l’utilisateur final. Dans ce cas, la chondroïtine est utilisée pour éliminer la chondroïtine. Dans les tissus utilisés pour générer des résultats représentatifs (liquide de lavage broncho-alvéolaire et poumon entier), la digestion du sulfate de chondroïtine laisse le sulfate d’héparane comme principal GAG résiduel. Les utilisateurs finaux peuvent avoir besoin d’ajouter des étapes de digestion supplémentaires en fonction de leurs objectifs expérimentaux.
   1. Chargez 350 μL de tampon de digestion (acétate d’ammonium de 50 mM avec 2 mM de chlorure de calcium ajusté à un pH de 7,0) dans la colonne filtrante centrifuge sans toucher la membrane.
   2. Ajouter 5 μL de chondroïinase ABC recombinante.
   3. Placer le tube d’échantillonnage dans un four à 37 °C et incuber pendant 1 h.
   4. Retournez la colonne et placez-la dans des tubes de collecte étiquetés de manière appropriée. Tourner pendant 1 min à 2000 x g.
   5. Chauffer les échantillons à 80 °C pendant 15-20 min pour inactiver la chondroïtinase ABC.
10. Dessalage et concentration des échantillons
    1. Si nécessaire, regrouper les échantillons de chondroïtine de l’étape 1.9.5 en groupes expérimentaux appropriés (p. ex., par réplique biologique ou groupe expérimental).
    2. Placer le volume total de l’échantillon dans une colonne filtrante centrifuge de 500 μL avec un MWCO de 3 000 Da.
    3. Tourner pendant 30 min à 14 000 x g à température ambiante. Répétez l’opération au besoin si le volume d’échantillon souhaité dépasse la capacité de la colonne de filtre centrifuge.
    4. Lavez chaque colonne 3x avec 400 μL d’eau désionisée et filtrée. Jetez le flux à travers.
    5. Inverser le filtre et tourner pendant 1 min à 2 000 x g dans des tubes de collecte frais et correctement étiquetés. Congelez à -80 °C ou passez à l’étape suivante.
11. Dessiccation
    REMARQUE: Dans cette étape, la dessiccation est nécessaire afin que les échantillons puissent être remises en caisse dans la plus petite quantité possible d’eau et de tampon courant.
    1. Placez les échantillons digérés de chondroïtine de l’étape 1.10.5 directement dans un concentrateur à vide rotatif pendant la nuit ou lyophilisez comme suit:
    2. Congeler soigneusement les échantillons pendant la nuit à -80 °C ou en trempant dans de l’azote liquide.
    3. Percer les couvercles d’échantillon avec une aiguille de 18 G et placer dans la chambre de lyophilisation. Ajoutez des serviettes en papier pour l’emballage au besoin.
    4. Fixer la chambre du lyophilisateur au lyophilisateur et lyophilisation pendant la nuit (au moins 40 °C, 0,135 Torr)

2. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide de glycosaminoglycanes isolés et purifiés

1. Préparer à l’avance les solutions nécessaires à l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) (Tableau 1).
   REMARQUE: Sélectionnez le pourcentage d’acrylamide de la solution de gel résolvant en fonction de la taille des glycosaminoglycanes attendus dans l’échantillon. 15% est recommandé pour résoudre des fragments plus gros (plus de 30 sous-unités de disaccharides de longueur); 22 % pour les fragments plus petits (<20 sous-unités de disaccharides de longueur).
2. Placez la cassette vide dans le réservoir PAGE. Couler le gel résolvant comme suit : Dans un tube de 15 mL, mélanger 10 mL de solution de gel résolvant, 60 μL de persulfate d’ammonium à 10 % (doit être fraîchement préparé) et 10 μL de TEMED (ajouter TEMED en dernier). Inverser doucement le tube 2-3x. Utilisez une pipette pour ajouter rapidement la solution supérieure à 10 mL à la cassette. Superposer avec 2 mL d’eau déionisée et filtrée et laisser le gel de résolution polymériser pendant 30 min.
   REMARQUE: Le protocole PAGE suivant a été optimisé pour un système PAGE vertical utilisant des cassettes de coulée de 13,3 x 8,7 cm (largeur x longueur) de 1,0 mm d’épaisseur avec un volume total d’environ 12 mL. D’autres systèmes de cassettes peuvent être utilisés, mais peuvent nécessiter une optimisation par l’utilisateur final.
3. Une fois que le gel de résolution a complètement polymérisé, jeter l’eau superposée et couler le gel empilable comme suit: dans un tube de 15 mL, mélanger 3 mL de la solution de gel empilable, 90 μL de persulfate d’ammonium à 10% (doit être fraîchement préparé), 3 μL de TEMED (ajouter TEMED en dernier).
4. Inverser doucement le tube 2-3x. Utilisez une pipette pour ajouter rapidement la solution de gel empilable sur le gel de résolution solidifié; remplir la cassette à ras bord. Insérez entièrement le peigne inclus avec la configuration. Laisser le gel empilable polymériser pendant 30 min.
5. Une fois le gel polymérisé, assurez-vous que la bande de bande est retirée du fond de la cassette et replacez la cassette dans l’ensemble du réservoir PAGE.
6. Remplissez les chambres supérieure et inférieure avec un tampon de chambre supérieure et inférieure, respectivement.
7. Dissoudre les échantillons séchés de l’étape 1.11.4 dans le volume minimum nécessaire d’eau désionisée et filtrée (au maximum, 50% du volume des puits dans le gel PAGE). Mélanger 1:1 avec le tampon de chargement de l’échantillon. Charger les échantillons et les « échelles » d’oligosaccharides HS (voir tableau 1)dans le gel.
8. Pré-exécuter le gel pendant 5 min à 100 V. Ensuite, faites fonctionner le gel à 200 V pendant 20-25 min (pour un gel résolvant de polyacrylamide à 15%), 40-50 min (pour un gel de résolution de polyacrylamide à 18%), 90-100 min (pour un gel de résolution de polyacrylamide à 22%).
   REMARQUE: Une certaine optimisation de la durée d’exécution de 200 V peut être nécessaire. Le rouge de phénol migre devant les oligosaccharides d’héparine qui sont 2 sous-unités polymères de longueur (c.-à-d. degré de polymérisation 2, ou dp2); le bleu de bromophénol migre avant dp10-dp14. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque la tension est appliquée de telle sorte que la bande rouge phénol migre presque, mais pas tout à fait, vers le fond du gel. Ajustez le temps d’exécution en conséquence.

3. Protocole de coloration à l’argent

1. Préparer à l’avance toutes les solutions nécessaires à la coloration à l’argent (Tableau 2).
   REMARQUE: Ne touchez pas directement le gel PAGE tant qu’il n’a pas été taché, développé et placé dans une solution d’arrêt. Au lieu de cela, manipulez le gel à l’aide d’outils en plastique ou en verre propres. La manipulation directe du gel entraînera des distorsions d’empreinte digitale et d’autres artefacts visibles sur le gel après la coloration.
2. Une fois la course terminée, démontez la cassette et extrayez le gel dans un récipient propre de taille moyenne à grande rempli d’eau déionisée et filtrée.
   REMARQUE: Pour éviter de manipuler directement le gel, utilisez la pointe de la pipette ou un autre objet en plastique pour décoller doucement le gel de la cassette lorsqu’il est immergé dans l’eau. Le gel peut être fragile - manipulez-le avec précaution.
   1. Jetez l’eau. Tacher le gel dans une solution de coloration bleu Alcian pendant 5 min.
   2. Jetez la tache bleue d’Alcian. Rincez / lavez rapidement 2-3x avec de l’eau filtrée désionisée jusqu’à ce que la majeure partie de la solution de coloration bleu Alcian ait été enlevée.
   3. Laisser dé-tacher dans de l’eau déionisée et filtrée pendant la nuit sur la bascule. Assurez-vous qu’il y a un volume suffisant d’eau déionisée et filtrée pour vous assurer que toute tache résiduelle est complètement lavée du gel pendant la nuit.
   4. Gel de lavage dans du méthanol à 50% (40 min au total, changer de solution 2-3x).
   5. Gel de lavage à l’eau désionisée et filtrée pendant 30 min. Jetez l’eau et répétez 3 fois de plus pendant un total de 2 h, en remplaçant l’eau à chaque fois.
   6. Dans un récipient frais et propre, tacher le gel pendant 30 min dans une solution de coloration au nitrate d’argent.
   7. Rincez / lavez rapidement 2-3x dans de l’eau filtrée désionisée pour éliminer complètement la solution de coloration à l’argent.
   8. Laver pendant 30 min à l’eau déionisée et filtrée. Jetez l’eau et répétez 2x pendant un total de 90 min, en remplaçant le bain-marie à chaque fois.
   9. Jetez l’eau et ajoutez une solution de développement.
   10. Une fois la solution en développement ajoutée, observez attentivement le gel et surveillez l’apparition des bandes. Selon la qualité de la tache et la masse de l’échantillon chargé, le développement peut prendre de quelques secondes à plusieurs minutes.
   11. Dès que les bandes souhaitées sont visibles, jetez immédiatement la solution en développement et lavez-la brièvement avec la solution d’arrêt.
   12. Jetez le lavage de la solution d’arrêt et remplacez-le par une solution d’arrêt fraîche. Laisser tremper pendant 1 h sur une bascule ou un shaker.
   13. Laver à l’eau désionisée et filtrée pendant la nuit (cependant, le gel peut être imagé immédiatement après l’arrêt du lavage de la solution).

