生体内β細胞機能を調べるための生きたゼブラフィッシュにおけるカルシウムイメージングとグルコース刺激の同時研究

要約

ここでは、ゼブラフィッシュの膵臓β細胞のカルシウムイメージングとグルコース刺激のためのプロトコールを in vivoで紹介します。

要約

膵臓のβ細胞は、血糖値に応じてインスリンを産生および分泌することにより、全身のグルコース恒常性を維持します。β細胞機能の欠陥は、糖尿病につながる可能性のある高血糖症に関連しています。インスリン分泌の過程で、β細胞はCa²⁺の流入を経験します。したがって、遺伝的にコードされたカルシウムインジケーター(GECI)を使用してグルコース刺激Ca²⁺流入をイメージングすることは、β細胞機能を研究する道を提供します。これまでの研究で、GCaMP6を発現する単離されたゼブラフィッシュ島は、定義されたグルコース濃度で刺激すると有意なCa²⁺活性を示すことが示されていました。しかし、β細胞がグルコースにどのように反応するかを研究することは、単独でではなく、それらが全身的に結合し、血管新生され、密に神経支配されている本来の環境で研究することが最も重要です。この目的のために、この研究では、発生の初期段階にあるゼブラフィッシュの幼生の光学的透明性を活用して、in vivoでβ細胞の活性を明らかにしました。ここでは、in vivoでのβ細胞機能を調査するためのCa²⁺イメージングおよびグルコース刺激の詳細なプロトコルを示します。この技術により、β細胞内の協調したCa²⁺ダイナミクスをシングルセルの分解能で監視することができます。さらに、この方法は、低分子やペプチドなどのあらゆる注射可能な溶液での作業に適用できます。全体として、このプロトコルは、ゼブラフィッシュモデルがin vivoでの膵島の協調性を調査し、環境および遺伝的要素がβ細胞機能にどのように影響するかを特徴付ける可能性を示しています。

概要

膵臓のβ細胞は、グルコースに応答してインスリン分泌のユニークな能力を示します。炭水化物が豊富な食事の後、血糖値は上昇してβ細胞に入り、そこですぐに代謝されてATPが生成されます。ATP/ADPの細胞内比が増加すると、ATP依存性のK⁺ チャネルが閉鎖され、細胞膜が脱分極し、電位依存性のCa²⁺ チャネルが活性化されます。細胞内Ca²⁺ の急速な増加は、β細胞によるインスリン顆粒分泌を刺激します。

マウスの無傷の膵臓内の膵島細胞のイメージングは要求が厳しく、臓器全体の外部化が必要です。非侵襲的なin vivoイメージングの強力な代替手段は、マウスの眼の前房(AC)に膵島を移植することです¹。マウスのACに移植された膵島は、in vivo環境を模倣し、縦断的研究と^Ca2+イメージングin vivo ^2,3を可能にします。それにもかかわらず、膵島血行再建術のプロセスは、膵島移植後数週間かかる場合があります⁴。したがって、β細胞が血管新生され、生物の代謝状態と関連している元の天然環境を維持し、in vivo シングルセルイメージング分解能を達成することは、依然として非常に困難で時間がかかります。

これらの制限を克服するために、研究者はβ細胞でGECIを発現するゼブラフィッシュのトランスジェニック系統を開発し、これにより、β細胞^5,6,7,8,9におけるCa²⁺流入をリアルタイムで可視化できるようになりました。これらのツールを用いたところ、細胞培養において、ゼブラフィッシュβ細胞は、マウスやヒトの膵島と同様に、グルコース上昇に対して保存された応答を示すことがわかりました。さらに、ゼブラフィッシュの幼生の光学的透明度により、β細胞の本来の環境における機能を調べることができました。重要なことは、受精後4日(dpf)という早い時期に、ゼブラフィッシュの初代膵島のβ細胞は、ウロコルチン3(ucn3l)のゼブラフィッシュのオルソログなどの成熟マーカーを発現し、生理^{学的範囲のグル}コースに対するin vitro応答を示すことです6。また、ゼブラフィッシュ島は密集して血管新生し、神経支配されている¹⁰。この段階でのβ細胞の遺伝子アブレーションは、耐糖能障害を引き起こします。さらに、ゼブラフィッシュは、インスリンやスルホニル尿素などのグルコース低下剤に対して保存された応答を示しており、一次膵島がグルコース応答性でグルコースレベルを制御する全身的に結合した組織であることを示しています。これらの特殊な特性により、ゼブラフィッシュはin vivo^11,12の膵島β細胞活性を研究するためのユニークなモデルとなっています。

