ポリアクリルアミドゲル電気泳動と銀染色によるグリコサミノグリカンの検出

要約

本報告書では、生物学的試料から硫酸化グリコサミノグリカン(GAG)を分離して精製する技術と、そのサイズを近似するポリアクリルアミドゲル電気泳動法について説明する。GAGsは、組織構造に寄与し、タンパク質との静電相互作用を通じてシグナル伝達プロセスに影響を与えます。GAGポリマー長は、同結合リガンドに対する結合親和性に寄与する。

要約

硫酸塩(HS)やコンドロイチン硫酸(CS)などの硫酸塩グリコサミノグリカン(GAG)は、生物に遍在し、様々な基本的な生物学的構造やプロセスにおいて重要な役割を果たしています。ポリマーとして、GAGは4000 Daから40,000 Daをはるかに超える範囲の多糖鎖を含む多分散混合物として存在します。これらの鎖の中には、硫酸化のドメインが存在し、同結合タンパクリガンドの正に帯電した残基との相互作用を促進する負電荷のパターンを与える。GAGsの硫酸化ドメインは、これらの静電相互作用を可能にするのに十分な長さでなければならない。生物学的組織におけるGAGsの機能を理解するには、研究者がGAGsのサイズを単離し、精製し、測定できる必要があります。本報告書は、様々な生体組織タイプから分離されたGAGs間のサイズの比較的小さな違いを解決するために活用できる実用的で汎用性の高いポリアクリルアミドゲル電気泳動ベースの技術について説明しています。

概要

グリコサミノグリカン(GAG)は、生物の中でユビキタスな要素であり、多くの基本的な生理学的プロセスに寄与する線形多糖の多様なファミリーである^1。ヘパラン硫酸(HS)やコンドロイチン硫酸(CS)などのGAGsは、多糖鎖に沿った異なる位置で硫酸化され、負電荷の地理的領域を付与する。これらのGAGsは、プロテオグリカンとして知られている細胞表面タンパク質に連結すると、細胞外空間に突出してコクネートリガンドに結合し、シス−(同じ細胞に結合したリガンド)およびトランス(隣接する細胞に結合したリガンド)の両方の調節を可能にするシグナル伝達プロセス^2。さらに、GGsはまた、糸球体基質膜^3、血管内皮グリコカリックス⁴ および肺上皮グリコカリックス^5、および軟骨⁶のような結合組織における組織における構造要素としての重要な役割を果たす。

GAG多糖鎖の長さは、その生物学的文脈に応じて実質的に異なり、動的に長く、切断し、非常に複雑な酵素調節システム⁷によって修飾することができる。重要なことに、GAGポリマー鎖の長さは、リガンドに対するそれらの結合親和性に大きく寄与し、その後、その生物学的機能^8、9に寄与する。このため、内因性GAGの機能の決定は、そのサイズの鑑賞を必要とする。残念ながら、タンパク質や核酸とは異なり、GAGsを検出して測定するための容易に入手可能な技術はほとんど存在しません。

この記事では、ほとんどの生体組織からGAGを分離して精製する方法を説明し、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を使用して、分離ポリマーの長さを公正な程度の特異性で評価する方法についても説明します。他の非常に複雑な(そしてしばしば質量分析ベースの)グリコミックアプローチとは対照的に、この方法は標準的な実験室の装置および技術を使用して使用することができる。したがって、この実用的なアプローチは、ネイティブのGAGsの生物学的役割と文脈上重要なリガンドとの相互作用を決定する研究者の能力を拡大する可能性があります。

プロトコル

このプロトコルで分析されたすべての生物学的サンプルは、コロラド大学の制度的動物の世話と使用委員会によって承認されたプロトコルの下で、マウスから得られた。

1. ヘパラン硫酸分離

1. 組織サンプルの脱脂
   注:脱脂は、脂肪が豊富な組織のためのオプションのステップです。
   1. メタノールとジクロロメタンを1:1の混合物にします。サンプルあたり約500 μLを準備します。組織の大きな部分は、最大1 mLを必要とすることができます。
   2. 各組織サンプルを、脱脂用の蓋をした小さなガラス容器に入れます。
      注: サンプル質量は、目的の組織や実験ニーズによって異なる場合があります。50mg以下は、通常、適切なGAG収量のために十分であるが、エンドユーザーが何らかの最適化を必要とするかもしれない。
   3. 各ガラス容器にメタノール:ジクロロメタン溶液500μLを加え、混合します。すべての固体組織サンプルが完全に溶媒に沈めていることを確認します。
      注:メタノール/ジクロロメタン溶液を混合し、処理するために血清ピペットやプラスチック円錐チューブを使用してください。他のプラスチックは溶解する可能性があります。
   4. 化学発煙フードに入れたシェーカー(固定ラック)にサンプルを置き、1時間静かに攪拌します。
   5. 4 °Cで5分間17,000 x g で混合し、遠心分離機を攪拌します。
   6. 有機溶媒分率(上清)を慎重にピペットアウトする。これは脂質分画です - それはGAGsを含んでいないし、廃棄することができます。
      注:小片が失われる可能性がありますので、組織を邪魔しないようにしてください。サンプル損失を危険にさらすのではなく、サンプル容器に有機層の一部を残しておくことが好ましい。
   7. ガラス容器の蓋を開けて、ボンネットで一晩蒸発させます。これらのチューブは、さらなる処理を生き残るために、次のステップのためにチューブを変更します。
   8. 溶媒混合物が完全に蒸発したら、機械的崩壊(残留試料が>50mgの場合)またはアクチナーゼE消化(<50mg)に進みます。
2. 固体組織の機械的崩壊(オプション;より大きな組織サンプルの場合)
   注:ほとんどの小さな固形組織(約50mg以下)は、消化工程中に完全に溶解する必要があります。しかし、より大きなサンプルは機械的崩壊を必要とする。
   1. 目的のフラッシュフリーズサンプルは、適切なサイズのポリプロピレンチューブに配置し、閉じたチューブを液体窒素に配置します。サンプルを完全に固まるまで凍結します。
   2. きれいなモルタルと害虫を使用して、凍結したサンプルを粉末状の一貫性に粉砕します。
   3. アクチナーゼE消化に直接進みます(ステップ1.4)。
3. サンプル脱塩と濃度
   注:これはオプションのステップで、希薄な液体組織サンプル(例えば、気管支肺胞洗浄液(BALF)またはプラズマ)にのみ必要です。
   1. 液体サンプルを適切な実験群にプールする(例えば、生物学的複製、または実験群による)
   2. サンプルの総体積を分子量カットオフ(MWCO)3,000 Daの500 μL遠心フィルターカラムに入れる。
   3. 室温で14,000 x g で30分間スピンします。必要なサンプル量が遠心フィルタ列の容量を超えた場合は、必要に応じて繰り返します。
   4. 各カラム3xを400μLの脱イオン、ろ過水で洗浄します。フローを破棄します。
   5. フィルターを反転し、新鮮な、適切にラベル付けされたコレクションチューブで2,000 x g で1分間スピンします。80°Cで凍結するか、次のステップに進みます。
4. アクチナーゼE消化
   注:このステップは、サンプルからタンパク質汚染物質を消化し、最終的に除去するために必要です。
   1. サンプル1:1と組換えアクティナーゼEを10mg/mLの所望の濃度に混合します。10倍の消化バッファー濃縮物の適切な量を追加します。望ましい最終濃度:0.005 M酢酸カルシウムおよび0.01 M酢酸ナトリウム、pH 7.5。例えば、液体試料190μL、20mg/mLアクティナーゼEの190μL、0.05 M酢酸カルシウム20μL、0.1M酢酸ナトリウム。
   2. サンプルを軽く撹拌して混合し、55°Cで48-72時間消化します(組織全体で最大7日間)。
   3. 80°Cに加熱し、15〜20分間加熱し、アクチナーゼEを加熱します。
   4. サンプルを-80°Cで凍らせるか、ステップ1.5に進みます。
5. サンプル脱塩と濃度
   注:生物学的試料に目的のGAGの低質量が予想される場合、または消耗品試薬(すなわち遠心フィルタカラム)の保存が望ましい場合、サンプルをプールして実験群ごとに単一の濃縮物を生成することができる(例えば、生物学的複製、または実験群)。
   1. MWCO 3,000 Daの500 μL遠心フィルターカラムにサンプルの総量を入れる。
   2. 室温で14,000 x g で30分間スピンします。必要なサンプル量が遠心フィルタ列の容量を超えた場合は、必要に応じて繰り返します。
   3. 各カラム3xを400μLの脱イオン水で洗浄します。フローを破棄します。
   4. フィルターを反転し、2,000 x g で 1 分間スピンし、新しく適切にラベル付けされたコレクションチューブ (一般的に遠心フィルター列に含まれています) を使用します。80°Cで凍結するか、次のステップに進みます。
6. 乾燥
   1. ステップ1.5.5から溶解したサンプルを一晩回転真空濃縮器に入れるか、以下の詳細に従ってサンプルを凍結乾燥させます。
   2. サンプルを-80°Cで一晩、または液体窒素に浸して完全に凍結します。
   3. サンプル蓋に18Gの針を突き刺し、凍結乾燥機室に入れます。必要に応じて、梱包用のペーパータオルを追加します。
   4. 凍結乾燥剤室を凍結乾燥剤に固定し、一晩乾燥を凍結する(少なくとも-40°C、0.135トール)
7. カチネーション交換列
   1. 8 M尿素の最大400 μL、2%のCHAPS溶液(または、プーリングサンプルの場合は、最大(400/n)μL(n =所望のプール内のサンプル数)に再中断して乾燥したサンプルを再中断します。できるだけ少ない洗剤溶液を使用してください。
   2. 8 M尿素、2%のCHAPS溶液の400 μLでカチオン交換(IEX)カラムを平衡化します。室温で2,000 x g で5分間スピンします。
   3. 400 μL のサンプル/プールされたサンプルを IEX カラムにロードします。2,000 x gで 5 分間スピンします。
   4. 3xを400 μLの8 M尿素、2%CHAPS溶液で洗浄します。毎回2,000 x g で5分間スピンします。
   5. 0.2 M NaClの400 μLのエルテ3x。2,000 x g で 5 分間スピンします。これは低親和性の分数です - これは必要に応じて品質管理のために保持することができます。
   6. 2.7 M (16%) NaCl の 400 μL を持つエルテ 3x。2,000 x g で 5 分間スピンします。この分数は、関心のある単離されたグリコサミノグリカンを含む - それのすべてを保ちます!
   7. 溶出した各分率を脱塩するには、メタノールを80体積%まで加え、一晩4°Cでインキュベートする。2,000 x gで 5 分間、各サンプルをスピンします。乾燥した脱塩グリコサミノグリカンとして固形残渣を回収する。
      注:または、このステップをスキップし、メタノールなしで溶出液を脱塩するためにステップ1.8に進みます。
8. サンプル脱塩と濃度
   1. 必要に応じて、分画を(1.7.6から)適切な実験群(例えば、生物学的複製、または実験群によって)に溶出させた。
   2. MWCO 3,000 Daの500 μL遠心フィルターカラムにサンプルの総量を入れる。
   3. 室温で14,000 x g で30分間スピンします。必要なサンプル量が遠心フィルタ列の容量を超えた場合は、必要に応じて繰り返します。
   4. 各カラム3xを400μLの脱イオン水で洗浄します。フローを破棄します。ステップ 1.9 に直接進みます。
9. コンドロイチン消化
   注: この手順の目的は、エンド ユーザーに関心がない GAGs を削除することです。この場合、コンドロイチンを除去するためにコンドロイチンーゼが使用される。 代表的な結果 (気管支肺胞洗浄液および肺全体)を生成するために使用される組織では、コンドロイチン硫酸を消化し、ヘパラン硫酸を一次残存GAGとして残す。エンドユーザーは、実験の目的に応じて追加の消化ステップを追加する必要があります。.
   1. 350 μLの消化バッファー(pH 7.0に調整された2mMの塩化カルシウムを含む酢酸アンモニウム50mM)を、膜に触れることなく遠心フィルターカラムに負荷を与えます。
   2. 組換えコンドロイチナーゼABCを5μL加えます。
   3. サンプルチューブを37°Cのオーブンに入れ、1時間インキュベートします。
   4. 柱を裏返し、適切なラベルの付いたコレクション チューブに配置します。2000 x gで 1 分間スピンします。
   5. サンプルを80°Cに15〜20分間加熱し、コンドロイチノーゼABCを不活性化します。
10. サンプル脱塩と濃度
    1. 必要に応じて、コンドロイチンはステップ1.9.5から適切な実験群(例えば、生物学的複製、または実験群によって)にサンプルを消化した
    2. サンプルの総体積を、MWCO 3,000 Daの500 μL遠心フィルターカラムに入れ
    3. 室温で14,000 x g で30分間スピンします。必要なサンプル量が遠心フィルタ列の容量を超えた場合は、必要に応じて繰り返します。
    4. 各カラム3xを400μLの脱イオン水で洗浄します。フローを破棄します。
    5. フィルターを反転し、新鮮な、適切にラベル付けされたコレクションチューブで2,000 x g で1分間スピンします。80°Cで凍結するか、次のステップに進みます。
11. 乾燥
    注: このステップでは、サンプルを水と流動バッファの最小量で再懸濁できるように、乾燥が必要です。
    1. ステップ 1.10.5 からコンドロイチン消化サンプルを一晩回転真空濃縮器に直接配置するか、次のように凍結乾燥します。
    2. サンプルを-80°Cで一晩、または液体窒素に浸して完全に凍結します。
    3. サンプル蓋に18Gの針を突き刺し、凍結乾燥機室に入れます。必要に応じて、梱包用のペーパータオルを追加します。
    4. 凍結乾燥剤室を凍結乾燥剤に固定し、一晩乾燥を凍結する(少なくとも40°C、0.135トール)

2. ポリアクリルアミドゲル電気泳動分解

1. ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)に必要な溶液を事前に準備する(表1)。
   注:サンプル中に含まれると予想されるグリコサミノグリカンのサイズに応じて、ゲル溶液を分解するアクリルアミドのパーセントを選択します。15%は、より大きな断片(長さ30個以上の二糖サブユニット)を解決するために推奨されます。小さい断片(<20の二糖サブユニットの長さ)の場合は22%。
2. ページタンクに空のカセットを入れます。溶解ゲルを次のようにキャストします:15 mLチューブに、10 mLの溶解ゲル溶液、60 μLの過硫酸アンモニウム(新鮮な調製が必要)、および10 μLのTEMED(最後にTEMEDを追加)を混合します。チューブを2~3倍にそっと反転します。ピペットを使用して、上記の10 mL溶液をカセットに素早く加えます。2 mLの脱イオン、ろ過水でオーバーレイし、30分間重合するゲルを分解することができます。
   注: 次の PAGE プロトコルは、13.3 x 8.7cm (幅 x 長さ) 1.0mm 厚さ鋳造カセットを使用する垂直 PAGE システムに最適化されており、総体積は約 12 mL です。他のカセットシステムは使用できますが、エンドユーザーによる最適化が必要な場合があります。
3. 溶解ゲルが完全に重合した後、重ね合わされた水を捨て、積層ゲルを次のように投げ出します:15 mLチューブに3mLの積み重ねゲル溶液、10%の硫酸アンモニウム(新たに調製する必要があります)の90 μL、TEMEDの3 μL(最後にTEMEDを追加)。
4. チューブを2~3倍にそっと反転します。ピペットを使用して、固化した溶解ゲルの上に積み重ねゲル溶液を素早く追加します。つばにカセットを充填します。セットアップに付属のコームを完全に挿入します。積み重ねゲルを30分間重合させます。
5. ゲルが重合したら、テープストリップをカセットの底部から取り出し、カセットをPAGEタンクアセンブリに戻します。
6. 上下のチャンバーにそれぞれ上下のチャンバーバッファを充填します。
7. 乾燥したサンプルを、最小必要量の脱イオン水、ろ過水(せいぜい、PAGEゲル内のウェルの体積の50%)に溶解します。サンプルの負荷バッファーと 1:1 を混合します。サンプルとHSオリゴ糖「はしご」( 表1参照)をゲルに入れます。
8. ゲルを100Vで5分間事前に実行します。その後、20〜25分間(15%ポリアクリルアミド溶解ゲルの場合)、40〜50分(18%ポリアクリルアミド溶解ゲルの場合)、90-100分(22%ポリアクリルアミド溶解ゲル用)の200Vでゲルを実行します。
   注: 200 V の実行時間の最適化が必要な場合があります。フェノールレッドは、長さが2重合サブユニットであるヘパリンオリゴ糖の前に移動します(すなわち、重合度2、またはdp2)。ブロモフェノールブルーはdp10-dp14より先に移行します。フェノールレッドバンドがゲルの底にほとんど(かなり)移行するような電圧が印加されると、最良の結果が得られます。それに応じて実行時間を調整します。

3. シルバー染色プロトコル

1. 銀染色に必要な全てのソリューションを事前に準備する(表2)。
   注意:PAGEゲルが染色され、開発され、停止溶液に入れられるまで、PAGEゲルに直接触れないでください。代わりに、きれいなプラスチックまたはガラスのツールを使用してゲルを操作します。ゲルを直接取り扱うと、染色後に指プリントの歪みやゲルに目に見えるアーティファクトが生じます。
2. 実行が完了したら、カセットを分解し、脱イオンしたろ過水で満たされた清潔で中規模の容器にゲルを抽出します。
   注:ゲルを直接扱わないように、ピペットチップやその他のプラスチック製の物体を使用して、水に沈めながらカセットからゲルをそっと剥がしてください。ゲルは壊れやすいかもしれません - 慎重に扱います。
   1. 水を捨てる。ゲルをアルシアンブルー染色液で5分間染色します。
   2. アルシアブルーの汚れを捨てる。アルシアブルー染色液の大部分が除去されるまで、2-3倍の脱イオンで2-3倍の水を素早く洗い流します。
   3. ロッカーに一晩脱イオン、ろ過水で脱染色することを可能にします。十分な量の脱イオン、ろ過水が存在することを確認して、残留汚れがゲルから一晩完全に洗い流されるようにします。
   4. 50%メタノールでゲルを洗浄(合計40分、溶液を2~3倍に変える)
   5. 脱イオン化し、30分間濾過した水でゲルを洗浄します。水を捨て、合計2時間でさらに3回繰り返し、毎回水を交換します。
   6. 新鮮で清潔な容器に、硝酸銀染色液で30分間ゲルを染色します。
   7. 脱イオン化されたろ過水で2〜3倍速く洗い流し、銀染色液を完全に除去します。
   8. 脱イオン、ろ過水で30分間洗浄します。水を捨て、合計90分間2倍を繰り返し、毎回水浴を交換します。
   9. 水を捨て、開発ソリューションを追加します。
   10. 開発溶液を加えたら、ゲルを注意深く観察し、バンドの出現を見守ります。汚れの品質とサンプルの質量に応じて、開発は数秒から数分かかる場合があります。
   11. 目的のバンドが見えなければすぐに、現像液をすぐに捨て、停止溶液で短時間洗います。
   12. 洗浄を停止液を廃棄し、新しい停止溶液に交換します。ロッカーまたはシェーカーに1時間浸漬します。
   13. 脱イオン化された濾過水で一晩洗浄する(ただし、ゲルは溶液洗浄を停止した直後に画像化することができる)。

結果

アルシアンブルーは、硫酸化GAGs ¹⁰を染色するために使用されます。この信号は、後続の銀染色 ¹¹を用いて増幅される。 図1 は、銀染色開発プロセスの視覚的なデモンストレーションを示しています。実証されるように、電気泳動によって分離されたGAGを表すアルシアンブルー信号は、現像剤がポリアクリルアミドゲルに浸透するにつ...

ディスカッション

GAGsは、多くの多様な生物学的プロセスにおいて中心的な役割を果たしています。硫酸化GAGs(HSやCSなど)の主な機能の1つは、リガンドと相互作用して結合し、下流のシグナル伝達機能を変化させることです。コグネイトリガンドに対するGAG結合親和性の重要な決定要因は^{、GAGポリマー鎖8、9、14}の長さである。 このため、研?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge	thermoFisher Scientific	13-100-675	Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate
Acrylamide (solid)	thermoFisher Scientific	BP170-100	Electrophoresis grade
Actinase E	Sigma Aldrich	P5147	Protease mix from S. griseus
Alcian Blue 8GX (solid)	thermoFisher Scientific	AC400460100
Ammonium acetate (solid)	thermoFisher Scientific	A639-500	Molecular biology grade
Ammonium hydroxide (liquid)	thermoFisher Scientific	A669S-500	certified ACS
Ammonium persulfate (solid)	thermoFisher Scientific	BP179-25	electrophoresis grade
Barnstead GenPure Pro Water Purification System	ThermoFisher Scientific	10-451-217PKG	Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute
Boric acid (solid)	thermoFisher Scientific	A73-500	Molecular biology grade
Bromphenol blue (solid)	thermoFisher Scientific	B392-5
Calcium acetate (solid)	ThermoFisher Scientific	18-609-432	Molecular biology grade
Calcium chloride (solid)	ThermoFisher Scientific	AC349610250	Molecular biology grade
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)	ThermoFisher Scientific	28299
Chondroitinase ABC	Sigma Aldrich	C3667
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)	Bio-Rad	3459901	Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)	Bio-Rad	1656019	any comparable vertical gel PAGE system will work)
Dichloromethane (liquid)	thermoFisher Scientific	AC610931000	certified ACS
EDTA disodium salt (solid)	thermoFisher Scientific	02-002-786	Molecular biology grade
Glacial acetic acid (liquid)	thermoFisher Scientific	A35-500	Certified ACS
Glycine (solid)	thermoFisher Scientific	G48-500	Electrophoresis grade
Heparanase I/III	Sigma Aldrich	H3917	From Flavobacterium heparinum
Heparin derived decasaccharide (dp10)	galen scientific	HO10
Heparin derived hexasaccharde (dp6)	Galen scientific	HO06
Heparin derived oligosaccharide (dp20)	galen scientific	HO20
Hydrochloric acid (liquid)	thermoFisher Scientific	A466-250
Lyophilizer	Labconco	7752020	Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator
Methanol (liquid)	thermoFisher Scientific	A412-500	Certified ACS
Molecular Imager Gel Doc XR System	Bio-Rad	170-8170	Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid)	thermoFisher Scientific	BP171-25	Electrophoresis grade
Phenol red (solid)	thermoFisher Scientific	P74-10	Free acid
Q Mini H Ion Exchange Column	Vivapure	VS-IX01QH24	Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11
Silver nitrate (solid)	thermoFisher Scientific	S181-25	certified ACS
Sodium Acetate (solid)	ThermoFisher Scientific	S210-500	Molecular biology grade
Sodium chloride (solid)	thermoFisher Scientific	S271-500	Molecular biology grade
Sodium hydroxide (solid)	thermoFisher Scientific	S392-212
Sucrose (solid)	thermoFisher Scientific	BP220-1	Molecular biology grade
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine)	thermoFisher Scientific	BP150-20	Electrophoresis grade
Tris base (solid)	thermoFisher Scientific	BP152-500	Molecular biology grade
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff	Amicon	UFC500324	Larger volume filter units may be used, depending on sample size.
Urea (solid)	ThermoFisher Scientific	29700
Vacufuge Plus	Eppendorf	22820001	Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume	thermoFisher Scientific	569-0020	Alternative volumes and filter materials acceptable