Imaging simultaneo del calcio e stimolazione del glucosio in zebrafish vivo per studiare la funzione delle cellule β in vivo

Riepilogo

Qui, lo studio presenta un protocollo per l'imaging del calcio e la stimolazione del glucosio delle cellule β pancreatiche del pesce zebra in vivo.

Abstract

Le cellule β pancreatiche sostengono l'omeostasi sistemica del glucosio producendo e secernendo insulina in base ai livelli di glucosio nel sangue. I difetti nella funzione delle cellule β sono associati all'iperglicemia che può portare al diabete. Durante il processo di secrezione di insulina, le cellule β subiscono un afflusso di Ca²⁺. Pertanto, l'imaging dell'afflusso di Ca²⁺ stimolato dal glucosio utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI) fornisce una strada per studiare la funzione delle cellule β. In precedenza, gli studi hanno dimostrato che le isole isolate di zebrafish che esprimono GCaMP6 mostrano una significativa attività del Ca²⁺ dopo stimolazione con concentrazioni di glucosio definite. Tuttavia, è fondamentale studiare come le cellule β rispondono al glucosio non isolatamente, ma nel loro ambiente nativo, dove sono sistematicamente connesse, vascolarizzate e densamente innervate. A tal fine, lo studio ha sfruttato la trasparenza ottica delle larve di pesce zebra nelle prime fasi di sviluppo per illuminare l'attività delle cellule β in vivo. Qui viene presentato un protocollo dettagliato per l'imaging del Ca²⁺ e la stimolazione del glucosio per studiare la funzione delle cellule β in vivo . Questa tecnica permette di monitorare la dinamica coordinata del Ca²⁺ in celle β con risoluzione a singola cellula. Inoltre, questo metodo può essere applicato per funzionare con qualsiasi soluzione iniettabile come piccole molecole o peptidi. Nel complesso, il protocollo illustra il potenziale del modello di zebrafish per studiare la coordinazione delle isole in vivo e per caratterizzare come le componenti ambientali e genetiche potrebbero influenzare la funzione delle cellule β.

Introduzione

Le cellule β pancreatiche mostrano la capacità unica di secrezione di insulina in risposta al glucosio. Dopo un pasto ricco di carboidrati, la glicemia aumenta ed entra nelle cellule β, dove viene rapidamente metabolizzata per produrre ATP. L'aumento del rapporto intracellulare di ATP/ADP porta alla chiusura dei canali K⁺ ATP-dipendenti, depolarizzando la membrana cellulare e attivando i canali del Ca²⁺ voltaggio-dipendenti. Il rapido aumento del Ca²⁺ intracellulare stimola la secrezione di granuli di insulina da parte delle cellule β.

L'imaging delle cellule insulari all'interno del pancreas intatto nei topi è impegnativo e richiede l'esteriorizzazione dell'intero organo. Una potente alternativa per l'imaging non invasivo in vivo è il trapianto di isole nella camera anteriore (AC) dell'occhio dei topi¹. Le isole trapiantate nell'AC dei topi imitano un ambiente in vivo, consentendo studi longitudinali e imaging del Ca²⁺ in vivo ^2,3. Tuttavia, il processo di rivascolarizzazione delle isole può richiedere diverse settimane dopo il trapianto delle isole⁴. Pertanto, preservare l'ambiente nativo originale, in cui le cellule β sono vascolarizzate e collegate allo stato metabolico dell'organismo, e ottenere la risoluzione dell'imaging in vivo di una singola cellula rimangono molto impegnative e dispendiose in termini di tempo.

Per superare queste limitazioni, i ricercatori hanno sviluppato linee transgeniche di zebrafish che esprimono GECI in cellule β, che consentono la visualizzazione in tempo reale dell'afflusso di Ca²⁺ nelle cellule β 5,6,7,8,9. Utilizzando questi strumenti, è stato scoperto che nelle colture cellulari, le cellule β zebrafish mostrano una risposta conservata al glucosio elevato, simile alle isole di topo e umane. Inoltre, la chiarezza ottica delle larve di zebrafish ha permesso di esaminare la funzione delle cellule β nel loro ambiente nativo. È importante sottolineare che, già 4 giorni dopo la fecondazione (dpf), le cellule β dell'isolotto primario del pesce zebra esprimono marcatori di maturità, come l'ortologo dell'urocortina3 (ucn3l) del pesce zebra e mostrano risposte in vitro al glucosio nell'intervallo fisiologico⁶. Inoltre, l'isolotto del pesce zebra è densamente vascolarizzato e innervato¹⁰. L'ablazione genetica delle cellule β in questa fase porta all'intolleranza al glucosio. Inoltre, il pesce zebra mostra risposte conservate agli agenti ipoglicemizzanti come l'insulina e le sulfoniluree, dimostrando che l'isola primaria è un tessuto sensibile al glucosio e collegato sistemicamente che controlla i livelli di glucosio. Queste caratteristiche speciali rendono il pesce zebra un modello unico per studiare l'attività delle isole β cellule in vivo^11,12.

Il protocollo per l'imaging del Ca²⁺ e l'iniezione simultanea di glucosio direttamente nella circolazione di zebrafish consente di studiare la risposta al glucosio della cellula β in vivo. Questo protocollo consente l'iniezione di concentrazioni definite di glucosio in combinazione con un'elevata risoluzione temporale e spaziale, che nel complesso rivelano la risposta coordinata delle cellule β al glucosio e la presenza di cellule β di primo intervento in vivo¹³. Inoltre, il protocollo può essere adattato a qualsiasi soluzione iniettabile come composti chimici o piccoli peptidi. Nel complesso, questa metodologia illustra la forza del modello di zebrafish per studiare la coordinazione β-cellulare in vivo e per caratterizzare come le componenti ambientali e genetiche potrebbero influenzare la funzione delle cellule β.

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Protocollo

Le linee transgeniche precedentemente stabilite utilizzate in questo studio erano Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)⁶, Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP)¹⁴. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le leggi dell'Unione Europea e tedesche (Tierschutzgesetz) e con l'approvazione dei Comitati Etici della TU Dresden e della Landesdirektion Sachsen (numeri di approvazione: AZ 24D-9168,11-1/2013-14, TV38/2015, T12/2016 e T13/2016, TVV50/2017, TVV 45/2018 e TVV33-2019). In questo studio, tutte le iniezioni di imaging dal vivo in vivo e di glucosio, nonché le procedure sperimentali, sono state eseguite con larve di zebrafish che non hanno superato la fase di 5 giorni dopo la fecondazione (dpf), come indicato nella legge sulla protezione degli animali (TierSchVersV §14). Secondo la direttiva UE 2010/63/UE, l'uso di questi stadi precoci di zebrafish riduce il numero di animali da esperimento, secondo i principi delle 3R.

1. Preparazione

NOTA: Questo protocollo riguarda l'imaging in vivo del Ca²⁺ dell'isolotto primario di zebrafish da Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) larve transgeniche doppie. In questi animali, il promotore dell'insulina guida l'espressione di cdt1-mCherry, che etichetta i nuclei delle singole cellule β in fluorescenza rossa. GCaMP6s mostra cambiamenti nella fluorescenza verde in risposta ai livelli intracellulari di Ca²⁺ . L'espressione specifica dei GCaMP6s nelle cellule β consente la caratterizzazione della risposta al glucosio delle singole cellule senza l'interferenza di altri tipi di cellule o tessuti.

1. Preparare il terreno embrionale E2¹⁵.
2. Preparare lo 0,003% (200 μm) di 1-feniil-2-tiourea (PTU) in soluzione salina di Hanks^{15 al 10}%.
3. Preparare l'agarosio a basso punto di fusione (LMA) all'1% in terreno embrionale E2 riscaldandolo in un forno a microonde e filtrandolo con un filtro poroso da <25 μm. Mantenere l'LMA a >37 °C per un massimo di 1 settimana.
   NOTA: Tutte le soluzioni devono essere filtrate per evitare l'ostruzione del capillare di vetro utilizzato per l'iniezione.
4. Preparare una soluzione allo 0,4% di tricaina metano solfonato (MS222) con 979 mL di H₂O sterile e 21 mL di 1 M Tris (pH 9). Regolare il pH a 7.
5. Sciogliere 1,8 g di D-glucosio in 50 mL di PBS per preparare una soluzione di D-glucosio da 200 mM e filtrarla con filtri porosi da <25 μm. Preparare una soluzione di lavoro di D-glucosio (25 mM) mediante una diluizione 1:8 dei 200 mM di D-glucosio in 1x PBS (filtrato). Conservare a 4 °C per la conservazione a lungo termine. Aggiungere 5 μL di fenolo-rosso a 1 mL di 25 mM di D-Glucosio per poter visualizzare la soluzione al momento dell'iniezione.
   NOTA: Questa soluzione può essere conservata a 4 °C per 1 settimana. Tuttavia, la soluzione di lavoro da 25 mM deve essere preparata fresca. Scartare il brodo se c'è qualche segno di contaminazione.
6. Preparare capillari in vetro per microiniezione estratti utilizzando un estrattore capillare o procurarsi capillari in microvetro disponibili in commercio. Le impostazioni per l'estrazione dell'ago sono descritte nella Tabella dei materiali.
   NOTA: È stato riscontrato che i capillari di microiniezione in vetro borosilicato senza filamento interno offrono risultati migliori rispetto a capillari simili con filamento interno.
7. Procurati piatti con fondo di vetro di 35 mm di diametro per il montaggio delle larve di pesce zebra. In questo protocollo sono state utilizzate piastre con fondo in vetro con una copertura in vetro di 0,17 mm, in quanto consentono l'imaging con obiettivi corretti per il vetro nei sistemi confocali.
8. Procurarsi puntali per pipette a micro-caricamento. In questo protocollo sono stati utilizzati microcaricatori da 20 μL con lunghezza di 100 mm.
9. Procurati un set di micro-pinzette.
10. Procurati piastre di Petri da 90 mm per lo smistamento e l'allevamento del pesce zebra.
11. Procurati olio minerale.
12. Procurarsi una micropompa pneumatica o un sistema per erogare 1-5 nL di volumi di liquido attraverso i capillari di vetro.
13. Per la selezione e il montaggio del pesce zebra, utilizzare uno stereomicroscopio dotato di una sorgente luminosa e di cubi filtranti blu e rossi per la fluorescenza (CFP: eccitazione 420-450 nm, emissione 460-490 nm, TRITC: eccitazione: 532-554 nm, emissione: 570-613 nm; o Texas-Red: eccitazione: 540-580 nm, emissione: 592-667 nm). Ordina il doppio Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) utilizzando lo stereoscopio. Selezionare gli embrioni con fluorescenza blu e rossa nella retina a causa dell'espressione di CFP e mCherry sotto il promotore della cristallina.
14. Per l'imaging dell'afflusso di Ca²⁺ nelle cellule β, utilizzare un microscopio confocale invertito dotato di un obiettivo ad aria 10x (0,8 NA) e a 40x (1,0 NA) in acqua. Utilizzare una tavoliera contenente il portapiatti per le stoviglie con fondo in vetro da 35 mm di diametro.
15. Procurati un manipolatore 3D manuale o motorizzato con supporto capillare. Inserire il capillare di vetro nel supporto del capillare e montare il supporto del capillare nel manipolatore 3D.
    NOTA: Il manipolatore 3D consente il movimento preciso del capillare di vetro e l'inserimento nelle larve di zebrafish.

2. Montaggio delle larve di pesce zebra

NOTA: Il doppio Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; Gli embrioni cryaa:mCherry) vengono trattati con 0,03% (20 μM) di 1-fenile 2-tiourea (PTU) per inibire la pigmentazione a partire da 24 ore dopo la fecondazione. A 4,5 dpf, anestetizzare le larve utilizzando lo 0,04% della concentrazione finale di Tricaina appena prima del montaggio.

1. Per mantenere l'anestesia durante la sessione di imaging, aggiungere all'agarosio a basso punto di fusione all'1% una concentrazione finale di tricaina allo 0,04% e 20 μM di PTU. Conservare l'agarosio LMA a >37 °C fino all'uso. Utilizzare questa soluzione lo stesso giorno della preparazione.
2. Smistare il doppio transgenico anestetizzato Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Larve di Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry). Mettere 3-5 pesci su una capsula di Petri con fondo di vetro e rimuovere la maggior parte del liquido.
   NOTA: Non lasciare asciugare le larve in questo passaggio e tenerle sempre immerse in una quantità minima di E2.
3. Aggiungere 500 μl di LMA sulla piastra di Petri con fondo di vetro contenente il pesce e, con l'aiuto delle micro-pinzette, muovere delicatamente il pesce in modo che il lato destro del pesce sia direttamente a contatto con il fondo di vetro. Eliminate l'agarosio in eccesso e lasciatelo solidificare per 1-3 minuti. Osservare che l'agarosio diventa leggermente opaco a questo punto (Figura 1B).
   NOTA: Se l'agarosio è troppo caldo, potrebbe danneggiare le larve. Per evitare ciò, lasciare raffreddare l'agarosio a temperatura ambiente per 30-45 s prima di aggiungerlo alle larve.
4. Una volta che l'agarosio diventa solido, con l'aiuto delle micro-pinzette, rimuovere con cura l'agarosio intorno all'area del cuore per evitare la rottura dell'ago utilizzato per la successiva iniezione al contatto con l'agarosio (Figura 1C).
5. Aggiungere 500 μL di E2 contenente una concentrazione finale di tricaina allo 0,04% e 20 μM di PTU.
   NOTA: Assicurarsi di evitare l'essiccazione delle larve durante l'imaging dal vivo.

3. Iniezione simultanea e imaging di Ca²⁺ di cellule β

NOTA: Quelle larve che hanno un tuorlo eccessivo sopra il pancreas a causa di un ritardo dello sviluppo non dovrebbero essere utilizzate per l'imaging poiché i lipidi del tuorlo interferiscono con la qualità dell'immagine. Inoltre, vengono utilizzate basse potenze laser (0,5%-5%) per evitare il fotosbiancamento e la fototossicità.

