تصوير الكالسيوم المتزامن وتحفيز الجلوكوز في أسماك الزرد الحية للتحقيق في وظيفة الخلايا β في الجسم الحي

Summary

هنا ، تقدم الدراسة بروتوكولا لتصوير الكالسيوم وتحفيز الجلوكوز لخلايا البنكرياس β لأسماك الزرد في الجسم الحي.

Abstract

تحافظ خلايا البنكرياس β على توازن الجلوكوز الجهازي عن طريق إنتاج وإطلاق الأنسولين وفقا لمستويات الجلوكوز في الدم. ترتبط العيوب في وظيفة الخلايا β بارتفاع السكر في الدم الذي يمكن أن يؤدي إلى مرض السكري. أثناء عملية إفراز الأنسولين ، تتعرض الخلايا β لتدفق الكالسيوم²⁺. وبالتالي ، فإن تصوير تدفق Ca²⁺ المحفز بالجلوكوز باستخدام مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) يوفر وسيلة لدراسة وظيفة الخلية β. في السابق ، أظهرت الدراسات أن جزر الزرد المعزولة التي تعبر عن GCaMP6s تظهر نشاطا كبيرا من Ca²⁺ عند التحفيز بتركيزات محددة من الجلوكوز. ومع ذلك ، من الأهمية بمكان دراسة كيفية استجابة الخلايا β للجلوكوز ليس بمعزل عن غيرها ، ولكن في بيئتها الأصلية ، حيث تكون متصلة بشكل منهجي ، وأوعية الدموية ، ومعصبة بكثافة. تحقيقا لهذه الغاية ، استفادت الدراسة من الشفافية البصرية ليرقات الزرد في المراحل المبكرة من التطور لإلقاء الضوء على نشاط الخلايا β في الجسم الحي. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لتصوير Ca^{2 +} وتحفيز الجلوكوز للتحقيق في وظيفة β الخلية في الجسم الحي . تسمح هذه التقنية بمراقبة ديناميكيات Ca²⁺ المنسقة في خلايا β بدقة خلية واحدة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة للعمل مع أي محلول قابل للحقن مثل الجزيئات الصغيرة أو الببتيدات. إجمالا ، يوضح البروتوكول إمكانات نموذج أسماك الزرد للتحقيق في تنسيق الجزر في الجسم الحي وتوصيف كيفية تأثير المكونات البيئية والوراثية على وظيفة β الخلية.

Introduction

تظهر خلايا البنكرياس β قدرة فريدة على إفراز الأنسولين استجابة للجلوكوز. بعد تناول وجبة غنية بالكربوهيدرات ، يرتفع نسبة السكر في الدم ويدخل الخلايا β ، حيث يتم استقلابه بسرعة لإنتاج ATP. تؤدي الزيادة في النسبة داخل الخلايا ل ATP / ADP إلى إغلاق قنوات K ⁺ المعتمدة على ATP ، وإزالة استقطاب غشاء الخلية وتنشيط قنوات Ca²⁺ المعتمدة على الجهد. تحفز الزيادة السريعة في Ca²⁺ داخل الخلايا إفراز الأنسولين الحبيبي بواسطة الخلايا β.

يعد تصوير خلايا الجزر داخل البنكرياس السليم في الفئران أمرا صعبا ويتطلب إخراج العضو بأكمله. بديل قوي للتصوير غير الجراحي في الجسم الحي هو زرع الجزر الصغيرة في الغرفة الأمامية (AC) لعين الفئران¹. تحاكي الجزر المزروعة في مكيف الفئران بيئة في الجسم الحي ، مما يسمح بالدراسات الطولية وتصوير Ca²⁺ في الجسم الحي^2،3. ومع ذلك ، يمكن أن تستغرق عملية إعادة التوعي في الجزيرة عدة أسابيع بعد زرع الجزر⁴. وبالتالي ، فإن الحفاظ على البيئة الأصلية الأصلية ، حيث يتم إعادة الأوعية الدموية β والاتصال بالحالة الأيضية للكائن الحي ، وتحقيق دقة التصوير أحادية الخلية في الجسم الحي يظل أمرا صعبا للغاية ويستغرق وقتا طويلا.

للتغلب على هذه القيود ، طور الباحثون خطوطا معدلة وراثيا تعبر عن GECIs في الخلايا β ، والتي تسمح بالتصور في الوقت الفعلي لتدفق Ca²⁺ في الخلايا β^{5،6،7،8،9}. باستخدام هذه الأدوات ، وجد أنه في زراعة الخلايا ، تظهر خلايا β أسماك الزرد استجابة محفوظة للجلوكوز المرتفع ، على غرار الفئران والجزر البشرية. علاوة على ذلك ، سمح الوضوح البصري ليرقات الزرد بفحص وظيفة الخلايا β في بيئتها الأصلية. الأهم من ذلك ، في وقت مبكر من 4 أيام بعد الإخصاب (dpf) ، تعبر الخلايا β في جزيرة الزرد الأولية عن علامات النضج ، مثل تقويم أسماك الزرد من urocortin3 (ucn3l) وتظهر في المختبر استجابات للجلوكوز في النطاق الفسيولوجي⁶. بالإضافة إلى ذلك ، فإن جزيرة الزرد كثيفة الأوعية الدموية ومعصبة¹⁰. يؤدي الاستئصال الجيني للخلايا β في هذه المرحلة إلى عدم تحمل الجلوكوز. علاوة على ذلك ، تظهر أسماك الزرد استجابات محفوظة لعوامل خفض الجلوكوز مثل الأنسولين والسلفونيل يوريا ، مما يدل على أن الجزيرة الأولية هي نسيج مستجيب للجلوكوز ومتصل جهازيا يتحكم في مستويات الجلوكوز. هذه الخصائص الخاصة تجعل من سمك الزرد نموذجا فريدا لدراسة نشاط β الخلايا في الجسم الحي^11،12.

يسمح بروتوكول تصوير Ca²⁺ وحقن الجلوكوز المتزامن مباشرة في دوران أسماك الزرد بالتحقيق في استجابة الجلوكوز للخلية β في الجسم الحي. يتيح هذا البروتوكول حقن تركيزات الجلوكوز المحددة جنبا إلى جنب مع الدقة الزمنية والمكانية العالية ، والتي تكشف تماما عن الاستجابة المنسقة للخلايا β للجلوكوز ووجود خلايا β المستجيبة الأولى في الجسم الحي¹³. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول مع أي محلول قابل للحقن مثل المركبات الكيميائية أو الببتيدات الصغيرة. بشكل عام ، توضح هذه المنهجية قوة نموذج أسماك الزرد للتحقيق في التنسيق بين الخلايا β في الجسم الحي وتوصيف كيفية تأثير المكونات البيئية والوراثية على وظيفة الخلايا β.

Protocol

كانت الخطوط المعدلة وراثيا التي تم إنشاؤها مسبقا والمستخدمة في هذه الدراسة هي Tg (ins: GCaMP6s; cryaa: mCherry) ⁶ ، Tg (ins: cdt1-mCherry; cryaa: CFP) ¹⁴. تم إجراء جميع التجارب وفقا لقوانين الاتحاد الأوروبي وألمانيا (Tierschutzgesetz) وبموافقة TU Dresden و Landesdirektion Sachsen Ethics Committees (أرقام الموافقة: AZ 24D-9168 ، 11-1 / 2013-14 ، TV38 / 2015 ، T12 / 2016 ، و T13 / 2016 ، TVV50 / 2017 ، TVV 45/2018 ، و TVV33-2019). في هذه الدراسة ، تم إجراء جميع التصوير الحي في الجسم الحي وحقن الجلوكوز ، بالإضافة إلى الإجراءات التجريبية مع يرقات الزرد التي لم تتجاوز مرحلة 5 أيام بعد الإخصاب (dpf) ، كما هو مذكور في قانون حماية (TierSchVersV §14). وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63 / EU ، فإن استخدام هذه المراحل السابقة لأسماك الزرد يقلل من عدد التجارب ، وفقا لمبادئ 3Rs.

1. التحضير

ملاحظة: يتعلق هذا البروتوكول بالتصوير في الجسم الحي Ca²⁺ لجزيرة الزرد الأولية من Tg (ins: cdt1-mCherry; cryaa: CFP) ؛ Tg(in: GCaMP6s; cryaa: mCherry) يرقات مزدوجة معدلة وراثيا. في هذه ، يقود محفز الأنسولين التعبير عن cdt1-mCherry ، الذي يصنف نوى الخلايا β الفردية في التألق الأحمر. يظهر GCaMP6s التغيرات في التألق الأخضر استجابة لمستويات Ca²⁺ داخل الخلايا. يسمح التعبير المحدد ل GCaMP6s في الخلايا β بتوصيف استجابة الجلوكوز للخلايا الفردية دون تدخل من أنواع الخلايا أو الأنسجة الأخرى.

1. تحضير الوسائط الجنينية E2¹⁵.
2. تحضير 0.003٪ (200 ميكرومتر) 1-فينيل-2-ثيوريا (PTU) في محلول ملحي 10٪ من هانكس¹⁵.
3. قم بإعداد 1٪ من الاغاروز منخفض الذوبان (LMA) في وسط جنيني E2 عن طريق التسخين في الميكروويف وتصفيته بمرشح بحجم المسام <25 ميكرومتر. حافظ على LMA عند >37 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
   ملاحظة: يجب ترشيح جميع المحاليل لمنع انسداد الشعيرات الدموية الزجاجية المستخدمة في الحقن.
4. قم بإعداد محلول 0.4٪ من سلفونات الميثان ثلاثي الأبعاد (MS222) مع 979 مل من H₂O المعقم و 21 مل من 1 M Tris (الرقم الهيدروجيني 9). اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.
5. قم بإذابة 1.8 جم من D-glucose في 50 مل من PBS لتحضير محلول D-glucose 200 ملي مولار وتصفيته بمرشحات بحجم المسام <25 ميكرومتر. قم بإعداد محلول عملي من D-Glucose (25 ملم) عن طريق تخفيف 1: 8 من 200 ملي مولار D-Glucose في 1x PBS (مفلتر). يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية للتخزين طويل الأجل. أضف 5 ميكرولتر من الفينول الأحمر إلى 1 مل من 25 ملي مولار D-Glucose لتتمكن من تصور المحلول عند الحقن.
   ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بهذا المحلول عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد. ومع ذلك ، يجب تحضير محلول العمل 25 ملي مولار طازجا. تخلص من المخزون إذا كان هناك أي علامة على التلوث.
6. قم بإعداد الشعيرات الدموية الزجاجية المسحوبة بالحقن الدقيق باستخدام مجتذب الشعيرات الدموية أو شراء الشعيرات الدموية الزجاجية الدقيقة المتوفرة تجاريا. يتم وصف إعدادات سحب الإبرة في جدول المواد.
   ملاحظة: تم العثور على الشعيرات الدموية بالحقن الدقيق المصنوعة من زجاج البورسليكات بدون خيوط داخلية لتقديم نتائج أفضل مقارنة بالشعيرات الدموية المماثلة ذات الخيوط الداخلية.
7. قم بشراء أطباق ذات قاع زجاجي بقطر 35 مم لتركيب يرقات سمك الزرد. تم استخدام أطباق ذات قاع زجاجي بغطاء زجاجي 0.17 مم في هذا البروتوكول ، لأنها تسمح بالتصوير بأهداف مصححة بالزجاج في الأنظمة متحد البؤر.
8. شراء أطراف ماصة التحميل الدقيق. تم استخدام اللوادر الدقيقة سعة 20 ميكرولتر بطول 100 مم في هذا البروتوكول.
9. شراء مجموعة من الملقط الصغير.
10. قم بشراء أطباق بتري 90 مم لفرز وزراعة أسماك الزرد.
11. شراء الزيوت المعدنية.
12. قم بشراء مضخة صغيرة تعمل بالهواء المضغوط أو نظاما لتوصيل 1-5 نانولتر من أحجام السائل من خلال الشعيرات الدموية الزجاجية.
13. لفرز أسماك الزرد وتركيبها ، استخدم مجهر ستيريو مزود بمصدر ضوء ومكعبات مرشح زرقاء وحمراء للتألق (CFP: الإثارة 420-450 نانومتر ، الانبعاث 460-490 نانومتر ، TRITC: الإثارة: 532-554 نانومتر ، الانبعاث: 570-613 نانومتر ؛ أو تكساس الأحمر: الإثارة: 540-580 نانومتر ، الانبعاث: 592-667 نانومتر). فرز Tg المزدوج المعدل وراثيا (ins: cdt1-mCherry; cryaa: CFP) ؛ Tg(in: GCaMP6s; cryaa: mCherry) اليرقات باستخدام المجسم حدد الأجنة ذات التألق الأزرق والأحمر في شبكية العين بسبب التعبير عن CFP و mCherry تحت المحفز البلوري.
14. لتصوير تدفق Ca²⁺ في الخلايا β ، استخدم مجهرا متحدي البؤر مقلوب مزودا بهواء 10x (0.8 NA) وأهداف مائية 40x (1.0 NA). استخدم مرحلة تحتوي على حامل اللوحة للأطباق ذات القاع الزجاجي بقطر 35 مم.
15. شراء مناور يدوي ثلاثي الأبعاد أو آلي مع حامل شعري. أدخل الشعيرات الدموية الزجاجية في حامل الشعيرات الدموية وقم بتركيب حامل الشعيرات الدموية في مناور 3D.
    ملاحظة: يسمح مناور 3D بالحركة الدقيقة للشعيرات الدموية الزجاجية وإدخالها في يرقات الزرد.

2. تصاعد يرقات الزرد

ملاحظة: Tg المزدوج المعدلة وراثيا (في: cdt1-mCherry; cryaa: CFP) ؛ Tg(in: GCaMP6s; يتم معالجة أجنة cryaa: mCherry) بنسبة 0.03٪ (20 ميكرومتر) 1-فينيل 2-ثيوريا (PTU) لتثبيط التصبغ من 24 ساعة بعد الإخصاب فصاعدا. عند 4.5 dpf ، قم بتخدير اليرقات باستخدام 0.04٪ من التركيز النهائي للتريكايين قبل التركيب مباشرة.

1. للحفاظ على التخدير أثناء جلسة التصوير ، أضف إلى 1٪ من الاغاروز منخفض الذوبان تركيزا نهائيا قدره 0.04٪ تريكايين و 20 ميكرومتر من وحدة حرارية بريطانية. احتفظ ب LMA agarose عند >37 درجة مئوية حتى الاستخدام. استخدم هذا المحلول في نفس يوم التحضير.
2. فرز المعالج المزدوج المعدلة وراثيا المعالج Tg (ins: cdt1-mCherry; cryaa: CFP) ؛ يرقات Tg (ins: GCaMP6s ؛ cryaa: mCherry ). ضع 3-5 أسماك على طبق بتري زجاجي القاع وقم بإزالة معظم السائل.
   ملاحظة: لا تدع اليرقات تجف في هذه الخطوة واحتفظ بها دائما مغمورة في الحد الأدنى من E2.
3. أضف 500 ميكرولتر من LMA على طبق بتري الزجاجي الذي يحتوي على السمك ، وبمساعدة الملقط الدقيق ، حرك السمك برفق بحيث يكون الجانب الأيمن من السمكة على اتصال مباشر بالقاع الزجاجي. قم بإزالة اللاغاروز الزائد واتركه يتماسك لمدة 1-3 دقائق. لاحظ أن الاغاروز يصبح معتما قليلا في هذه المرحلة (الشكل 1 ب).
   ملاحظة: إذا كان الاغاروز ساخنا جدا ، فقد يؤدي ذلك إلى إتلاف اليرقات. لتجنب ذلك ، اترك الاغاروز يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-45 ثانية قبل إضافته إلى اليرقات.
4. بمجرد أن يصبح الاغاروز صلبا ، بمساعدة الملقط الدقيق ، قم بإزالة الاغاروز بعناية حول منطقة القلب لمنع كسر الإبرة المستخدمة للحقن اللاحق عند ملامسة الاغاروز (الشكل 1 ج).
5. أضف 500 ميكرولتر من E2 يحتوي على تركيز نهائي قدره 0.04٪ تريكايين و 20 ميكرومتر من وحدة حرارية بريطانية.
   ملاحظة: تأكد من تجنب جفاف اليرقات أثناء التصوير الحي.

3. الحقن المتزامن وتصوير Ca²⁺ للخلايا β

ملاحظة: لا ينبغي استخدام تلك اليرقات التي تحتوي على صفار زائد أعلى البنكرياس بسبب تأخر النمو للتصوير لأن دهون الصفار تتداخل مع جودة الصورة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام قوى الليزر المنخفضة (0.5٪ -5٪) لتجنب التبييض الضوئي والسمية الضوئية.

1. باستخدام مجهر ستيريو وملاقط دقيقة ، قم بقطع طرف الشعيرات الدموية الزجاجية.
   ملاحظة: لا تقطع أكثر من مجرد طرف الشعيرات الدموية ، حيث يجب أن يكون قطر الشعيرات الدموية أصغر من مجرى تدفق قلب الزرد.
2. باستخدام أطراف التحميل ، املأ الإبرة بمحلول D-Glucose 25 ملم.
   ملاحظة: يجب ملء الشعيرات الدموية بشكل موحد ، مع الحرص بشكل خاص على تجنب تكوين أي فقاعات هواء لأنها تتداخل مع توصيل أحجام الحقن المناسبة.
3. قم بتركيب الشعيرات الدموية الزجاجية في الحامل الشعري وقم بتوصيله بالمضخة الدقيقة. حافظ على المضخة الدقيقة عند ضغط حقن يتراوح بين 500-1,000 هيكتوباسكال ، وضغط التعويض = 0 هكتوباسكال ، ووقت التسليم = 1 ثانية.
4. لمعايرة حجم الحقن، استخدم مجهر استريو مزودا بقطعة عين متدرجة. ضع قطرة من الزيت المعدني في شريحة زجاجية أسفل المجسم اضبط تكبير المجسم على قوة 4 بهدف 1.5x. أدخل لحقن الشعيرات الدموية الزجاجية في الزيت المعدني.
   ملاحظة: 5 نانولتر يعادل 5 وحدات من التخرج الموضحة في قطعة العين من المجسم قم بزيادة أو تقليل ضغط الحقن للمضخة الصغيرة لضبط حجم السقوط.
5. قم بتركيب حامل الشعيرات الدموية في مناور 3D.
   ملاحظة: يجب أن يسمح مناور 3D بالتحكم الدقيق في الحركة في اتجاهات x و y و z لحامل الشعيرات الدموية.
6. ضع الطبق الذي يحتوي على اليرقات المثبتة بعناية على حامل لوحة المجهر متحد البؤر. استخدم هدفا هوائيا 10x ، 0.8 NA لتحديد موقع اليرقات باستخدام خيار المجال الساطع.
7. قم بتوجيه الزرد بجانب القلب نحو الاتجاه الذي يوجد فيه الشعيرات الدموية ومناور 3D. من خلال مراقبة التألق الأحمر ، تأكد من أن الجزيرة تقع في وسط مجال الرؤية.
   ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، يجب أن تظل المرحلة ثابتة (الشكل 2).
8. باستخدام مناور 3D ، حرك الشعيرات الدموية الزجاجية باتجاه قلب اليرقات ، واخترق الجلد ، واستهدف تجويف التامور. أدخل الشعيرات الدموية بعناية في منتصف الوريد الأساسي المشترك (CCV) والجيوب الأنفية الوريدية (SV) ، الواقعة على بعد حوالي 100-200 ميكرومتر من أذين القلب¹⁶ ، (الشكل 1 ب والشكل 2 ج). زاوية الإبرة حوالي 20-30 درجة بالنسبة لسطح اللوحة. إذا كانت حافة اللوحة مرتفعة جدا ، فقم بإزالتها للسماح بوصول أسهل للشعيرات الدموية.
   ملاحظة: هذه خطوة حاسمة ، حيث يلزم اختراق دقيق للغاية. يمكن أن تزعج الحركات السريعة القلب أو تسبب ملابس دموية في هذه المنطقة. إذا كان تدفق الدم مضطربا ، فيجب استخدام عينة مختلفة. نظرا لأن مناور 3D يحتفظ بوضع ثابت ، تجنب حركات المرحلة حتى لا تتداخل مع أنسجة القلب.
9. بمجرد وضع الشعيرات الدموية في SV ، قم بالتغيير إلى هدف الغمر في الماء 40x ، 1.2 NA. باستخدام المرايا ثنائية اللون 488/561 باللونين الأحمر والأخضر ، ابحث عن إشارة mCherry النووية في الخلايا β ، وركز على الجزيرة.
   ملاحظة: يجب أن تكون النوى الفردية مرئية بوضوح ويجب أن يكون التألق الأخضر المنخفض موجودا (الشكل 1 د).
10. قم بإعداد عملية استحواذ متزامنة ل GCaMP6s و mCherry fluorescence مع المعلمات التالية في قائمة الإعداد الذكي: GFP (GCaMP6s) ، الإثارة: 488 نانومتر ، الانبعاث: 498-555 نانومتر ، اللون الزائف: أخضر (حدد GFP) ؛ mCherry ، الإثارة: 561 نانومتر (mCherry) ، الانبعاث: 570-640 نانومتر ، اللون الزائف: أحمر (حدد mCherry). الضوء المنقول ، اللون الزائف: الرمادي.
11. اضبط مستوى التصوير عن طريق ضبط المستوى البؤري على طول المحور z للجزيرة. ابحث عن مستوى يحتوي على غالبية الخلايا β.
12. اضبط كسب إشارة mCherry النووية لتحديد موحد لكل خلية على حدة وتغطية حوالي 70٪ من الرسم البياني اللوني.
13. اضبط كسب إشارة GCaMP6s لتغطية 25٪ على الأقل من الرسم البياني للألوان ، حيث يزيد GCaMP6s سطوعها حتى 4 أضعاف.
14. اضبط كسب الضوء المرسل للحصول على إشارة موحدة للعينة تغطي حوالي 70٪ من الرسم البياني اللوني.
    ملاحظة: تستخدم القناة الرمادية لتصور وضمان تدفق الدم السليم للجزيرة.
15. في وضع الاكتساب ، اضبط دقة الصورة على 512 × 512 بكسل ، والتكبير/التصغير إلى 5 ، وخطوة الخط إلى 3 ، وسرعة المسح الضوئي إلى 13 ، ومتوسط الخط على 2-3. حدد الخيار السلسلة الزمنية، واضبط المدة على 500 دورة، بمعدل اكتساب يبلغ 150 مللي ثانية لكل إطار.
    ملاحظة: تتوافق أول 50 إطارا من السلسلة الزمنية مع التألق الأساسي قبل حقن الجلوكوز. لقد لوحظ أن بعض الخلايا β تظهر نشاطا قاعديا في الجسم الحي. ستظهر الخلية β المستجيبة زيادة في شدة التألق الأخضر مع حقن الجلوكوز بمرور الوقت. تظهر معظم الخلايا β استجابة لحقن الجلوكوز 25 ملي مولار في الجسم الحي.
16. ابدأ التصوير. بعد أول 50 إطارا (7.5 ثانية) ، قم بحقن الجلوكوز باستخدام المضخة الدقيقة.
    ملاحظة: قد تنتج الحقن حركة طفيفة يمكن أن تغير المستوى البؤري للجزيرة. أثناء تسجيل الفيلم ، قد تغير حركات القناة الهضمية المستوى البؤري للجزيرة.
17. راقب الحصول على الصورة واضبط إحداثيات x و y و z يدويا للحفاظ على نفس المستوى البؤري على طول الفيلم.
18. بعد حقن الجلوكوز ، يسجل النظام استجابة الجزيرة من حيث تدفق Ca²⁺ كزيادة في مضان GCaMP. بعد كل حقنة ، اترك اليرقات ترتاح لمدة 5 دقائق على الأقل قبل أي تحفيز إضافي.
    ملاحظة: تأكد من أن نوى الخلايا تظل مستقرة أثناء العملية. إذا كانت الجزيرة تتحرك على نطاق واسع أثناء الاستحواذ أو إذا كانت الجزيرة قد انتقلت خارج المستوى البؤري ، فلا يمكن استخدام العينة لمزيد من التحليل.
19. كرر الحقن ثلاث مرات. احفظ مقاطع الفيديو بتنسيقات TIF أو CZI أو LSM (موصى به). بعد تسجيل استجابات Ca²⁺ ، قم بإزالة الشعيرات الدموية من القلب ببطء شديد. انتقل إلى العينة التالية.
    ملاحظة: يمكن استعادة يرقات سمك الزرد في طبق بتري مع E2 الطازج الذي يحتوي على PTU.

4. القياس الكمي لآثار مضان GCaMP للخلايا β الفردية

ملاحظة: إذا كان يعرض الكثير من الحركة، فيمكن تثبيت الفيلم باستخدام تسجيل السلسلة المستندة إلى الواصف الإضافي FIJI (2d/3d + t)¹⁷.

1. قم بتحميل الصورة المراد تحليلها عن طريق السحب والإفلات في فيجي. في نافذة خيارات استيراد التنسيق الحيوي ، انقر فوق موافق.
   ملاحظة: بالنسبة للتنسيقات غير المدعومة من قبل FIJI، قم بتحويل مقاطع الفيديو إلى تنسيق tiff لتحليلها.
2. لاستخراج شدة الفلورسنت GCaMP ، انقر فوق القائمة تحليل > تعيين القياسات. ضع علامة في المربع كثافة متكاملة وانقر فوق موافق.
   1. افتح مدير عائد الاستثمار.
   2. في قائمة FIJI، حدد تحديدات المضلع الموجودة في شريط الأدوات.
   3. ارسم مضلعا يدويا يغطي مساحة أكبر قليلا من نواة الخلية ويتضمن بعضا من المنطقة السيتوبلازمية للخلية لضمان القياس الكمي المناسب لخلية واحدة لاستجابة Ca²⁺ .
   4. تأكد من أن موضع عائد الاستثمار متسق على الإطارات ؛ إذا لزم الأمر، اضبط عائد الاستثمار.
   5. أضف عائد الاستثمار المحدد إلى مدير عائد الاستثمار بالنقر فوق الزر إضافة [t].
3. لتحديد إشارة GCaMP ، افصل قنوات الصورة. انقر فوق قائمة FIJI صورة > الألوان > تقسيم القنوات وحدد القناة الخضراء.
4. في مدير عائد الاستثمار ، حدد جميع المناطق وانقر على القائمة المزيد > متعدد القياسات. احفظ النتائج.
   ملاحظة: إذا تحركت الخلية خارج منطقة المضلع بسبب حقن الجلوكوز أو حركة ، فقم باستخراج مضان الخلية قبل الحركة وبعدها عن طريق ضبط منطقة المضلع يدويا.
5. لإجراء تحليل الخلية الواحدة، قم بتنفيذ الخطوات التالية.
   1. قم بإزالة الإزهار في الخلفية. لهذا الغرض ، ضع في اعتبارك الخلفية الفلورية كحد أدنى للقيمة المسجلة على الفيلم لكل خلية (F_MIN). يتم طرح الحد الأدنى من السلسلة الزمنية بأكملها (F_T - F_MIN) لكل خلية.
   2. تطبيع قيم التألق عبر الفيلم. لتحقيق ذلك ، قسم كل قيمة على أعلى قيمة كثافة على التسجيلات لكل خلية. لهذا الغرض ، احسب الفرق بين F_MIN و F_MAX ، أي (F_MAX - F_MIN). قسم (F_T - F_MIN) / (F_MAX - F_MIN).
      ملاحظة: تسمح هذه الخطوة بمقارنة استجابة Ca²⁺ بين الخلايا المختلفة وبين الجزر الصغيرة من مختلفة ، حيث ستصدر مستويات متفاوتة من شدة الفلورسنت اعتمادا على المستوى البؤري وإمكانية وصول الخلية أو الجزيرة إلى التصوير.
6. بعد الحصول على قيم مضان أحادية الخلية ، استخدم برنامجا (على سبيل المثال ، Excel أو R) لمعالجة قيم الفلورسنت المقاسة من الخطوة 4 ورسم آثار الفلورسنت تلقائيا. لإجراء التحليل في هذا البروتوكول (الخطوة 6)، تم استخدام الجدول التكميلي 1 (Singlecelltrace.xlsx).

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول ، تم تمييز استجابة الجلوكوز للخلايا β الفردية في بيئتها الأصلية. لهذا الغرض ، يتم تثبيت يرقة الزرد على طبق بتري زجاجي القاع. باستخدام مناور ثلاثي الأبعاد ، تم إدخال شعيرات دموية زجاجية في الدورة الدموية ، مستهدفة SV (الشكل 1

Discussion

في هذا البروتوكول ، تم استكشاف ديناميكيات Ca²⁺ للخلايا β في بيئتها المكروية الأصلية بدقة الخلية الواحدة. هذا ممكن عن طريق تحفيز خلايا β الزرد بحقن الجلوكوز في الدورة الدموية أثناء تسجيل ديناميكيات Ca²⁺ باستخدام GCaMP6s.

يوفر البروتوكول ثلاث مزايا رئ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm diameter glass-bottom dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C	We use this glass-bottom dish to mount the zebrafish larvae and perform confocal microscopy
Blue-Green filter cube	ZEISS	489038-9901-000	Filter Set 38 HE
Confocal Microscope	ZEISS	LSM 980
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Excel (2016)			https://www.office.com/
Femtojet	Eppendorf	5252000013	This equipment is a pneumatic micropump, which allows precise volume delivery and is accompanied by a capillary holder. We use the micropump Femtojet (injection pressure between 500-1000 hPa; compensation pressure = 0 hPa; and delivery time = 1 second).
Femtotips, glass capillaries ready to be used.	Eppendorf	5242952008	This are ready to use glass capillaries that can substitute the pulled-capillaries.
FIJI, using ImageJ Version: 1.51c			https://fiji.sc/
Fluorescence lamp	ZEISS	423013-9010-000	Illuminator HXP 120 V
Glass capillaries 3.5"	Drummonds Scientific Company	3-000-203-G/X	We use these glass capillaries to prepare the injection capillaries by pulling them with a capillary -puller
Injectman	Eppendorf	5192000019	This equipment allows for 3D manipulation of the capillary holder
Low melting agarose	Biozym	Art. -Nr.: 840101	We use the agarose to mount the zebrafish onto the glass-bottom dish
Microloader tip for glass microcapillaries 0.5 – 20 µL, 100 mm	Eppendorf	5242956003	Long tips for loading the glass capillaries with the solutions
Micro-tweezers	Dumont Swiss made	0102-4-PO	We use the micro-tweezers to move the zebrafish larvae during the mounting and to cut off the tip of the glass capillary (eg. Dumont, size 4).
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904	We use the mineral oil to calibrate the drop size to inject
P-1000 Next Generation Pipette Puller	Science Products	P-1000	We use this capillary puller to prepare the glass capillary using the Drumond capillaries. We use the P-1000 capillary puller with the following parameters: Heat: 650, Pull: 20, Vel: 160, Time: 200, Pressure: 500.
PTU (1-phenyl-2-thiourea )	Sigma-Aldrich	P7629	We use this compound to inhibit pigmentation during zebrafish development
Red Filter Cube	ZEISS	000000-1114-462	Filter set 45 HQ TexasRed
Stereo microscope	ZEISS	495015-0001-000	SteREO Discovery.V8
Syringe filters, sterile. Pore size 0.2 µm	Pall Corporation	4612	We use these to filter all the solutions and prevent the capillary needle clothing
Transgenic Zebrafish line:Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)
tricaine methanesulfonate (MS222)	Sigma-Aldrich	E10521	We use this compound to anesthetize the fish larvae