Ca²⁺イメージングとゼブラフィッシュの循環内に直接の同時グルコース注入のためのプロトコルにより、β細胞のグルコース応答性をin vivoで調査することができます。このプロトコルは、高い時間的および空間的分解能と組み合わせて定義されたグルコース濃度の注射を可能にし、グルコースに対するβ細胞の協調応答とin vivoでのファーストレスポンダー β細胞の存在を完全に明らかにします¹³。さらに、このプロトコルは、化合物や小さなペプチドなど、任意の注射可能な溶液に適合させることができます。全体として、この方法論は、in vivoでのβ細胞協調を調査し、環境および遺伝的要素がβ細胞の機能にどのように影響するかを特徴付けるためのゼブラフィッシュモデルの強みを示しています。

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プロトコル

本研究で用いた既定のトランスジェニック系統は 、Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)⁶, Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP)¹⁴.すべての実験は、欧州連合およびドイツの法律(Tierschutzgesetz)に準拠し、ドレスデン工科大学およびザクセン州立委員会(承認番号:AZ 24D-9168,11-1/2013-14, TV38/2015, T12/2016, T13/2016, TVV50/2017, TVV 45/2018, TVV33-2019)の承認を得て実施されました。この研究では、動物保護法(TierSchVersV §14)に記載されているように、受精後5日(dpf)段階を超えないゼブラフィッシュの幼生に対して、 すべての生体内 ライブイメージングとグルコース注射、および実験手順が行われました。EU指令2010/63/EUによると、これらの初期のゼブラフィッシュステージを使用すると、3Rの原則に従って実験動物の数が減少します。

1. 事前準備

注:このプロトコルは、Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP);Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)ダブルトランスジェニック幼虫。これらの動物では、インスリンプロモーターがcdt1-mCherryの発現を促進し、個々のβ細胞の核を赤色蛍光で標識します。GCaMP6sは、細胞内^Ca2+レベルに応答して緑色蛍光の変化を示します。GCaMP6のβ細胞における特異的発現により、他の細胞タイプや組織からの干渉なしに、個々の細胞のグルコース応答性の特性評価が可能になります。

1. E2胚培地を調製^{する 15}.
2. 0.003%(200μm)の1-フェニル-2-チオ尿素(PTU)を10%ハンクス生理食塩水¹⁵に調製します。
3. E2胚培地中の1%低融点アガロース(LMA)をマイクロ波で加熱し、<25μmの細孔径フィルターでろ過して調製します。LMAを>37°Cで最大1週間保持します。
   注:注入に使用するガラスキャピラリーの目詰まりを防ぐために、すべての溶液をろ過する必要があります。
4. トリカインメタンスルホン酸(MS222)の0.4%溶液を調製し、979 mLの滅菌H₂Oおよび21 mLの1 Mトリス(pH 9)を含有します。pHを7に調整します。
5. 1.8 gのD-グルコースを50 mLのPBSに溶解して200 mMのD-グルコース溶液を調製し、<25 μmの細孔サイズフィルターでろ過します。200 mM D-Glucoseを1x PBS(ろ過済み)で1:8に希釈して、D-Glucose(25 mM)の作業溶液を調製します。長期保存の場合は4°Cに保管してください。25 mM D-Glucose 1 mLに5 μLのフェノールレッドを添加すると、注射時の溶液が可視化されます。
   注:この溶液は4°Cで1週間保存できます。ただし、25 mMの作業溶液は新鮮に調製する必要があります。汚染の兆候がある場合は、ストックを廃棄してください。
6. キャピラリープーラーを使用してプルドマイクロインジェクションガラスキャピラリーを準備するか、市販のマイクロガラスキャピラリーを調達します。針を引っ張るための設定は、 材料の表に記載されています。
   注:内部フィラメントのないホウケイ酸ガラス製のマイクロインジェクションキャピラリーは、内部フィラメントを備えた同様のキャピラリーと比較して、より良い結果を提供することがわかりました。
7. ゼブラフィッシュの幼生を取り付けるための直径35mmのガラス底皿を調達します。このプロトコールでは、ガラスカバーが0.17 mmのガラス底ディッシュを使用しましたが、これは、共焦点系でガラス補正された対物レンズでのイメージングを可能にするためです。
8. マイクロローディングピペットチップを調達します。このプロトコルでは、長さ100mmの20μLマイクロローダーを使用しました。
9. マイクロピンセットのセットを調達します。
10. ゼブラフィッシュの選別・育成に使える90mmのシャーレを調達します。
11. 鉱物油を調達します。
12. 空気圧マイクロポンプまたはシステムを調達して、ガラスキャピラリーを介して1〜5nLの液体量を供給します。
13. ゼブラフィッシュの選別・埋込みには、光源と青色と赤色のフィルターキューブを装着した蛍光用実体顕微鏡(CFP:励起420-450nm、発光460-490nm、TRITC:励起:532-554nm、発光:570-613nm、またはTexas-Red:励起:540-580nm、発光:592-667nm)を使用してください。ダブルトランスジェニック Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry) の幼虫をステレオスコープを使用して。クリスタリンプロモーターの下でCFPとmCherryが発現するため、網膜に青色と赤色の蛍光を発する胚を選択します。
14. β細胞へのCa²⁺ 流入をイメージングするには、10倍(0.8 NA)の空気と40倍(1.0 NA)の水対物レンズを備えた倒立共焦点顕微鏡を使用します。プレートホルダーを収納したステージは、φ35mmのガラス底皿用です。
15. キャピラリーホルダー付きの3D手動または電動マニピュレーターを調達します。ガラスキャピラリーをキャピラリーホルダーに挿入し、キャピラリーホルダーを3Dマニピュレーターに取り付けます。
    注:3Dマニピュレータにより、ガラスキャピラリーの正確な動きとゼブラフィッシュの幼生への挿入が可能になります。

2.ゼブラフィッシュの幼虫のマウント

注:ダブルトランスジェニック Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry) 胚を0.03%(20μM)の1-フェニル2-チオ尿素(PTU)で処理し、受精後24時間以降から色素沈着を抑制します。4.5 dpfで、マウント直前にTricaineの最終濃度の0.04%を使用して幼虫に麻酔をかけます。

1. イメージングセッション中に麻酔を維持するために、1%低融点アガロースに0.04%トリカインと20μM PTUの最終濃度を追加します。LMAアガロースは、使用するまで>37°Cに保ちます。この溶液は、準備の同じ日に使用してください。
2. 麻酔をかけたダブルトランスジェニックTg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 幼虫。ガラス底のシャーレに3〜5匹の魚を置き、液体の大部分を取り除きます。
   注:このステップで幼虫を乾燥させず、常に最小限のE2に浸してください。
3. 魚の入ったガラス底のシャーレに500μLのLMAを加え、マイクロピンセットを使って魚を優しく動かし、魚の右側がガラス底に直接接触するようにします。余分なアガロースを取り除き、1〜3分間固めます。この時点でアガロースがわずかに不透明になるのを観察します(図1B)。
   注:アガロースが熱すぎると、幼虫に損傷を与える可能性があります。これを回避するには、アガロースを幼虫に加える前に、室温で30〜45秒間冷まします。
4. アガロースが固体になったら、マイクロピンセットを使用して、心臓の領域の周りのアガロースを慎重に取り除き、アガロースに接触したときにその後の注射に使用される針が折れるのを防ぎます(図1C)。
5. 最終濃度0.04%のトリカインと20μM PTUを含むE2 500 μLを加えます。
   注:ライブイメージング中は幼虫の乾燥を避けてください。

3. β細胞の同時注入とCa²⁺ イメージング

注:発達の遅れにより膵臓の上部に過剰な卵黄がある幼虫は、卵黄の脂質が画質を妨げるため、イメージングに使用しないでください。さらに、光退色や光毒性を避けるために、低レーザー出力(0.5%〜5%)が使用されます。

1. 実体顕微鏡とマイクロピンセットを使用して、ガラスキャピラリーの先端を切り取ります。
   注:毛細血管の直径はゼブラフィッシュの心臓の流入路よりも小さくする必要があるため、毛細血管の先端以上を切断しないでください。
2. ローディングチップを使用して、ニードルに25 mM D-Glucose溶液を充填します。
   注:キャピラリーは、適切な注入量の供給を妨げる気泡の形成を避けるために特別な注意を払って、均一に充填する必要があります。
3. ガラスキャピラリーをキャピラリーホルダーに取り付け、マイクロポンプに接続します。マイクロポンプを500〜1,000 hPaの注入圧力、補償圧力= 0 hPa、および供給時間= 1秒に維持します。
4. 注入量を校正するには、傾斜型接眼レンズを備えた実体顕微鏡を使用します。ステレオスコープの下のスライドガラスに鉱油を一滴入れます。ステレオスコープのズームを4倍に調整し、対物レンズを1.5倍にします。ガラスキャピラリーを鉱物油に注入するために挿入します。
   注意: 5 nLは、ステレオスコープの接眼レンズに表示される目盛りの5単位に相当します。マイクロポンプの噴射圧力を増減して、液滴量を調整します。
5. キャピラリーホルダーを3Dマニピュレーターに取り付けます。
   注:3Dマニピュレータは、キャピラリーホルダーのx、y、z方向の細かい動き制御を可能にする必要があります。
6. 取り付けられた幼虫が入った皿を共焦点顕微鏡のプレートホルダーに慎重に置きます。明視野オプションを使用して幼虫の位置を特定するには、10倍、0.8 NAの空気対物レンズを使用します。
7. ゼブラフィッシュの心臓側を、キャピラリーと3Dマニピュレータが配置されている方向に向けます。赤い蛍光を観察して、膵島が視野の中心にあることを確認します。
   注:この時点から、ステージは固定されたままになります(図2)。
8. 3Dマニピュレーターを使って、ガラス毛細血管を幼虫の心臓部に向けて移動させ、皮膚を貫通して心膜腔を目指します。心房¹⁶から約100〜200μmに位置する総枢機卿静脈(CCV)および静脈洞(SV)の中央に毛細血管を慎重に挿入する(図1B および 図2C)。針の角度は、プレートの表面に対して約20〜30°です。プレートの縁が高すぎる場合は、キャピラリーにアクセスしやすくするために取り外してください。
   注:これは非常に慎重な浸透が必要なため、重要なステップです。速い動きは、心臓を混乱させたり、この領域に血まみれを引き起こしたりする可能性があります。血流が乱れる場合は、別のサンプルを使用する必要があります。3Dマニピュレータは固定位置を保つため、心臓組織に干渉しないようにステージの動きを避けてください。
9. キャピラリーをSVに配置したら、40倍、1.2NAの水浸対物レンズに変更します。赤と緑の 488/561 二色性ミラーを使用して、β細胞内の核 mCherry シグナルを見つけ、島に焦点を合わせます。
   注:個々の核ははっきりと見え、低い緑色の蛍光が存在する必要があります(図1D)。
10. スマートセットアップメニューで次のパラメーターを使用して、GCaMP6sとmCherry蛍光の同時取得を設定します:GFP(GCaMP6s)、励起:488 nm、発光:498-555 nm、疑似色:緑(GFPを選択)。mCherry、励起:561 nm(mCherry)、発光:570-640 nm、偽色:赤(Select mCherry)。透過光、偽色:灰色。
11. 膵島のz軸に沿って焦点面を調整することにより、イメージング面を調整します。βセルの大部分を含む平面を見つけます。
12. 核内mCherry信号のゲインを調整して、個々のセルを均一に識別し、カラーヒストグラムの約70%をカバーします。
13. GCaMP6sの輝度が最大4倍に増加するため、カラーヒストグラムの少なくとも25%をカバーするようにGCaMP6s信号のゲインを調整します。
14. 透過光のゲインを調整して、カラーヒストグラムの約70%をカバーするサンプルの均一な信号を実現します。
    注:灰色のチャネルは、膵島の適切な血流を視覚化し、確保するために使用されます。
15. 取得モードでは、画像解像度を512 x 512ピクセル、ズームを5、ラインステップを3、スキャン速度を13、平均ラインを2-3に設定します。「時系列」オプションを選択し、「持続時間」を500サイクルに設定し、取り込み速度を1フレームあたり150ミリ秒に設定します。
    注:時系列の最初の50フレームは、グルコース注入前のベースライン蛍光に対応します。一部のβ細胞は in vivoで基礎活性を示すことが観察されています。応答するβ細胞は、グルコース注射により時間の経過とともに緑色蛍光強度の増加を示します。ほとんどのβ細胞は、 in vivoでの25mMグルコース注射に対して反応を示します。
16. イメージングを開始します。最初の50フレーム(7.5秒)の後、マイクロポンプを使用してグルコースを注入します。
    注:注射により、膵島の焦点面をシフトする可能性のあるわずかな動きが生じる場合があります。動画撮影中、腸の動きによって膵島の焦点面が変わることがあります。
17. 画像取得に注意し、x、y、z座標を手動で調整して、ムービーに沿って同じ焦点面を維持します。
18. グルコース注入後、システムは Ca²⁺ 流入の観点から膵島の応答を GCaMP 蛍光の増加として記録します。各注射後、それ以上の刺激を受ける前に、幼虫を少なくとも5分間休ませてください。
    注:プロセス中、細胞の核が安定していることを確認してください。取得中に膵島が広範囲に動いている場合、または膵島が焦点面から外れていた場合、サンプルをそれ以上の分析に使用することはできません。
19. 注入を3回繰り返します。ビデオを TIF、CZI、LSM 形式で保存します (推奨)。Ca²⁺ 応答を記録した後、心臓から毛細血管を非常にゆっくりと取り外します。次のサンプルに移動します。
    注:ゼブラフィッシュの幼生は、PTUを含む新鮮なE2でペトリ皿に回収できます。

4. 個々のβ細胞のGCaMP蛍光微量の定量

注:動物の動きが多すぎる場合は、FIJIプラグインの 記述子ベースのシリーズ登録(2d / 3d + t)¹⁷を使用してムービーを安定させることができます。

1. 分析する画像をFIJIにドラッグアンドドロップしてロードします。 「Bio-format Import Options」ウィンドウで、「 OK」をクリックします。
   注:FIJIでサポートされていない形式の場合は、分析のためにビデオをtiff形式に変換してください。
2. GCaMP蛍光強度を抽出するには、メニューの 「Analyze」>「Set Measurements」をクリックします。 「Integrated density 」のボックスにチェックを入れ、「 OK」をクリックします。
   1. ROI マネージャーを開きます。
   2. FIJIメニューで、ツールバーにある ポリゴン選択を選択します 。
   3. 細胞核よりわずかに大きい領域をカバーし、細胞の細胞質領域の一部を含むポリゴンを手動で描画して、Ca²⁺ 応答の適切なシングルセル定量を確保します。
   4. ROI の位置がフレーム全体で一貫していることを確認します。必要に応じて、ROI を調整します。
   5. [追加] [t] ボタンをクリックして、選択した ROI を ROI マネージャーに追加します。
3. GCaMPの信号を定量化するには、画像のチャンネルを分離します。FIJIメニューの 「Image > Colors」>「Split Channels 」をクリックし、「 Green Channel」を選択します。
4. ROIマネージャーで、すべての領域を選択し、メニュー「More > Multi Measure」をクリックします。結果を保存します。
   注:グルコース注射または動物の動きにより細胞がポリゴン領域から移動した場合は、ポリゴン領域を手動で調整して、移動の前後に細胞蛍光を抽出します。
5. シングルセル解析を実行するには、次の手順を実行します。
   1. 背景の蛍光色を削除します。この目的のために、バックグラウンド蛍光を各セルの映画上に記録された最小値(F_MIN)と考えてください。最小値は、各セルの時系列全体 (F、_T 、_{F MIN)} から減算されます。
   2. ムービー全体の蛍光値を正規化します。これを実現するには、各値を各セルの記録の最大強度値で除算します。このためには、F_MIN と_{F MAX}の差、つまり(F_MAX - F_MIN)を計算します。(F_T - F_MIN)/(F_MAX - F_MIN)を割ります。
      注:このステップでは、焦点面および細胞または膵島のイメージングへのアクセス性に応じて異なるレベルの蛍光強度を放出するため、異なる細胞間および異なる動物からの膵島間でのCa²⁺ 応答の比較が可能になります。
6. シングルセル蛍光値を取得した後、プログラム(ExcelやRなど)を使用してステップ4で測定した蛍光値を処理し、蛍光トレースを自動的にプロットします。このプロトコル(ステップ6)で分析を行うために、 補足表1 (Singlecelltrace.xlsx)を使用しました。

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結果

このプロトコルを使用して、個々のβ細胞の天然環境におけるグルコース応答を特徴付けました。この目的のために、ゼブラフィッシュの幼生はガラス底のペトリ皿に取り付けられています。3Dマニピュレータを使用して、SVを標的として、ガラスキャピラリーを循環器に挿入しました(図1および図2)。これにより、定義さ?...

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ディスカッション

このプロトコルでは、β細胞のネイティブ微小環境におけるCa²⁺ ダイナミクスを単一細胞分解能で調査しました。これは、ゼブラフィッシュのβ細胞を循環中のグルコース注射で刺激し、GCaMP6を使用してCa²⁺ ダイナミクスを記録することで可能になります。

このプロトコルには、主に3つの利点があります。まず、研究者は、ゼブラ...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm diameter glass-bottom dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C	We use this glass-bottom dish to mount the zebrafish larvae and perform confocal microscopy
Blue-Green filter cube	ZEISS	489038-9901-000	Filter Set 38 HE
Confocal Microscope	ZEISS	LSM 980
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Excel (2016)			https://www.office.com/
Femtojet	Eppendorf	5252000013	This equipment is a pneumatic micropump, which allows precise volume delivery and is accompanied by a capillary holder. We use the micropump Femtojet (injection pressure between 500-1000 hPa; compensation pressure = 0 hPa; and delivery time = 1 second).
Femtotips, glass capillaries ready to be used.	Eppendorf	5242952008	This are ready to use glass capillaries that can substitute the pulled-capillaries.
FIJI, using ImageJ Version: 1.51c			https://fiji.sc/
Fluorescence lamp	ZEISS	423013-9010-000	Illuminator HXP 120 V
Glass capillaries 3.5"	Drummonds Scientific Company	3-000-203-G/X	We use these glass capillaries to prepare the injection capillaries by pulling them with a capillary -puller
Injectman	Eppendorf	5192000019	This equipment allows for 3D manipulation of the capillary holder
Low melting agarose	Biozym	Art. -Nr.: 840101	We use the agarose to mount the zebrafish onto the glass-bottom dish
Microloader tip for glass microcapillaries 0.5 – 20 µL, 100 mm	Eppendorf	5242956003	Long tips for loading the glass capillaries with the solutions
Micro-tweezers	Dumont Swiss made	0102-4-PO	We use the micro-tweezers to move the zebrafish larvae during the mounting and to cut off the tip of the glass capillary (eg. Dumont, size 4).
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904	We use the mineral oil to calibrate the drop size to inject
P-1000 Next Generation Pipette Puller	Science Products	P-1000	We use this capillary puller to prepare the glass capillary using the Drumond capillaries. We use the P-1000 capillary puller with the following parameters: Heat: 650, Pull: 20, Vel: 160, Time: 200, Pressure: 500.
PTU (1-phenyl-2-thiourea )	Sigma-Aldrich	P7629	We use this compound to inhibit pigmentation during zebrafish development
Red Filter Cube	ZEISS	000000-1114-462	Filter set 45 HQ TexasRed
Stereo microscope	ZEISS	495015-0001-000	SteREO Discovery.V8
Syringe filters, sterile. Pore size 0.2 µm	Pall Corporation	4612	We use these to filter all the solutions and prevent the capillary needle clothing
Transgenic Zebrafish line:Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)
tricaine methanesulfonate (MS222)	Sigma-Aldrich	E10521	We use this compound to anesthetize the fish larvae