Résultats

Le bleu Alcian est utilisé pour colorer les GAG sulfatés ¹⁰; ce signal est amplifié par l’utilisation d’une tache d’argent ultérieure ¹¹. La figure 1 présente une démonstration visuelle du processus de développement de la coloration à l’argent. Comme démontré, le signal bleu Alcian représentant les GAN séparés par électrophorèse est amplifié lorsque l’agent en développement pénètre dans le gel de polyacrylamide. En ...

Discussion

Les GG jouent un rôle central dans de nombreux processus biologiques divers. L’une des principales fonctions des GAN sulfatés (tels que HS et CS) est d’interagir avec les ligands et de s’y lier, ce qui peut modifier les fonctions de signalisation en aval. Un déterminant important de l’affinité de liaison GAG aux ligands apparentés est la longueur de la chaîne polymère GAG ^8,9,14. Pour cette raison, il est importan...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge	thermoFisher Scientific	13-100-675	Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate
Acrylamide (solid)	thermoFisher Scientific	BP170-100	Electrophoresis grade
Actinase E	Sigma Aldrich	P5147	Protease mix from S. griseus
Alcian Blue 8GX (solid)	thermoFisher Scientific	AC400460100
Ammonium acetate (solid)	thermoFisher Scientific	A639-500	Molecular biology grade
Ammonium hydroxide (liquid)	thermoFisher Scientific	A669S-500	certified ACS
Ammonium persulfate (solid)	thermoFisher Scientific	BP179-25	electrophoresis grade
Barnstead GenPure Pro Water Purification System	ThermoFisher Scientific	10-451-217PKG	Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute
Boric acid (solid)	thermoFisher Scientific	A73-500	Molecular biology grade
Bromphenol blue (solid)	thermoFisher Scientific	B392-5
Calcium acetate (solid)	ThermoFisher Scientific	18-609-432	Molecular biology grade
Calcium chloride (solid)	ThermoFisher Scientific	AC349610250	Molecular biology grade
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)	ThermoFisher Scientific	28299
Chondroitinase ABC	Sigma Aldrich	C3667
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)	Bio-Rad	3459901	Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)	Bio-Rad	1656019	any comparable vertical gel PAGE system will work)
Dichloromethane (liquid)	thermoFisher Scientific	AC610931000	certified ACS
EDTA disodium salt (solid)	thermoFisher Scientific	02-002-786	Molecular biology grade
Glacial acetic acid (liquid)	thermoFisher Scientific	A35-500	Certified ACS
Glycine (solid)	thermoFisher Scientific	G48-500	Electrophoresis grade
Heparanase I/III	Sigma Aldrich	H3917	From Flavobacterium heparinum
Heparin derived decasaccharide (dp10)	galen scientific	HO10
Heparin derived hexasaccharde (dp6)	Galen scientific	HO06
Heparin derived oligosaccharide (dp20)	galen scientific	HO20
Hydrochloric acid (liquid)	thermoFisher Scientific	A466-250
Lyophilizer	Labconco	7752020	Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator
Methanol (liquid)	thermoFisher Scientific	A412-500	Certified ACS
Molecular Imager Gel Doc XR System	Bio-Rad	170-8170	Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid)	thermoFisher Scientific	BP171-25	Electrophoresis grade
Phenol red (solid)	thermoFisher Scientific	P74-10	Free acid
Q Mini H Ion Exchange Column	Vivapure	VS-IX01QH24	Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11
Silver nitrate (solid)	thermoFisher Scientific	S181-25	certified ACS
Sodium Acetate (solid)	ThermoFisher Scientific	S210-500	Molecular biology grade
Sodium chloride (solid)	thermoFisher Scientific	S271-500	Molecular biology grade
Sodium hydroxide (solid)	thermoFisher Scientific	S392-212
Sucrose (solid)	thermoFisher Scientific	BP220-1	Molecular biology grade
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine)	thermoFisher Scientific	BP150-20	Electrophoresis grade
Tris base (solid)	thermoFisher Scientific	BP152-500	Molecular biology grade
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff	Amicon	UFC500324	Larger volume filter units may be used, depending on sample size.
Urea (solid)	ThermoFisher Scientific	29700
Vacufuge Plus	Eppendorf	22820001	Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume	thermoFisher Scientific	569-0020	Alternative volumes and filter materials acceptable