1. Utilizzando uno stereomicroscopio e una micro-pinzetta, tagliare la punta del capillare di vetro.
   NOTA: Non tagliare più della punta del capillare, poiché il diametro del capillare dovrebbe essere inferiore al tratto di afflusso del cuore del pesce zebra.
2. Utilizzando le punte di caricamento, riempire l'ago con la soluzione di D-glucosio 25 mM.
   NOTA: Il capillare deve essere riempito in modo uniforme, prestando particolare attenzione ad evitare la formazione di bolle d'aria che interferiscono con l'erogazione di adeguati volumi di iniezione.
3. Montare il capillare di vetro nel supporto del capillare e collegarlo alla micropompa. Mantenere la micropompa a una pressione di iniezione compresa tra 500 e 1.000 hPa, pressione di compensazione = 0 hPa e tempo di erogazione = 1 s.
4. Per calibrare il volume di iniezione, utilizzare uno stereomicroscopio dotato di oculare graduato. Metti una goccia di olio minerale in un vetrino sotto lo stereoscopio. Regola lo zoom dello stereoscopio su una potenza di 4 con un obiettivo 1,5x. Inserire per iniettare il capillare di vetro nell'olio minerale.
   NOTA: 5 nL equivalgono a 5 unità della graduazione mostrata nell'oculare dello stereoscopio. Aumentare o diminuire la pressione di iniezione della micropompa per regolare il volume di goccia.
5. Montare il supporto capillare nel manipolatore 3D.
   NOTA: Il manipolatore 3D dovrebbe consentire un controllo preciso del movimento nelle direzioni x, y e z del supporto capillare.
6. Posizionare con cura il piatto contenente le larve montate sul supporto per piastre del microscopio confocale. Utilizzare un obiettivo aereo 10x, 0,8 NA per localizzare le larve utilizzando l'opzione campo chiaro.
7. Orientare il pesce zebra con il lato del cuore verso la direzione in cui si trovano il capillare e il manipolatore 3D. Osservando la fluorescenza rossa, assicurati che l'isolotto sia al centro del campo visivo.
   NOTA: Da questo punto in poi, il tavolino dovrebbe rimanere fisso (Figura 2).
8. Utilizzando il manipolatore 3D, spostare il capillare di vetro verso il cuore delle larve, penetrare nella pelle e mirare alla cavità pericardica. Inserire con cautela il capillare al centro della vena cardinale comune (CCV) e del seno venoso (SV), situato a circa 100-200 μm dall'atrio cardiaco¹⁶, (Figura 1B e Figura 2C). L'angolo dell'ago è di circa 20-30° rispetto alla superficie della piastra. Se il bordo della placca è troppo alto, rimuoverlo per consentire un accesso più facile al capillare.
   NOTA: Questo è un passaggio critico, in quanto è necessaria una penetrazione molto attenta; Movimenti rapidi possono perturbare il cuore o causare sangue in quest'area. Se il flusso sanguigno è perturbato, è necessario utilizzare un campione diverso. Poiché il manipolatore 3D mantiene una posizione fissa, evitare i movimenti del tavolino per non interferire con il tessuto cardiaco.
9. Una volta posizionato il capillare nell'SV, passare a un obiettivo a immersione in acqua 40x, 1,2 NA. Utilizzando gli specchi bicromatici 488/561 rossi e verdi, trova il segnale nucleare di mCherry nelle celle β e concentrati sull'isola.
   NOTA: I singoli nuclei devono essere chiaramente visibili e deve essere presente una bassa fluorescenza verde (Figura 1D).
10. Impostare un'acquisizione simultanea per GCaMP6s e fluorescenza mCherry con i seguenti parametri nel menu di configurazione intelligente: GFP (GCaMP6s), eccitazione: 488 nm, emissione: 498-555 nm, falso colore: verde (selezionare GFP); mCherry, eccitazione: 561 nm (mCherry), emissione: 570-640 nm, falso colore: rosso (selezionare mCherry). Luce trasmessa, falso colore: grigi.
11. Regolare il piano di imaging regolando il piano focale lungo l'asse z dell'isola. Trova un piano che contenga la maggior parte delle celle β.
12. Regola il guadagno del segnale nucleare mCherry per un'identificazione uniforme di ogni singola cellula e copre circa il 70% dell'istogramma del colore.
13. Regola il guadagno del segnale GCaMP6s per coprire almeno il 25% dell'istogramma del colore, poiché GCaMP6s aumenta la sua luminosità fino a 4 volte.
14. Regolare il guadagno della luce trasmessa per ottenere un segnale uniforme del campione che copre circa il 70% dell'istogramma del colore.
    NOTA: Il canale grigio viene utilizzato per visualizzare e garantire il corretto flusso sanguigno dell'isola.
15. Nella modalità di acquisizione, impostare la risoluzione dell'immagine su 512 x 512 pixel, lo zoom su 5, il passo di linea su 3, la velocità di scansione su 13 e la linea media su 2-3. Selezionare l'opzione Serie temporali e impostare la Durata su 500 cicli, con una velocità di acquisizione di 150 ms per fotogramma.
    NOTA: I primi 50 fotogrammi della serie temporale corrispondono alla fluorescenza di base prima dell'iniezione di glucosio. È stato osservato che alcune cellule β mostrano attività basale in vivo. Una cellula β che risponde mostrerà un aumento dell'intensità della fluorescenza verde con l'iniezione di glucosio nel tempo. La maggior parte delle cellule β mostra una risposta all'iniezione di glucosio da 25 mM in vivo.
16. Avviare l'imaging. Dopo i primi 50 fotogrammi (7,5 s), iniettare il glucosio utilizzando la micropompa.
    NOTA: Le iniezioni potrebbero produrre un leggero movimento che può spostare il piano focale dell'isola. Durante la registrazione del filmato, i movimenti intestinali potrebbero modificare il piano focale dell'isolotto.
17. Tieni d'occhio l'acquisizione dell'immagine e regola manualmente le coordinate x, y e z per mantenere lo stesso piano focale lungo il filmato.
18. Dopo l'iniezione di glucosio, il sistema registra la risposta delle isole in termini di afflusso di Ca²⁺ come aumento della fluorescenza GCaMP. Dopo ogni iniezione, lasciare riposare le larve per almeno 5 minuti prima di qualsiasi ulteriore stimolazione.
    NOTA: Assicurarsi che i nuclei delle cellule rimangano stabili durante il processo. Se l'isola si muove molto durante l'acquisizione o se l'isola si è spostata fuori dal piano focale, il campione non può essere utilizzato per ulteriori analisi.
19. Ripetere l'iniezione tre volte. Salva i video nei formati TIF, CZI o LSM (consigliato). Dopo aver registrato le risposte al Ca²⁺ , rimuovere il capillare dal cuore molto lentamente. Passare all'esempio successivo.
    NOTA: Le larve di zebrafish possono essere recuperate in una capsula di Petri con E2 fresco contenente PTU.

4. Quantificazione delle tracce di fluorescenza GCaMP per singole cellule β

NOTA: Se l'animale presenta troppo movimento, il filmato può essere stabilizzato utilizzando la registrazione della serie basata sul descrittore del plug-in FIJI (2d/3d + t)¹⁷.

1. Carica l'immagine da analizzare trascinandola e rilasciandola in FIJI. Nella finestra Opzioni di importazione del formato biologico, fare clic su OK.
   NOTA: per i formati non supportati dalle FIJI, convertire i video in formato tiff per l'analisi.
2. Per estrarre l'intensità fluorescente GCaMP, fare clic sul menu Analizza > Imposta misure. Spuntare la casella Densità integrata e fare clic su OK.
   1. Apri il ROI Manager.
   2. Nel menu FIJI, seleziona Selezioni poligonali che si trovano nella barra degli strumenti.
   3. Disegna manualmente un poligono che copra un'area leggermente più grande del nucleo cellulare e includa parte dell'area citoplasmatica della cellula per garantire una corretta quantificazione a singola cellula della risposta del Ca²⁺ .
   4. Assicurati che la posizione della ROI sia coerente sui frame; se necessario, regolare il ROI.
   5. Aggiungi il ROI selezionato al ROI Manager facendo clic sul pulsante Aggiungi [t].
3. Per quantificare il segnale del GCaMP, separare i canali dell'immagine. Fare clic sul menu FIJI Immagine > Colori > Canali divisi e selezionare Canale verde.
4. Nel ROI Manager, seleziona tutte le aree e clicca sul menu Altro > Multi Misura. Salva i risultati.
   NOTA: Se la cellula si sposta fuori dall'area del poligono a causa dell'iniezione di glucosio o del movimento dell'animale, estrarre la fluorescenza cellulare prima e dopo il movimento regolando manualmente l'area del poligono.
5. Per eseguire l'analisi a cella singola, eseguire i seguenti passaggi.
   1. Rimuovi la fioritura di sfondo. A questo scopo, considerare la fluorescenza di fondo come il valore minimo registrato sul filmato per ogni cella (F_MIN). Il minimo viene sottratto dall'intera serie temporale (F,_T , - F,_MIN), per ogni cella.
   2. Normalizza i valori di fluorescenza in tutto il filmato. A tale scopo, dividere ogni valore per il valore di intensità più alto sulle registrazioni per ciascuna cella. A tale scopo, calcolare la differenza tra F_MIN e F_MAX, cioè (F_MAX - F_MIN). Dividi (F_T - F_MIN) / (F_MAX - F_MIN).
      NOTA: Questo passaggio consente di confrontare la risposta del Ca²⁺ tra diverse cellule e tra isole di diversi animali, poiché emetteranno livelli variabili di intensità fluorescente a seconda del piano focale e dell'accessibilità della cellula o dell'isolotto all'imaging.
6. Dopo l'acquisizione dei valori di fluorescenza di una singola cellula, utilizzare un programma (ad es. Excel o R) per elaborare i valori di fluorescenza misurati dal passaggio 4 e tracciare automaticamente le tracce di fluorescenza. Per eseguire l'analisi in questo protocollo (fase 6), è stata utilizzata la Tabella Supplementare 1 (Singlecelltrace.xlsx).

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Risultati

Utilizzando questo protocollo, è stata caratterizzata la risposta al glucosio delle singole cellule β nel loro ambiente nativo. A tale scopo, la larva di pesce zebra è montata su una capsula di Petri con fondo di vetro. Utilizzando un manipolatore 3D, un capillare di vetro è stato inserito nella circolazione, mirando alla SV (Figura 1 e Figura 2). Ciò consente l'iniezione di volumi specifici di soluzioni con una concentrazi...

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Discussione

In questo protocollo, è stata esplorata la dinamica del Ca²⁺ delle cellule β nel loro microambiente nativo con risoluzione a singola cellula. Ciò è possibile stimolando le cellule β zebrafish con un'iniezione di glucosio nella circolazione mentre registrano la loro dinamica di Ca²⁺ utilizzando GCaMP6s.

Il protocollo offre tre vantaggi principali. In primo luogo, i ricercatori hanno dimostrato che le cellule β di zebrafish mostrano u...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm diameter glass-bottom dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C	We use this glass-bottom dish to mount the zebrafish larvae and perform confocal microscopy
Blue-Green filter cube	ZEISS	489038-9901-000	Filter Set 38 HE
Confocal Microscope	ZEISS	LSM 980
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Excel (2016)			https://www.office.com/
Femtojet	Eppendorf	5252000013	This equipment is a pneumatic micropump, which allows precise volume delivery and is accompanied by a capillary holder. We use the micropump Femtojet (injection pressure between 500-1000 hPa; compensation pressure = 0 hPa; and delivery time = 1 second).
Femtotips, glass capillaries ready to be used.	Eppendorf	5242952008	This are ready to use glass capillaries that can substitute the pulled-capillaries.
FIJI, using ImageJ Version: 1.51c			https://fiji.sc/
Fluorescence lamp	ZEISS	423013-9010-000	Illuminator HXP 120 V
Glass capillaries 3.5"	Drummonds Scientific Company	3-000-203-G/X	We use these glass capillaries to prepare the injection capillaries by pulling them with a capillary -puller
Injectman	Eppendorf	5192000019	This equipment allows for 3D manipulation of the capillary holder
Low melting agarose	Biozym	Art. -Nr.: 840101	We use the agarose to mount the zebrafish onto the glass-bottom dish
Microloader tip for glass microcapillaries 0.5 – 20 µL, 100 mm	Eppendorf	5242956003	Long tips for loading the glass capillaries with the solutions
Micro-tweezers	Dumont Swiss made	0102-4-PO	We use the micro-tweezers to move the zebrafish larvae during the mounting and to cut off the tip of the glass capillary (eg. Dumont, size 4).
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904	We use the mineral oil to calibrate the drop size to inject
P-1000 Next Generation Pipette Puller	Science Products	P-1000	We use this capillary puller to prepare the glass capillary using the Drumond capillaries. We use the P-1000 capillary puller with the following parameters: Heat: 650, Pull: 20, Vel: 160, Time: 200, Pressure: 500.
PTU (1-phenyl-2-thiourea )	Sigma-Aldrich	P7629	We use this compound to inhibit pigmentation during zebrafish development
Red Filter Cube	ZEISS	000000-1114-462	Filter set 45 HQ TexasRed
Stereo microscope	ZEISS	495015-0001-000	SteREO Discovery.V8
Syringe filters, sterile. Pore size 0.2 µm	Pall Corporation	4612	We use these to filter all the solutions and prevent the capillary needle clothing
Transgenic Zebrafish line:Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)
tricaine methanesulfonate (MS222)	Sigma-Aldrich	E10521	We use this compound to anesthetize the fish larvae