Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu rapor, sülfatlı glikozaminolikanları (GAG) biyolojik örneklerden izole etme ve arındırma tekniklerini ve yaklaşık boyutlarına yönelik bir poliakrilamid jel elektroforez yaklaşımını açıklar. GAG'ler proteinlerle elektrostatik etkileşim yoluyla doku yapısına ve etki sinyalizasyon süreçlerine katkıda bulunur. GAG polimer uzunluğu, konyak ligandları için bağlayıcı yakınlıklarına katkıda bulunur.

Özet

Heparan sülfat (HS) ve kondroitin sülfat (CS) gibi sülfatlı glikozaminojenler (GAG' ler) canlı organizmalarda her yerde bulunur ve çeşitli temel biyolojik yapılarda ve süreçlerde kritik bir rol oynar. Polimerler olarak, GAG'ler 4000 Da ile 40.000 Da arasında değişebilen polisakkarit zincirleri içeren bir polidisperz karışımı olarak bulunur. Bu zincirlerde, kognate protein ligandlarının pozitif yüklü kalıntılarıyla etkileşimi kolaylaştıran bir negatif yük deseni veren sülfatlama alanları vardır. GAG'lerin sülfatlı etki alanları, bu elektrostatik etkileşimlere izin vermek için yeterli uzunlukta olmalıdır. GAG'lerin biyolojik dokulardaki işlevini anlamak için, araştırmacı GAG'lerin boyutunu izole edebilmeli, arındırabilmeli ve ölçebilmelidir. Bu rapor, çeşitli biyolojik doku tiplerinden izole edilen GAG'ler arasındaki nispeten küçük boyut farklılıklarını çözmek için yararlanılabilen pratik ve çok yönlü poliakrilamid jel elektroforez bazlı bir tekniği açıklar.

Giriş

Glikozaminogllikanlar (GAG'lar), canlı organizmalarda her yerde bulunan ve birçok temel fizyolojik işleme katkıda bulunan doğrusal polisakkaritlerin çeşitli bir ailesidir1. Heparan sülfat (HS) ve kondroitin sülfat (CS) gibi GAG'ler polisakkarit zinciri boyunca farklı konumlarda sülfatlanabilir ve negatif yük coğrafi etki alanları verebilir. Bu GAG'ler, proteoglikanlar olarak bilinen hücre yüzeyi proteinlerine bağlandığında, hücre dışı alana yansıtır ve konyak ligandlarına bağlanır, hem cis- (aynı hücreye bağlı ligand) hem de trans- (komşu hücreye bağlı ligand) sinyal işlemlerinin düzenlenmesine izin verir2. Ayrıca, GAG'ler ayrıca glomerüler bodrum membranı3, vasküler endotel glikokaleks 4 ve pulmoner epitel glikokaleks5 ve kıkırdak6gibi bağdokularında yapısal elemanlar olarak kritik roller üstlenir.

GAG polisakkarit zincirlerinin uzunluğu biyolojik bağlamlarına göre önemli ölçüde değişir ve son derece karmaşık bir enzymatic düzenleyici sistem tarafından dinamik olarak uzatılabilir, bölünebilir ve değiştirilebilir7. Daha da önemlisi, GAG polimer zincirlerinin uzunluğu, ligandlar için bağlayıcı yakınlıklarına ve daha sonra biyolojik işlevlerine önemli ölçüde katkıda bulunur8,9. Bu nedenle, endojen bir GAG işlevinin belirlenmesi, boyutunun takdirini gerektirir. Ne yazık ki, proteinlerin ve nükleik asitlerin aksine, tarihsel olarak bu çeşitli polisakkarit ailesinin biyolojik rolleri hakkında nispeten sınırlı bir araştırma ile sonuçlanan GAG'leri tespit etmek ve ölçmek için çok az sayıda hazır teknik mevcuttur.

Bu makalede, GAG'lerin çoğu biyolojik dokudan nasıl izole ve saflaştırılacağı ve ayrıca izole polimerlerin uzunluğunu adil bir özgüllük derecesiyle değerlendirmek için poliakrilamid jel elektroforezinin (PAGE) nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Diğer, son derece karmaşık (ve genellikle kütle spektrometrisi bazlı) glikonik yaklaşımların aksine, bu yöntem standart laboratuvar ekipmanları ve teknikleri kullanılarak kullanılabilir. Bu nedenle, bu pratik yaklaşım, araştırmacıların yerel GAG'lerin biyolojik rolünü ve bağlamsal olarak önemli ligandlarla etkileşimlerini belirleme yeteneklerini genişletebilir.

Protokol

Bu protokolde analiz edilen tüm biyolojik örnekler, Colorado Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokoller kapsamında farelerden elde edildi.

1. Heparan sülfat izolasyonu

  1. Doku örneklerinin delipidasyonu
    NOT: Delipidasyon yağ bakımından zengin dokular için isteğe bağlı bir adımdır.
    1. Metanol ve dikloromethane karışımı 1:1 yapın. Numune başına yaklaşık 500 μL hazırlayın; daha büyük doku parçaları 1 mL'ye kadar sürebilir.
    2. Her doku örneğini, delipidasyon için kapaklı küçük bir cam kaba yerleştirin.
      NOT: Örnek kitle, ilgi çekici doku ve deneysel ihtiyaçlara göre değişebilir. 50 mg veya daha az genellikle yeterli GAG verimi için yeterlidir, ancak son kullanıcı tarafından bazı optimizasyon gerekebilir.
    3. Her cam kaba 500 μL metanol:dikloromethane çözeltisi ekleyin ve karıştırın. Tüm katı doku örneklerinin tamamen çözücüye batırıldığından emin olun.
      NOT: Metanol/dikloromethane çözeltisini karıştırmak ve işlemek için serolojik pipetler veya plastik konik tüpler kullanın; diğer plastikler çözünebilir.
    4. Numuneleri kimyasal duman kaputuna bir çalkalayıcıya (güvenli rafa) yerleştirin ve 1 saat boyunca hafifçe çalkalayın.
    5. Numuneleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 17.000 x g'da karıştırmak ve santrifüj etmek için ajite edin.
    6. Organik çözücü fraksiyonunu (süpernatant) dikkatlice pipetle atın. Bu lipid fraksiyonudur - GAG içermez ve atılabilir.
      NOT: Küçük parçalar kaybolabileceği için dokuyu rahatsız etmemeye çalışın. Numune kaybını riske atmak yerine organik tabakanın bir kısmını numune kabında bırakmak tercih edilir.
    7. Cam kabın kapağını açık bırakın ve kaputta gece boyunca buharlaşmasına izin verin. Bu tüpler daha fazla işleme devam etmeyeceği için bir sonraki adım için tüpü değiştirin.
    8. Solvent karışımı tamamen buharlaştıktan sonra, mekanik parçalanma (artık numune >50 mg ise) veya Actinase E sindirimine (< 50 mg) devam edin.
  2. Katı dokunun mekanik parçalanması (isteğe bağlı; daha büyük doku örnekleri için)
    NOT: Katı dokunun çoğu küçük parçası (yaklaşık 50 mg veya daha az) sindirim adımı sırasında tamamen çözülmelidir. Bununla birlikte, daha büyük numuneler mekanik parçalanma gerektirecektir.
    1. Uygun büyüklükteki polipropilen tüpe yerleştirerek ve kapalı tüpü sıvı nitrojene yerleştirerek ilgi çekici numuneleri flaş dondurun. Numunenin tamamen katı olana kadar donmasına izin verin.
    2. Temiz bir harç ve pestle kullanarak donmuş numuneleri toz benzeri bir kıvamda öğütün.
    3. Doğrudan Actinase E sindirimine geçin (Adım 1.4).
  3. Numune tuzdan arındırma ve konsantrasyon
    NOT: Bu isteğe bağlı bir adımdır ve yalnızca seyreltilmiş sıvı doku örnekleri (örneğin, bronko-alveolar lavaj sıvısı (BALF) veya plazma) için gereklidir.
    1. Sıvı numuneleri uygun deneysel gruplar halinde havuzlayın (örneğin, biyolojik çoğaltma veya deneysel grup tarafından)
    2. Toplam numune hacmini 3.000 Da moleküler ağırlık kesme (MWCO) ile 500 μL santrifüj filtre sütununa yerleştirin.
    3. Oda sıcaklığında 14.000 x g'da 30 dakika döndürün. İstenen örnek hacmi santrifüj filtre sütununun kapasitesini aşarsa gerektiği gibi yineleyin.
    4. Her sütunu 3x 400 μL deiyonize, filtrelenmiş su ile yıkayın. Akışı atın.
    5. Filtreyi ters çevirin ve taze, uygun şekilde etiketlenmiş toplama tüplerinde 2.000 x g'da 1 dakika döndürün. -80 °C'de dondurun veya bir sonraki adıma geçin.
  4. Actinase E sindirimi
    NOT: Bu adım, numunenizdeki protein kirleticileri sindirmek ve sonuçta çıkarmak için gereklidir.
    1. Örnekleri 1:1 rekombinant Actinase E ile 10 mg/mL'lik istenen konsantrasyonda karıştırın. Uygun hacimde 10x sindirim tampon konsantresi ekleyin. İstenen son konsantrasyon: 0.005 M kalsiyum asetat ve 0.01 M sodyum asetat, pH 7.5. Örneğin: 190 μL sıvı numunesi, 190 μL 20 mg/mL Actinase E, 20 μL 0.05 M kalsiyum asetat, 0.1 M sodyum asetat.
    2. Örnekleri karıştırmak için hafifçe çalkalayın, ardından 55 ° C'de 48-72 saat boyunca sindirin (tüm doku için 7 güne kadar).
    3. Actinase E'yi inaktive etmek için 15-20 dakika boyunca 80 °C'ye ısıtın.
    4. Numuneyi -80 °C'de dondurun veya 1,5 adıma devam edin.
  5. Numune tuzdan arındırma ve konsantrasyon
    NOT: Biyolojik numunede ilgi çekici GAG'ın düşük bir kütlesi bekleniyorsa veya sarf malzemesi reaktiflerinin (yani santrifüj filtre sütunlarının) korunması isteniyorsa, numuneler deneysel grup başına tek bir konsantre üretmek için birleştirilebilir (örneğin, biyolojik çoğaltma veya deneysel grup tarafından).
    1. Toplam numune hacmini 3.000 Da MWCO'lu 500 μL santrifüj filtre sütununa yerleştirin.
    2. Oda sıcaklığında 14.000 x g'da 30 dakika döndürün. İstenen örnek hacmi santrifüj filtre sütununun kapasitesini aşarsa, gerektiği gibi yineleyin.
    3. Her sütunu 400 μL deiyonize, filtrelenmiş su ile 3x yıkayın. Akışı atın.
    4. Filtreyi ters çevirin ve taze, uygun şekilde etiketlenmiş toplama tüplerinde 2.000 x g'da 1 dakika döndürün (genellikle santrifüj filtre sütunlarına dahildir). -80 °C'de dondurun veya bir sonraki adıma geçin.
  6. Tahliye
    1. 1.5.5. adımdaki çözünmüş numuneleri bir gecede dönüşümlü vakum konsantratörüne yerleştirin veya numuneleri aşağıda ayrıntılı olarak belirtildiği gibi liyofilize edin.
    2. Numuneleri -80 °C'de gece boyunca veya sıvı nitrojene batırarak iyice dondurun.
    3. Numune kapaklarını 18 G iğne ile delin ve liyofilzer odasına yerleştirin. Gerektiğinde paketleme için kağıt havlu ekleyin.
    4. Lyophilizer odasını liyofilzere sabitle ve bir gecede kuru dondur (en az -40 °C, 0.135 Torr)
  7. Katyon değişimi sütunu
    1. 400 μL'ye kadar 8 M üre, %2 CHAPS çözeltisi (veya numuneleri birikiyorsa, en fazla (400/n) μL'ye kadar yeniden depolanmış numuneleri yeniden depolar, burada n = istenen havuzdaki numune sayısı. Deterjan çözeltisini mümkün olduğunca az kullanın.
    2. Katyon değişimi (IEX) sütununu 400 μL 8 M üre, %2 CHAPS çözeltisi ile dengeler. Oda sıcaklığında 2.000 x g'da 5 dakika döndürün.
    3. IEX sütununa 400 μL numune/havuza numune yükleyin. 2.000 x g'da 5 dakika döndürün.
    4. 3x'i 400 μL 8 M üre, %2 CHAPS çözeltisi ile yıkayın. Her zaman 2.000 x g'da 5 dakika döndürün.
    5. 400 μL 0,2 M NaCl ile Elute 3x. Her biri 2.000 x g'da 5 dakika döndürün. Bu düşük benzeşim fraksiyonudur - istenirse kalite kontrol amacıyla tutulabilir.
    6. 2,7 M (%16) NaCl'nin 400 μL'si ile 3x elute. Her biri 2.000 x g'da 5 dakika döndürün. Bu fraksiyon, ilgi çekici izole glikozaminoglenkanları içerecektir - hepsini saklayın!
    7. Her bir eluted fraksiyonunu tuzdan arındırmak için, %80 vol'a kadar metanol ekleyin ve bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın. Her numuneyi 2.000 x g'da 5 dakika döndürün. Bu kurutulmuş tuzsuz glikozaminoglenik olduğu için katı kalıntıyı geri kazan.
      NOT: Alternatif olarak, bu adımı atlayın ve metanol olmadan eluate tuzdan arındırmak için 1.8 adımına geçin.
  8. Numune tuzdan arındırma ve konsantrasyon
    1. Gerekirse, havuz eluted fraksiyonları (1.7.6 itibaren) uygun deneysel gruplara (örneğin, biyolojik çoğaltma veya deneysel grup tarafından).
    2. Toplam numune hacmini 3.000 Da MWCO'lu 500 μL santrifüj filtre sütununa yerleştirin.
    3. Oda sıcaklığında 14.000 x g'da 30 dakika döndürün. İstenen örnek hacmi santrifüj filtre sütununun kapasitesini aşarsa, gerektiği gibi yineleyin.
    4. Her sütunu 400 μL deiyonize, filtrelenmiş su ile 3x yıkayın. Akışı atın. Doğrudan 1.9 adımına geçin.
  9. Kondroitin sindirimi
    NOT: Bu adımın amacı, son kullanıcının ilgisini çekmeyen GAG'leri kaldırmaktır. Bu durumda, kondroitini çıkarmak için kondroitinaz kullanılır. Temsili Sonuçlar (bronko-alveolar lavaj sıvısı ve tüm akciğer) üretmek için kullanılan dokularda, kondroitin sülfatın sindirilmesi heparan sülfatını birincil artık GAG olarak bırakır. Son kullanıcıların deneysel amaçlarına bağlı olarak ek sindirim adımları eklemeleri gerekebilir.
    1. Membrana dokunmadan santrifüj filtre sütununa 350 μL sindirim tamponu (pH 7.0'a ayarlanmış 2 mM kalsiyum klorürlü 50 mM amonyum asetat) yükleyin.
    2. 5 μL rekombinant kondroitinaz ABC ekleyin.
    3. Numune tüpünü 37 °C fırına yerleştirin ve 1 saat kuluçkaya yatırın.
    4. Sütunu ters çevirin ve uygun şekilde etiketlenmiş toplama tüplerine yerleştirin. 2000 x g'da 1 dakika döndürün.
    5. Kondroitinaz ABC'yi inaktive etmek için 15-20 dakika boyunca 80 °C'ye ısı örnekleri.
  10. Numune tuzdan arındırma ve konsantrasyon
    1. Gerekirse, havuz kondroitin 1.9.5 adımından uygun deneysel gruplara (örneğin, biyolojik çoğaltma veya deneysel grup tarafından) sindirilmiş örnekler
    2. Toplam numune hacmini 3.000 Da MWCO'lu 500 μL santrifüj filtre sütununa yerleştirin.
    3. Oda sıcaklığında 14.000 x g'da 30 dakika döndürün. İstenen numune hacmi santrifüj filtre sütununun kapasitesini aşarsa gerektiği gibi yineleyin.
    4. Her sütunu 400 μL deiyonize, filtrelenmiş su ile 3x yıkayın. Akışı atın.
    5. Filtreyi ters çevirin ve taze, uygun şekilde etiketlenmiş toplama tüplerinde 2.000 x g'da 1 dakika döndürün. -80 °C'de dondurun veya bir sonraki adıma geçin.
  11. Tahliye
    NOT: Bu adımda, numunelerin mümkün olan en küçük miktarda su ve çalışan tamponda yeniden kullanılabilmesi için kurutma gereklidir.
    1. 1.10.5 adımındaki kondroitin sindirilmiş örnekleri bir gecede doğrudan rotasyonel vakum konsantratörüne yerleştirin veya aşağıdaki gibi liyofilize edin:
    2. Numuneleri -80 °C'de gece boyunca veya sıvı nitrojene batırarak iyice dondurun.
    3. Numune kapaklarını 18 G iğne ile delin ve liyofilzer odasına yerleştirin. Gerektiğinde paketleme için kağıt havlu ekleyin.
    4. Liyofilizör odasını liyofilzere sabitle ve bir gecede kuru dondur (en az 40 °C, 0.135 Torr)

2. İzole edilmiş ve saflaştırılmış glikozaminolikanların poliakrilamid jel elektroforezi

  1. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) için gerekli çözümleri önceden hazırlayın (Tablo 1).
    NOT: Numunede olması beklenen glikozaminoglisekanların büyüklüğüne bağlı olarak jel çözeltisini çözmenin yüzde akrilamidini seçin. Daha büyük parçaların çözümü için% 15 önerilir (uzunluğu 30'dan fazla disakkarit alt biri); Daha küçük parçalar için %22 (<20 disakkarit alt birikmiş uzunlukta).
  2. PAGE tankına boş kaset yerleştirin. Çözme jelini aşağıdaki gibi dökun: 15 mL'lik tüpte, 10 mL çözelti çözeltisini, 60 μL% 10 amonyum persülfatı (taze hazırlanmış olmalıdır) ve 10 μL TEMED'i karıştırın (en son TEMED ekleyin). Tüpü hafifçe 2-3x ters çevirin. Yukarıdaki 10 mL'lik çözeltiyi kasete hızlı bir şekilde eklemek için pipet kullanın. 2 mL deiyonize, filtrelenmiş su ile kaplama ve çözme jelinin 30 dakika polimerize olmasını sağlar.
    NOT: Aşağıdaki PAGE protokolü, toplam hacmi yaklaşık 12mL olan 13,3 x 8,7 cm (genişlik x uzunluk) 1,0 mm kalınlığında döküm kasetler kullanılarak dikey bir PAGE sistemi için optimize edilmiştir. Diğer kaset sistemleri kullanılabilir, ancak son kullanıcı tarafından optimizasyon gerektirebilir.
  3. Çözme jeli tamamen polimerize olduktan sonra, kaplanmış suyu atın ve istifleme jelini aşağıdaki gibi dökin: 15 mL'lik bir tüpte, istifleme jeli çözeltisinin 3 mL'sini, 90 μL% 10 amonyum persülfatını karıştırın (taze hazırlanmış olmalıdır), 3 μL TEMED (en son TEMED ekleyin).
  4. Tüpü hafifçe 2-3x ters çevirin. İstifleme jeli çözeltisini katılaştırılmış çözümleme jelinin üzerine hızlı bir şekilde eklemek için bir pipet kullanın; kaseti ağzına kadar doldurun. Kurulumla birlikte gelen tarağı tamamen yerleştirin. İstifleme jelinin 30 dakika polimerize olmasını izin verin.
  5. Jel polimerize olduktan sonra, bant şeridinin kasetin altından çıkarıldığından emin olun ve kaseti PAGE tank tertibatına geri yerleştirin.
  6. Üst ve alt odaları sırasıyla üst ve alt oda tamponu ile doldurun.
  7. Kurutulmuş numuneleri adım 1.11.4'ten itibaren gerekli minimum deiyonize, filtrelenmiş su hacminde (PAGE jeldeki kuyuların hacminin en fazla% 50'si) çözün. 1:1'i örnek yükleme tamponu ile karıştırın. Numuneleri ve HS oligosaccharide "merdivenlerini" (bkz. Tablo 1)jel içine yükleyin.
  8. Jeli 100 V'ta 5 dakika önceden çalıştırın. Daha sonra jeli 20-25 dakika (%15 poliakrilamid çözme jeli için), 40-50 dk (%18 poliakrilamid çözme jeli için), 90-100 dk (%22 poliakrilamid çözme jeli için) için 200 V'de çalıştırın.
    NOT: 200 V çalışma süresinin bazı optimizasyonları gerekebilir. Fenol kırmızısı, uzunluğu 2 polimer alt biri olan heparin oligosakkaritlerin önünde göç eder (yani, polimerizasyon derecesi 2 veya dp2); bromophenol mavisi dp10-dp14'ün önüne geçirir. En iyi sonuçlar, voltaj uygulandığında, fenol kırmızı bandı neredeyse, ancak tam olarak değil, jelin dibine göç eder. Çalışma süresini buna göre ayarlayın.

3. Gümüş boyama protokolü

  1. Gümüş boyama için gerekli tüm çözümleri önceden hazırlayın (Tablo 2).
    NOT: PAGE jel lekelenene, geliştirilene ve durdurma çözeltisine yerleştirilene kadar doğrudan dokunmayın. Bunun yerine, temiz plastik veya cam aletler kullanarak jeli manipüle edin. Jelin doğrudan işlenmesi, boyamadan sonra jel üzerinde parmak izi bozulmalarına ve diğer görünür yapıtlara neden olur.
  2. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, kaseti sökün ve deiyonize, filtrelenmiş su ile dolu temiz, orta-büyük bir kapta jel çıkarın.
    NOT: Jelin doğrudan işlenmesini önlemek için pipet ucu veya başka bir plastik nesne kullanarak jeli suya batırılmış halde kasetten hafifçe uzaklaştırın. Jel kırılgan olabilir - dikkatlice ele alın.
    1. Suyu atın. Jeli Alcian mavisi boyama çözeltisinde 5 dakika lekelenin.
    2. Alcian mavi lekesi atın. Alcian mavi boyama çözeltisinin çoğu çıkarılana kadar 2-3x'i deiyonize, filtrelenmiş suyla hızlı bir şekilde durulayın/yıkayın.
    3. Rocker'da bir gecede deiyonize, filtrelenmiş suda lekeyi bırakın. Artık lekelerin jelden bir gecede tamamen yıkanmasını sağlamak için bol miktarda deiyonize, filtrelenmiş su olduğundan emin olun.
    4. Jeli% 50 metanolde yıkayın (toplam 40 dk, çözeltiyi 2-3x değiştirin).
    5. Jeli deiyonize, filtrelenmiş suda 30 dakika yıkayın. Suyu atın ve her seferinde suyu değiştirerek toplam 2 saat boyunca 3 kez daha tekrarlayın.
    6. Taze, temiz bir kapta, jeli gümüş nitrat boyama çözeltisinde 30 dakika lekeleyin.
    7. Gümüş boyama çözeltisini tamamen çıkarmak için deiyonize, filtrelenmiş suda 2-3x hızlı bir şekilde durulayın/yıkayın.
    8. Deiyonize, filtrelenmiş suda 30 dakika yıkayın. Suyu atın ve her seferinde su banyoyu değiştirerek toplam 90 dakika boyunca 2x tekrarlayın.
    9. Suyu atın ve gelişmekte olan çözeltiyi ekleyin.
    10. Çözelti geliştikten sonra, jeli dikkatlice gözlemleyin ve bantların görünümünü izleyin. Lekenin kalitesine ve yüklenen numunenin kütlesine bağlı olarak, geliştirme birkaç saniyeden birkaç dakikaya kadar sürebilir.
    11. İstenilen bantlar görünür olur olmaz, gelişen çözeltiyi hemen atın ve durdurma çözeltisi ile kısa bir süre yıkayın.
    12. Durdurma çözeltisi yıkamayı atın ve yeni durdurma çözeltisi ile değiştirin. Bir rocker veya çalkalayıcı üzerinde 1 saat bekletin.
    13. Deiyonize, filtrelenmiş suda bir gecede yıkayın (ancak, jel durdurma çözeltisi yıkamadan hemen sonra görüntülenebilir).

Sonuçlar

Alcian mavisi sülfatlı GAG 10'ulekelemede kullanılır; bu sinyal, sonraki gümüş leke 11kullanılarak yükseltilir. Şekil 1, gümüş boyama geliştirme sürecinin görsel bir gösterimini sağlar. Gösterildiği gibi, elektroforez ile ayrılmış GAG'leri temsil eden Alcian mavi sinyali, gelişen ajan poliakrilamid jeline nüfuz ettikçe yükseltilir. Tipik olarak, gelişen süreç gümüş ve Alcian mavi lekeli GAG'leri yoğunluğa bağ...

Tartışmalar

GAG'ler birçok farklı biyolojik proseste merkezi bir rol oynar. Sülfatlı GAG'lerin (HS ve CS gibi) temel işlevlerinden biri, aşağı akış sinyal fonksiyonlarını değiştirebilen ligandlarla etkileşime girmek ve ligandlara bağlanmaktır. Gag bağlama benzeşiminin konyak ligandlarına önemli bir belirleyicisi GAG polimer zincirinin uzunluğu 8,9,14. Bu nedenle, araştırmacıların biyolojik ilgi örneklerinden izole...

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL ve EPS) tarafından finanse edildi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Accuspin Micro17 benchtop microcentrifugethermoFisher Scientific13-100-675Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate
Acrylamide (solid)thermoFisher ScientificBP170-100Electrophoresis grade
Actinase ESigma AldrichP5147Protease mix from S. griseus
Alcian Blue 8GX (solid)thermoFisher ScientificAC400460100
Ammonium acetate (solid)thermoFisher ScientificA639-500Molecular biology grade
Ammonium hydroxide (liquid)thermoFisher ScientificA669S-500certified ACS
Ammonium persulfate (solid)thermoFisher ScientificBP179-25electrophoresis grade
Barnstead GenPure Pro Water Purification SystemThermoFisher Scientific10-451-217PKGAny water deionizing/ purification system is an acceptable substitute
Boric acid (solid)thermoFisher ScientificA73-500Molecular biology grade
Bromphenol blue (solid)thermoFisher ScientificB392-5
Calcium acetate (solid)ThermoFisher Scientific18-609-432Molecular biology grade
Calcium chloride (solid)ThermoFisher ScientificAC349610250Molecular biology grade
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate)ThermoFisher Scientific28299
Chondroitinase ABCSigma AldrichC3667
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells)Bio-Rad3459901Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply)Bio-Rad1656019any comparable vertical gel PAGE system will work)
Dichloromethane (liquid)thermoFisher ScientificAC610931000certified ACS
EDTA disodium salt (solid)thermoFisher Scientific02-002-786Molecular biology grade
Glacial acetic acid (liquid)thermoFisher ScientificA35-500Certified ACS
Glycine (solid)thermoFisher ScientificG48-500Electrophoresis grade
Heparanase I/IIISigma AldrichH3917From Flavobacterium heparinum
Heparin derived decasaccharide (dp10)galen scientificHO10
Heparin derived hexasaccharde (dp6)Galen scientificHO06
Heparin derived oligosaccharide (dp20)galen scientificHO20
Hydrochloric acid (liquid)thermoFisher ScientificA466-250
LyophilizerLabconco7752020Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator
Methanol (liquid)thermoFisher ScientificA412-500Certified ACS
Molecular Imager Gel Doc XR SystemBio-Rad170-8170Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid)thermoFisher ScientificBP171-25Electrophoresis grade
Phenol red (solid)thermoFisher ScientificP74-10Free acid
Q Mini H Ion Exchange ColumnVivapureVS-IX01QH24Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11
Silver nitrate (solid)thermoFisher ScientificS181-25certified ACS
Sodium Acetate (solid)ThermoFisher ScientificS210-500Molecular biology grade
Sodium chloride (solid)thermoFisher ScientificS271-500Molecular biology grade
Sodium hydroxide (solid)thermoFisher ScientificS392-212
Sucrose (solid)thermoFisher ScientificBP220-1Molecular biology grade
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine)thermoFisher ScientificBP150-20Electrophoresis grade
Tris base (solid)thermoFisher ScientificBP152-500Molecular biology grade
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoffAmiconUFC500324Larger volume filter units may be used, depending on sample size. 
Urea (solid)ThermoFisher Scientific29700
Vacufuge PlusEppendorf22820001Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volumethermoFisher Scientific569-0020Alternative volumes and filter materials acceptable

Referanslar

  1. LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
  2. Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
  3. Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
  4. Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
  5. Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
  6. Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
  7. Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
  8. Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
  9. Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
  10. Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
  11. Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
  12. Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
  13. Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
  14. Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
  15. Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
  16. Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
  17. Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
  18. Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
  19. Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 168

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır