JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом отчете описываются методы выделения и очистки сульфатированных гликозаминогликанов (ГАГ) из биологических образцов и подход электрофореза полиакриламидного геля для приближения их размера. ГАГ способствуют структуре тканей и влияют на сигнальные процессы посредством электростатического взаимодействия с белками. Длина полимера GAG способствует их сродству связыванию с родственными лигандами.

Аннотация

Сульфатированные гликозаминогликаны (GAGs), такие как гепарансульфат (HS) и хондроитин сульфат (CS), повсеместно распространены в живых организмах и играют решающую роль в различных основных биологических структурах и процессах. В качестве полимеров GAG существуют в виде полидисперсной смеси, содержащей полисахаридные цепи, которые могут варьироваться от 4000 Да до более 40 000 Да. Внутри этих цепей существуют домены сульфатации, приделяющие паттерн отрицательного заряда, который облегчает взаимодействие с положительно заряженными остатками родственных белковых лигандов. Сульфатированные домены ГАГ должны быть достаточной длины, чтобы обеспечить эти электростатические взаимодействия. Чтобы понять функцию ГАГ в биологических тканях, исследователь должен быть в состоянии изолировать, очистить и измерить размер ГАГ. В этом отчете описывается практический и универсальный метод электрофореза на основе полиакриламидного геля, который может быть использован для устранения относительно небольших различий в размерах между GAG, выделенными из различных типов биологических тканей.

Введение

Гликозаминогликаны (ГАГ) представляют собой разнообразное семейство линейных полисахаридов, которые являются повсеместным элементом в живых организмах и способствуют многим основным физиологическим процессам1. ГАГ, такие как гепарансульфат (HS) и хондроитин сульфат (CS), могут быть сульфатированы в различных положениях вдоль полисахаридной цепи, придав географическим доменам отрицательный заряд. Эти GAG, будучи привязанными к белкам клеточной поверхности, известным как протеогликаны, проецируются во внеклеточное пространство и связываются с родственными лигандами, что позволяет регуляцию как цис- (лиганд, прикрепленный к одной и той же клетке), так и транс- (лиганд, прикрепленный к соседней клетке) сигнальных процессов2. Кроме того, ГАГ также выполняют решающую роль в качестве структурных элементов в тканях, таких как клубочковая базальная мембрана3,сосудистый эндотелиальный гликокаликс4 и легочный эпителиальный гликокаликс5,а также в соединительных тканях, таких как хрящ6.

Длина полисахаридных цепей GAG существенно варьируется в зависимости от ее биологического контекста и может динамически удлигаться, расщепляться и модифицироваться очень сложной ферментативной регуляторной системой7. Важно отметить, что длина полимерных цепей GAG существенно способствует их сродству связывания к лигандам и, впоследствии, их биологической функции8,9. По этой причине определение функции эндогенной ГАГ требует оценки ее размера. К сожалению, в отличие от белков и нуклеиновых кислот, существует очень мало легкодоступных методов обнаружения и измерения ГАГ, что исторически привело к относительно ограниченному исследованию биологических ролей этого разнообразного семейства полисахаридов.

В этой статье описывается, как изолировать и очищать ГАГ из большинства биологических тканей, а также описывается, как использовать электрофорез полиакриламидного геля (PAGE) для оценки длины выделенных полимеров с достаточной степенью специфичности. В отличие от других, очень сложных (и часто основанных на масс-спектрометрии) гликомических подходов, этот метод может быть использован с использованием стандартного лабораторного оборудования и методов. Таким образом, этот практический подход может расширить возможности исследователей по определению биологической роли нативных ГАГ и их взаимодействия с контекстуально важными лигандами.

протокол

Все биологические образцы, проанализированные в этом протоколе, были получены от мышей в соответствии с протоколами, одобренными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Колорадо.

1. Выделение сульфата гепарана

  1. Делипидация образцов тканей
    ПРИМЕЧАНИЕ: Делипидация является необязательным этапом для богатых жирами тканей.
    1. Сделайте смесь метанола и дихлорметана 1:1. Приготовить приблизительно 500 мкл на образец; более крупные куски ткани могут потребовать до 1 мл.
    2. Поместите каждый образец ткани в небольшой стеклянный контейнер с крышкой для делипидации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Масса образца может варьироваться в зависимости от ткани, представляющих интерес, и экспериментальных потребностей. 50 мг или менее обычно достаточно для адекватного выхода GAG, но конечному пользователю может потребоваться некоторая оптимизация.
    3. Добавьте 500 мкл раствора метанола: дихлорметана в каждый стеклянный контейнер и перемешайте. Убедитесь, что все образцы твердых тканей полностью погружены в растворитель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте серологические пипетки или пластиковые конические трубки для смешивания и обработки раствора метанола/дихлорметана; другие пластмассы могут растворяться.
    4. Поместите образцы на шейкер (в защищенную стойку) в химический вытяжной капюшон и осторожно перемешивайте в течение 1 ч.
    5. Перемешивают образцы до смешивания и центрифуги при 17 000 х г в течение 5 мин при 4 °C.
    6. Осторожно вылейте фракцию органического растворителя (супернатанта). Это липидная фракция – она не содержит ГАГ и может быть выброшена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Постарайтесь не беспокоить ткани, так как небольшие кусочки могут быть потеряны. Предпочтительно оставить часть органического слоя в контейнере для образцов, а не рисковать потерей образца.
    7. Оставьте крышку стеклянной емкости открытой и дайте ей испариться в течение ночи в вытяжке. Замените трубку для следующего этапа, так как эти трубки не выдержут дальнейшую обработку.
    8. Как только смесь растворителя полностью испарится, приступают к механическому распаду (если остаточный образец составляет >50 мг) или перевариванию актиназы Е (< 50 мг).
  2. Механический распад твердой ткани (опционально; для более крупных образцов тканей)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство небольших кусочков твердой ткани (примерно 50 мг или менее) должны полностью раствориться на этапе пищеварения. Однако более крупные образцы потребуют механического распада.
    1. Интересующие образцы мгновенной заморозки, помещая их в полипропиленовую трубку соответствующего размера и помещая закрытую трубку в жидкий азот. Дайте образцу замерзнуть до полного твердого вещества.
    2. Используя чистую ступку и пестик, измельчите замороженные образцы в порошкообразную консистенцию.
    3. Приступайте непосредственно к пищеварению актиназы Е (шаг 1.4).
  3. Обессоливание и концентрация проб
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это необязательный этап, который требуется только для разбавления образцов жидких тканей (например, бронхо-альвеолярной промывной жидкости (BALF) или плазмы).
    1. Объединение жидких образцов в соответствующие экспериментальные группы (например, по биологической реплике или экспериментальной группе)
    2. Поместите общий объем образца в колонку центробежного фильтра объемом 500 мкл с отсечкой молекулярной массы (MWCO) 3000 Да.
    3. Отжимать в течение 30 мин при 14 000 х г при комнатной температуре. Повторите по мере необходимости, если требуемый объем образца превышает емкость колонки центробежного фильтра.
    4. Промывайте каждую колонку 3x 400 мкл деионизированной, фильтрованной воды. Отбросьте поток.
    5. Переверьте фильтр и открутите в течение 1 мин при 2 000 х г в свежих, соответствующим образом маркированных сборных тубах. Заморозьте при -80 °C или перейдите к следующему шагу.
  4. Переваривание актиназы Е
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для переваривания и в конечном итоге удаления белковых загрязнителей из вашего образца.
    1. Смешайте образцы 1:1 с рекомбинантной актиназой Е до желаемой концентрации 10 мг/мл. Добавьте соответствующий объем 10-кратного буферного концентрата для пищеварения. Желаемая конечная концентрация: 0,005 М ацетата кальция и 0,01 М ацетата натрия, рН 7,5. Например: 190 мкл жидкого образца, 190 мкл 20 мг/мл актиназы Е, 20 мкл 0,05 М ацетата кальция, 0,1 М ацетата натрия.
    2. Образцы осторожно перемешивают, затем переваривают в течение 48-72 ч при 55 °C (до 7 дней для целой ткани).
    3. Нагревать до 80 °C в течение 15-20 мин для нагрева инактивировать актиназу Е.
    4. Заморозьте образец при -80 °C или продолжайте двигаться к шагу 1,5.
  5. Обессоливание и концентрация проб
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если в биологическом образце ожидается низкая масса интересующего ГАГ или если желательно сохранение расходуемых реагентов (т.е. центробежных фильтрующих колонн), образцы могут быть объединены для получения одного концентрата на экспериментальную группу (например, биологической репликой или экспериментальной группой).
    1. Поместите общий объем образца в колонку центробежного фильтра объемом 500 мкл с MWCO 3000 Da.
    2. Отжимать в течение 30 мин при 14 000 х г при комнатной температуре. Повторите по мере необходимости, если требуемый объем образца превышает емкость центробежной фильтрующей колонны.
    3. Промывайте каждую колонку 3x 400 мкл деионизированной, фильтрованной воды. Отбросьте поток.
    4. Инвертировать фильтр и отжимать в течение 1 мин при 2 000 х г в свежих, соответствующим образом маркированных коллекторных трубках (обычно входят в комплект поставки центробежных фильтруемых колонн). Заморозьте при -80 °C или перейдите к следующему шагу.
  6. Высыхание
    1. Либо поместите растворенные образцы из этапа 1.5.5 во вращательную вакуумную концентратор на ночь, либо лиофилизируйте образцы, как описано ниже.
    2. Тщательно заморозьте образцы либо на ночь при -80 °C, либо путем погружения в жидкий азот.
    3. Проткните крышки образца иглой 18 Г и поместите в камеру лиофилизатора. Добавьте бумажные полотенца для упаковки по мере необходимости.
    4. Зафиксируйте камеру лиофилайзера на лиофилизаторе и высушите сублимационную в течение ночи (не менее -40 °C, 0,135 Torr)
  7. Катионообменная колонна
    1. Повторное суспендирование высушаемых образцов в объеме до 400 мкл 8 М мочевины, 2% раствора CHAPS (или, при объединении образцов, повторное суспендирование до максимума (400/n) мкл, где n = количество образцов в желаемом пуле. Используйте как можно меньше моющего раствора.
    2. Уравновешивают катионообменную колонну (IEX) 400 мкл 8 М мочевины, 2% раствор ЧАПС. Отжимать в течение 5 мин при 2 000 х г при комнатной температуре.
    3. Загрузите 400 мкл образцов/объединенных образцов в колонку IEX. Вращаться в течение 5 мин при 2 000 х г.
    4. Промыть 3x 400 мкл 8 М мочевины, 2% раствор ЧАПС. Вращайте в течение 5 минут при 2 000 х г каждый раз.
    5. Elute 3x с 400 мкл 0,2 М NaCl. Вращать в течение 5 мин при 2 000 х г каждый. Это фракция с низким сродством - при желании ее можно сохранить для целей контроля качества.
    6. Elute 3x с 400 мкл 2,7 М (16%) NaCl. Вращать в течение 5 мин при 2 000 х г каждый. Эта фракция будет содержать выделенные гликозаминогликаны, представляющие интерес - сохраните все это!
    7. Чтобы обессолить каждую элюированную фракцию, добавляют метанол до 80 об.% и инкубируют при 4 °C в течение ночи. Вращайте каждый образец в течение 5 минут при 2 000 х г. Рекуперирует твердый остаток, так как это высушенный обеззаленный гликозаминогликан.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы пропустите этот этап и перейдите к этапу 1.8 для обезживливать элюат без метанола.
  8. Обессоливание и концентрация проб
    1. При необходимости объединяют элюированные фракции (из 1.7.6) в соответствующие экспериментальные группы (например, по биологической реплике или экспериментальной группе).
    2. Поместите общий объем образца в колонку центробежного фильтра объемом 500 мкл с MWCO 3000 Da.
    3. Отжимать в течение 30 мин при 14 000 х г при комнатной температуре. Повторите по мере необходимости, если требуемый объем образца превышает емкость центробежной фильтрующей колонны.
    4. Промывайте каждую колонку 3x 400 мкл деионизированной, фильтрованной воды. Выбрасываемые потоки. Перейдите непосредственно к шагу 1.9.
  9. Переваривание хондроитина
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этого шага является удаление GAG, не представляющих интереса для конечного пользователя. В этом случае хондроитиназа используется для удаления хондроитина. В тканях, используемых для получения репрезентативных результатов (бронхо-альвеолярная лаважная жидкость и все легкое), переваривание хондроитина сульфата листьев гепарана сульфата в качестве первичного остаточного GAG. Конечным пользователям может потребоваться добавить дополнительные этапы пищеварения в зависимости от их экспериментальных целей.
    1. Загрузите 350 мкл буфера пищеварения (50 мМ ацетата аммония с 2 мМ хлорида кальция с поправкой на рН 7,0) в колонку центробежного фильтра, не касаясь мембраны.
    2. Добавляют 5 мкл рекомбинантной хондроитиназы ABC.
    3. Поместите пробирку для образцов в духовку с 37 °C и инкубировать в течение 1 ч.
    4. Переверните колонну и поместите в соответствующие наборные трубки. Отжим в течение 1 мин при 2000 х г.
    5. Нагревайте образцы до 80 °C в течение 15-20 мин для инактивации хондроитиназы ABC.
  10. Обессоливание и концентрация проб
    1. При необходимости пул хондроитина переваривал образцы со этапа 1.9.5 в соответствующие экспериментальные группы (например, по биологической реплике или экспериментальной группе)
    2. Поместите общий объем образца в колонку центробежного фильтра объемом 500 мкл с MWCO 3000 Да.
    3. Отжимать в течение 30 мин при 14 000 х г при комнатной температуре. Повторите по мере необходимости, если требуемый объем образца превышает емкость колонки центробежного фильтра.
    4. Промывайте каждую колонку 3x 400 мкл деионизированной, фильтрованной воды. Отбросьте поток.
    5. Инвертировать фильтр и отжимать в течение 1 мин при 2 000 х г в свежих, соответствующим образом маркированных сборных тубах. Заморозьте при -80 °C или перейдите к следующему шагу.
  11. Высыхание
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе высыхание необходимо для того, чтобы образцы можно было повторно суспендовать в минимально возможном количестве воды и проточном буфере.
    1. Либо поместите переваренные образцы хондроитина со этапа 1.10.5 непосредственно во вращающийся вакуумный концентратор на ночь или лиофилизируйте следующим образом:
    2. Тщательно заморозьте образцы либо на ночь при -80 °C, либо путем погружения в жидкий азот.
    3. Проткните крышки образца иглой 18 Г и поместите в камеру лиофилизатора. Добавьте бумажные полотенца для упаковки по мере необходимости.
    4. Зафиксируйте камеру лиофилизатора к лиофилизатору и высушите лиофилизером в течение ночи (не менее 40 °C, 0,135 Торра)

2. Электрофорез полиакриламидного геля из выделенных и очищенных гликозаминогликанов

  1. Заранее готовят растворы, необходимые для электрофореза полиакриламидного геля (ПАЖ)(табл. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите процент акриламида раствора разрешающего геля в зависимости от размера гликозаминогликанов, которые, как ожидается, будут в образце. 15% рекомендуется для рассасывания более крупных фрагментов (более 30 дисахаридных субъединиц в длину); 22% для более мелких фрагментов (<20 дисахаридных субъединиц в длину).
  2. Поместите пустую кассету в резервуар PAGE. Отлить рассасывающий гель следующим образом: В пробирке объемом 15 мл смешать 10 мл раствора разрешающего геля, 60 мкл 10% персульфата аммония (должен быть свежеприготовленным) и 10 мкл TEMED (добавить TEMED последним). Осторожно переверяем трубку в 2-3 раза. Используйте пипетку, чтобы быстро добавить вышеуказанный раствор 10 мл в кассету. Наложить 2 мл деионизированной, фильтрованной воды и дать рассасывающейся гелю полимеризоваться в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол PAGE был оптимизирован для вертикальной системы PAGE с использованием литейных кассет толщиной 13,3 x 8,7 см (ширина x длина) толщиной 1,0 мм общим объемом около 12 мл. Другие кассетные системы могут быть использованы, но могут потребовать оптимизации конечным пользователем.
  3. После того, как разрешающий гель полностью полимеризуется, отбросьте наложенную воду и отлить укладочный гель следующим образом: в пробирке объемом 15 мл смешайте 3 мл раствора геля для укладки, 90 мкл 10% персульфата аммония (должен быть свежеприготовлен), 3 мкл TEMED (добавьте TEMED последним).
  4. Осторожно переверяем трубку в 2-3 раза. Используйте пипетку, чтобы быстро добавить укладывающий гель поверх затвердевания разрешающего геля; заполнить кассету до краев. Полностью вставьте гребень, входящий в комплект поставки. Дайте укладываемым гелю полимеризоваться в течение 30 мин.
  5. После полимеризации геля убедитесь, что ленточная лента удалена со дна кассеты, и поместите кассету обратно в сборку резервуара PAGE.
  6. Заполните верхнюю и нижнюю камеры буфером верхней и нижней камер соответственно.
  7. Растворите высушенные образцы со ступени 1.11.4 в минимально необходимом объеме деионизированной, фильтрованной воды (не более 50% от объема скважин в геле PAGE). Смешайте 1:1 с буфером загрузки образца. Загрузите образцы HS и олигосахаридные «лестницы» (см. таблицу 1)в гель.
  8. Предварительно запустите гель в течение 5 мин при 100 В. Затем запускают гель при 200 В в течение 20-25 мин (для 15% полиакриламидного разрешающего геля), 40-50 мин (для 18% полиакриламидного разрешающего геля), 90-100 мин (для 22% полиакриламидного разрешающего геля).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться некоторая оптимизация времени выполнения 200 В. Фенол красный мигрирует впереди олигосахаридов гепарина, которые имеют длину 2 полимерные субъединицы (т.е. степень полимеризации 2 или dp2); бромфенол синий мигрирует раньше dp10-dp14. Наилучшие результаты получаются при подаче такого напряжения, что фенольно-красная полоса мигрирует почти, но не совсем, на дно геля. Отрегулируйте время выполнения соответствующим образом.

3. Протокол окрашивания серебра

  1. Заранее подготовьте все растворы, необходимые для окрашивания серебра(таблица 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь непосредственно к гелю PAGE до тех пор, пока он не будет окрашен, разработан и помещен в стоп-раствор. Вместо этого манипулируйте гелем, используя чистые пластиковые или стеклянные инструменты. Непосредственное обращение с гелем приведет к искажениям отпечатков пальцев и другим видимым артефактам на геле после окрашивания.
  2. После завершения пробега разберите кассету и извлеките гель в чистый контейнер среднего размера, заполненный деионизированной, фильтрованной водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать непосредственного обращения с гелем, используйте наконечник пипетки или другой пластиковый предмет, чтобы аккуратно отклеить гель от кассеты во время погружения в воду. Гель может быть хрупким – обращаться осторожно.
    1. Выбросьте воду. Окрашивание геля в раствор для окрашивания Alcian blue в течение 5 мин.
    2. Отбросьте алцианское синее пятно. Быстро промывайте/промывайте 2-3 раза деионизированной, фильтрованной водой до тех пор, пока большая часть раствора для окрашивания Alcian blue не будет удалена.
    3. Дайте обеззаражить деионизированную, фильтрованную воду в течение ночи на коромысле. Убедитесь, что имеется достаточный объем деионизированной, отфильтрованной воды, чтобы гарантировать, что любое остаточное пятно полностью смывается с геля в течение ночи.
    4. Промыть гель в 50% метаноле (всего 40 мин, заменить раствор 2-3х).
    5. Промыть гель в деионизированной, фильтрованной воде в течение 30 мин. Выбросьте воду и повторите еще 3 раза в течение 2 ч, каждый раз заменяя воду.
    6. В свежей, чистой емкости окрашивать гель в течение 30 мин раствором для окрашивания нитратом серебра.
    7. Быстро промойте/смойте 2-3 раза в деионизированной, фильтрованной воде, чтобы полностью удалить раствор для окрашивания серебра.
    8. Промывайте в течение 30 мин в деионизированной, фильтрованной воде. Отбросьте воду и повторите 2 раза в общей сложности 90 минут, каждый раз заменяя водяную баню.
    9. Отбросьте воду и добавьте развивающий раствор.
    10. После того, как развивающий раствор добавлен, внимательно наблюдайте за гелем и следите за появлением полос. В зависимости от качества пятна и массы загруженного образца, разработка может занять от нескольких секунд до нескольких минут.
    11. Как только видны нужные полосы, немедленно отбросьте развивающийся раствор и ненадолго промойте стоп-раствором.
    12. Откажитесь от стоп-раствора, промыть и заменить его свежим стоп-раствором. Дать впитаться в течение 1 ч на коромысле или шейкере.
    13. Промывайте в деионизированной, фильтрованной воде на ночь (однако гель можно визуализировать сразу после остановки промывки раствором).

Результаты

Альциановый синий используется для окрашивания сульфатированных GAGs 10; этот сигнал усиливается с помощью последующего серебряного пятна 11. На рисунке 1 представлена наглядная демонстрация процесса развития окрашивания серебром. Как было пока?...

Обсуждение

ГАГ играют центральную роль во многих разнообразных биологических процессах. Одной из основных функций сульфатированных GAG (таких как HS и CS) является взаимодействие с лигандами и связывание с них, которые могут изменять последующие сигнальные функции. Важным фактором, определяющим сро...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа финансировалась F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL и EPS)

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Accuspin Micro17 benchtop microcentrifugethermoFisher Scientific13-100-675Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate
Acrylamide (solid)thermoFisher ScientificBP170-100Electrophoresis grade
Actinase ESigma AldrichP5147Protease mix from S. griseus
Alcian Blue 8GX (solid)thermoFisher ScientificAC400460100
Ammonium acetate (solid)thermoFisher ScientificA639-500Molecular biology grade
Ammonium hydroxide (liquid)thermoFisher ScientificA669S-500certified ACS
Ammonium persulfate (solid)thermoFisher ScientificBP179-25electrophoresis grade
Barnstead GenPure Pro Water Purification SystemThermoFisher Scientific10-451-217PKGAny water deionizing/ purification system is an acceptable substitute
Boric acid (solid)thermoFisher ScientificA73-500Molecular biology grade
Bromphenol blue (solid)thermoFisher ScientificB392-5
Calcium acetate (solid)ThermoFisher Scientific18-609-432Molecular biology grade
Calcium chloride (solid)ThermoFisher ScientificAC349610250Molecular biology grade
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)ThermoFisher Scientific28299
Chondroitinase ABCSigma AldrichC3667
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)Bio-Rad3459901Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)Bio-Rad1656019any comparable vertical gel PAGE system will work)
Dichloromethane (liquid)thermoFisher ScientificAC610931000certified ACS
EDTA disodium salt (solid)thermoFisher Scientific02-002-786Molecular biology grade
Glacial acetic acid (liquid)thermoFisher ScientificA35-500Certified ACS
Glycine (solid)thermoFisher ScientificG48-500Electrophoresis grade
Heparanase I/IIISigma AldrichH3917From Flavobacterium heparinum
Heparin derived decasaccharide (dp10)galen scientificHO10
Heparin derived hexasaccharde (dp6)Galen scientificHO06
Heparin derived oligosaccharide (dp20)galen scientificHO20
Hydrochloric acid (liquid)thermoFisher ScientificA466-250
LyophilizerLabconco7752020Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator
Methanol (liquid)thermoFisher ScientificA412-500Certified ACS
Molecular Imager Gel Doc XR SystemBio-Rad170-8170Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid)thermoFisher ScientificBP171-25Electrophoresis grade
Phenol red (solid)thermoFisher ScientificP74-10Free acid
Q Mini H Ion Exchange ColumnVivapureVS-IX01QH24Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11
Silver nitrate (solid)thermoFisher ScientificS181-25certified ACS
Sodium Acetate (solid)ThermoFisher ScientificS210-500Molecular biology grade
Sodium chloride (solid)thermoFisher ScientificS271-500Molecular biology grade
Sodium hydroxide (solid)thermoFisher ScientificS392-212
Sucrose (solid)thermoFisher ScientificBP220-1Molecular biology grade
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine)thermoFisher ScientificBP150-20Electrophoresis grade
Tris base (solid)thermoFisher ScientificBP152-500Molecular biology grade
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoffAmiconUFC500324Larger volume filter units may be used, depending on sample size. 
Urea (solid)ThermoFisher Scientific29700
Vacufuge PlusEppendorf22820001Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volumethermoFisher Scientific569-0020Alternative volumes and filter materials acceptable

Ссылки

  1. LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
  2. Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
  3. Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
  4. Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
  5. Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
  6. Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
  7. Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
  8. Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
  9. Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
  10. Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
  11. Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
  12. Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
  13. Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
  14. Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
  15. Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
  16. Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
  17. Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
  18. Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
  19. Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

168

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены