הדמיית סידן וגירוי גלוקוז בו זמנית בדגי זברה חיים כדי לחקור את תפקוד תאי β in vivo

Summary

כאן, המחקר מציג פרוטוקול להדמיית סידן וגירוי גלוקוז של תאי β הלבלב של דג הזברה in vivo.

Abstract

תאי β הלבלב מקיימים הומאוסטזיס מערכתי של גלוקוז על ידי ייצור והפרשת אינסולין בהתאם לרמות הגלוקוז בדם. פגמים בתפקוד תאי β קשורים להיפרגליקמיה שעלולה להוביל לסוכרת. בתהליך הפרשת האינסולין, תאי β חווים זרם של Ca²⁺. לפיכך, הדמיית זרם Ca²⁺ מגורה גלוקוז באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית (GECIs) מספקת דרך לחקור את תפקוד תאי β. בעבר, מחקרים הראו כי איי דג זברה מבודדים המבטאים GCaMP6s מציגים פעילות משמעותית של Ca²⁺ בעת גירוי עם ריכוזי גלוקוז מוגדרים. עם זאת, חשוב ביותר לחקור כיצד תאי β מגיבים לגלוקוז לא בבידוד, אלא בסביבתם הטבעית, שם הם מחוברים מערכתית, כלי דם ועצבים בצפיפות. לשם כך, המחקר מינף את השקיפות האופטית של זחלי דג הזברה בשלבי התפתחות מוקדמים כדי להאיר את פעילות תאי β in vivo. כאן, מוצג פרוטוקול מפורט להדמיית Ca²⁺ וגירוי גלוקוז כדי לחקור את תפקוד תאי β in vivo . טכניקה זו מאפשרת לנטר את הדינמיקה המתואמת של Ca²⁺ בתאי β ברזולוציה של תא בודד. בנוסף, ניתן ליישם שיטה זו לעבודה עם כל תמיסה הניתנת להזרקה כגון מולקולות קטנות או פפטידים. בסך הכל, הפרוטוקול ממחיש את הפוטנציאל של מודל דג הזברה לחקור תיאום איים in vivo ולאפיין כיצד רכיבים סביבתיים וגנטיים עשויים להשפיע על תפקוד תאי β.

Introduction

תאי β הלבלב מציגים יכולת ייחודית להפרשת אינסולין בתגובה לגלוקוז. לאחר ארוחה עשירה בפחמימות, רמת הסוכר בדם עולה ונכנסת לתאי β, שם היא עוברת חילוף חומרים מהיר לייצור ATP. העלייה ביחס התוך-תאי של ATP/ADP מובילה לסגירת ערוצי K⁺ התלויים ב-ATP, דה-פולריזציה של קרום התא והפעלת ערוצי Ca²⁺ התלויים במתח. העלייה המהירה ב- Ca²⁺ התוך-תאי מגרה את הפרשת גרגירי האינסולין על ידי β התאים.

הדמיה של תאי האי בתוך הלבלב השלם בעכברים היא תובענית ודורשת exteriorization של האיבר כולו. חלופה רבת עוצמה להדמיה לא פולשנית in vivo היא השתלת איים לתוך החדר הקדמי (AC) של העין של עכברים¹. איים מושתלים ב-AC של עכברים מחקים סביבה in vivo, ומאפשרים מחקרי אורך והדמיית Ca²⁺ in vivo ^2,3. עם זאת, תהליך הרה-וסקולריזציה של האי יכול להימשך מספר שבועות לאחר השתלת האי⁴. לפיכך, שימור הסביבה הטבעית המקורית, שבה β התאים עוברים כלי דם ומחוברים למצב המטבולי של האורגניזם, והשגת רזולוציית הדמיה של תא בודד in vivo נותרו מאתגרים מאוד וגוזלים זמן.

כדי להתגבר על מגבלות אלו, חוקרים פיתחו קווים טרנסגניים של דג הזברה המבטאים GECIs בתאי β, המאפשרים הדמיה בזמן אמת של זרם Ca²⁺ בתאי^β 5,6,7,8,9. באמצעות כלים אלה, נמצא כי בתרבית תאים, תאי β של דג הזברה מראים תגובה שמורה לגלוקוז מוגבר, בדומה לאיים עכברים ובני אדם. יתר על כן, הבהירות האופטית של זחלי דג הזברה אפשרה לבחון את תפקודם של תאי β בסביבתם הטבעית. חשוב לציין, כבר 4 ימים לאחר ההפריה (dpf), תאי β של האי הראשוני של דג הזברה מבטאים סמני בגרות, כגון אורתולוג דג הזברה של urocortin3 (ucn3l) ומראים תגובות חוץ גופיות לגלוקוז בטווח הפיזיולוגי⁶. בנוסף, אי דג הזברה הוא כלי דם צפופים ועצבניים¹⁰. האבלציה הגנטית של תאי β בשלב זה מובילה לאי סבילות לגלוקוז. יתר על כן, דג הזברה מראה תגובות שמורות לחומרים להורדת גלוקוז כגון אינסולין וסולפונילאוריאה, מה שמראה שהאי העיקרי הוא רקמה מגיבה לגלוקוז ומחוברת מערכתית השולטת ברמות הגלוקוז. מאפיינים מיוחדים אלו הופכים את דג הזברה למודל ייחודי לחקר פעילות תאי β של איים in vivo^11,12.

הפרוטוקול להדמיית Ca²⁺ והזרקת גלוקוז בו זמנית ישירות במחזור הדם של דג הזברה מאפשר לחקור את תגובת הגלוקוז של תאי β in vivo. פרוטוקול זה מאפשר הזרקה של ריכוזי גלוקוז מוגדרים בשילוב עם רזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה, החושפים לחלוטין את התגובה המתואמת של תאי β לגלוקוז ואת נוכחותם של תאי β מגיבים ראשונים in vivo¹³. יתר על כן, ניתן להתאים את הפרוטוקול לכל תמיסה הניתנת להזרקה כגון תרכובות כימיות או פפטידים קטנים. בסך הכל, מתודולוגיה זו ממחישה את כוחו של מודל דג הזברה לחקור תיאום β-תאי in vivo ולאפיין כיצד רכיבים סביבתיים וגנטיים עשויים להשפיע על תפקוד תאי β.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הקווים הטרנסגניים שנקבעו בעבר ושימשו במחקר זה היו Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)⁶, Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP)¹⁴. כל הניסויים בוצעו בהתאם לחוקי האיחוד האירופי וגרמניה (Tierschutzgesetz) ובאישור ועדות האתיקה של TU Dresden ו-Landesdirektion Sachsen (מספרי אישור: AZ 24D-9168,11-1/2013-14, TV38/2015, T12/2016, ו-T13/2016, TVV50/2017, TVV 45/2018 ו-TVV33-2019). במחקר זה, בוצעו כל הזרקות ההדמיה החיה והגלוקוז , כמו גם פרוצדורות ניסיוניות עם זחלי דג זברה שלא עברו את שלב 5 הימים לאחר ההפריה (dpf), כאמור בחוק צער בעלי חיים (TierSchVersV §14). על פי הנחיית האיחוד האירופי 2010/63/EU, השימוש בשלבים מוקדמים יותר של דג הזברה מפחית את מספר חיות הניסוי, על פי עקרונות ה-3Rs.

1. הכנה

הערה: פרוטוקול זה מתייחס להדמיה in vivo Ca²⁺ של האי הראשוני של דג הזברה מ-Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) זחלים טרנסגניים כפולים. בבעלי חיים אלה, מקדם האינסולין מניע את הביטוי של cdt1-mCherry, המסמן את הגרעינים של תא β בודד בפלואורסצנטיות אדומה. GCaMP6s מראה שינויים בקרינה הירוקה בתגובה לרמות Ca²⁺ התוך-תאי. הביטוי הספציפי של GCaMP6s בתאי β מאפשר אפיון של תגובת הגלוקוז של תאים בודדים ללא הפרעה מסוגי תאים או רקמות אחרות.

1. הכן מדיה עוברית E2¹⁵.
2. הכן 0.003% (200 מיקרומטר) 1-פניל-2-תיאוריאה (PTU) ב-10% מי מלח של הנקס¹⁵.
3. הכן אגרוז נמס נמוך (LMA) במדיום עוברי E2 על ידי חימום במיקרוגל וסינון עם מסנן בגודל נקבוביות של <25 מיקרומטר. יש לשמור על ה-LMA בטמפרטורה של >37 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
   הערה: יש לסנן את כל התמיסות כדי למנוע סתימה של נימי הזכוכית המשמשים להזרקה.
4. הכן תמיסה של 0.4% של טריקאין מתאן סולפונאט (MS222) עם 979 מ"ל של H₂O סטרילי ו-21 מ"ל של 1 M Tris (pH 9). התאם את ה-pH ל-7.
5. ממיסים 1.8 גרם D-גלוקוז ב-50 מ"ל PBS כדי להכין תמיסת גלוקוז D של 200 מ"מ ולסנן אותה עם מסננים בגודל נקבוביות של <25 מיקרומטר. הכן תמיסת עבודה של D-גלוקוז (25 מ"מ) על ידי דילול של 1:8 של 200 מ"מ D-גלוקוז ב-1x PBS (מסונן). יש לשמור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. הוסף 5 מיקרוליטר של פנול אדום ל-1 מ"ל של 25 מ"מ D-גלוקוז כדי שתוכל לדמיין את התמיסה בעת ההזרקה.
   הערה: ניתן לשמור תמיסה זו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע. עם זאת, יש להכין את פתרון העבודה של 25 מ"מ טרי. השלך את המלאי אם יש סימן לזיהום.
6. הכן נימי זכוכית מיקרו-הזרקה נמשכים באמצעות מושך נימי או רכוש נימי מיקרו-זכוכית זמינים מסחרית. ההגדרות למשיכת מחט, מתוארות בטבלת החומרים.
   הערה: נימי מיקרו-הזרקה עשויים זכוכית בורוסיליקט ללא נימה פנימית נמצאו כמציעים תוצאות טובות יותר בהשוואה לנימים דומים עם נימה פנימית.
7. רכשו כלים עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ להרכבת זחלי דג הזברה. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בכלים עם תחתית זכוכית עם כיסוי זכוכית של 0.17 מ"מ, מכיוון שהם מאפשרים הדמיה עם מטרות מתוקנות זכוכית במערכות קונפוקליות.
8. רכשו קצות פיפט מיקרו-טעינה. בפרוטוקול זה נעשה שימוש במיקרו-מטענים של 20 מיקרוליטר באורך 100 מ"מ.
9. רכשו סט של מיקרו-פינצטה.
10. רכשו צלחות פטרי 90 מ"מ למיון וגידול דג הזברה.
11. רכשו שמן מינרלי.
12. רכשו מיקרו-משאבה פנאומטית או מערכת להעברת 1-5 נ"ל של נפחי נוזל דרך נימי הזכוכית.
13. למיון והרכבה של דג הזברה, השתמש במיקרוסקופ סטריאו המצויד במקור אור ובקוביות פילטר כחולות ואדומות לפלואורסצנטיות (CFP: עירור 420-450 ננומטר, פליטה 460-490 ננומטר, TRITC: עירור: 532-554 ננומטר, פליטה: 570-613 ננומטר; או טקסס-אדום: עירור: 540-580 ננומטר, פליטה: 592-667 ננומטר). מיין את ה-Tg הטרנסגני הכפול (ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) באמצעות הסטריאוסקופ. בחר את העוברים עם פלואורסצנטיות כחולה ואדומה ברשתית עקב ביטוי CFP ו-mCherry מתחת למקדם הגביש.
14. להדמיית זרם Ca²⁺ בתאי β, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך המצויד במטרות אוויר 10x (0.8 NA) ו-40x (1.0 NA). השתמש ב-stage המכיל את מחזיק הצלחת עבור כלי הזכוכית בקוטר 35 מ"מ.
15. רכשו מניפולטור ידני או ממונע תלת מימד עם מחזיק נימי. הכנס את נימי הזכוכית למחזיק הנימים והתקן את מחזיק הנימים למניפולטור התלת מימדי.
    הערה: המניפולטור התלת מימדי מאפשר תנועה מדויקת של נימי הזכוכית והחדרה לזחלי דג הזברה.

2. הרכבה של זחלי דג זברה

הערה: ה-Tg הטרנסגני הכפול (ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) עוברים מטופלים ב-0.03% (20 מיקרומטר) 1-פניל 2-תיאוריאה (PTU) כדי לעכב פיגמנטציה מ-24 שעות לאחר ההפריה ואילך. ב-4.5 dpf, יש להרדים את הזחלים באמצעות 0.04% מהריכוז הסופי של טריקאין ממש לפני ההרכבה.

1. כדי לשמור על הרדמה במהלך מפגש ההדמיה, הוסף לאגרוז הנמוך של 1% ריכוז סופי של 0.04% טריקאין ו-20 מיקרומטר PTU. שמור את אגרוז ה-LMA ב->37 מעלות צלזיוס עד לשימוש. השתמש בתמיסה זו באותו יום הכנה.
2. מיין את ה-Tg הטרנסגני הכפול המורדם (ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); זחלי Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry). מניחים 3-5 דגים על צלחת פטרי עם תחתית זכוכית ומוציאים את רוב הנוזלים.
   הערה: אל תתנו לזחלים להתייבש בשלב זה והשאירו אותם תמיד שקועים בכמות מינימלית של E2.
3. מוסיפים 500 מיקרוליטר LMA על צלחת הפטרי בתחתית הזכוכית המכילה את הדג, ובעזרת הפינצטה המיקרו מזיזים בעדינות את הדג כך שהצד הימני של הדג יהיה במגע ישיר עם תחתית הזכוכית. הסר את עודפי האגרוז ותן לו להתמצק במשך 1-3 דקות. שימו לב שהאגרוז נעשה מעט אטום בנקודה זו (איור 1B).
   הערה: אם האגרוז חם מדי, זה עלול לפגוע בזחלים. כדי להימנע מכך, הניחו לאגרוז להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 30-45 שניות לפני הוספתו לזחלים.
4. ברגע שהאגרוז הופך למוצק, בעזרת הפינצטה הקטנה, הסירו בזהירות את האגרוז סביב אזור הלב כדי למנוע שבירת המחט המשמשת להזרקה הבאה במגע עם האגרוז (איור 1C).
5. הוסף 500 מיקרוליטר של E2 המכיל ריכוז סופי של 0.04% טריקאין ו-20 מיקרומטר PTU.
   הערה: הקפד להימנע מייבוש הזחלים במהלך ההדמיה החיה.

3. הזרקה סימולטנית והדמיית Ca²⁺ של תאי β

הערה: אין להשתמש באותם זחלים שיש להם חלמון מוגזם על גבי הלבלב עקב עיכוב התפתחותי להדמיה מכיוון שהשומנים של החלמון מפריעים לאיכות התמונה. בנוסף, נעשה שימוש בעוצמות לייזר נמוכות (0.5%-5%) כדי למנוע פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיות.

1. בעזרת מיקרוסקופ סטריאו ופינצטה, חתכו את קצה נימי הזכוכית.
   הערה: אין לחתוך יותר מאשר רק את קצה הנימים, מכיוון שקוטר הנימים צריך להיות קטן יותר מדרכי הזרימה של לב דג הזברה.
2. בעזרת קצות הטעינה, מלאו את המחט בתמיסת D-Glucose של 25 מ"מ.
   הערה: יש למלא את הנימים בצורה אחידה, תוך הקפדה מיוחדת על מניעת היווצרות בועות אוויר כלשהן מכיוון שהן מפריעות לאספקת נפחי הזרקה מתאימים.
3. התקן את נימי הזכוכית לתוך מחזיק הנימים וחבר אותו למיקרו-משאבה. שמור על המיקרו-משאבת בלחץ הזרקה בין 500-1,000 hPa, לחץ פיצוי = 0 hPa וזמן אספקה = 1 שניות.
4. כדי לכייל את נפח ההזרקה, השתמש במיקרוסקופ סטריאו המצויד בעינית מדורגת. הניחו טיפת שמן מינרלי בשקופית זכוכית מתחת לסטריאוסקופ. התאם את הזום של הסטריאוסקופ לעוצמה של 4 עם מטרה של פי 1.5. הכנס כדי להזריק את נימי הזכוכית לשמן המינרלי.
   הערה: 5 nL שווה ערך ל-5 יחידות של הסיום המוצג בעינית הסטריאוסקופ. הגדל או הקטן את לחץ ההזרקה של המיקרו-משאבה כדי להתאים את נפח הטיפה.
5. התקן את מחזיק הנימים לתוך המניפולטור התלת מימדי.
   הערה: המניפולטור התלת מימדי אמור לאפשר בקרת תנועה עדינה בכיווני x, y ו-z של מחזיק הנימים.
6. הנח את הכלי המכיל את הזחלים המותקנים בזהירות על מחזיק הצלחת של המיקרוסקופ הקונפוקלי. השתמש במטרה אווירית של 10x, 0.8 NA לאיתור הזחלים באמצעות אפשרות השדה הבהיר.
7. כוון את דג הזברה עם צד הלב לכיוון שבו נמצאים הנימים והמניפולטור התלת מימדי. על ידי התבוננות בקרינה האדומה, ודא שהאי נמצא במרכז שדה הראייה.
   הערה: מנקודה זו ואילך, השלב צריך להישאר קבוע (איור 2).
8. באמצעות המניפולטור התלת-ממדי, הזיזו את נימי הזכוכית לכיוון לב הזחלים, חדרו לעור וכוונו לחלל קרום הלב. הכניסו בזהירות את הנימים באמצע הווריד הקרדינלי המשותף (CCV) ואת הסינוס הוורידי (SV), הממוקמים בסביבות 100-200 מיקרומטר מאטריום הלב¹⁶, (איור 1B ואיור 2C). זווית המחט היא כ-20-30 מעלות ביחס לפני השטח של הצלחת. אם שפת הצלחת גבוהה מדי, הסר אותה כדי לאפשר גישה קלה יותר לנימים.
   הערה: זהו שלב קריטי, שכן נדרשת חדירה זהירה מאוד; תנועות מהירות עלולות להפריע ללב או לגרום לדם באזור זה. אם זרימת הדם מופרעת, יש להשתמש בדגימה אחרת. מכיוון שהמניפולטור התלת מימדי שומר על מיקום קבוע, הימנע מתנועות של הבמה כדי לא להפריע לרקמת הלב.
9. לאחר הכנסת הנימים לתוך ה-SV, שנה ליעד טבילה במים של 40x, 1.2 NA. באמצעות המראות הדיכרומטיות האדומות והירוקות 488/561, מצא את אות ה-mCherry הגרעיני בתאי β, והתמקד באי.
   הערה: גרעינים בודדים צריכים להיות גלויים בבירור ופלואורסצנטיות ירוקה נמוכה צריכה להיות נוכחת (איור 1D).
10. הגדר רכישה בו-זמנית עבור GCaMP6s ו-mCherry fluorescence עם הפרמטרים הבאים בתפריט ההגדרות החכמות: GFP (GCaMP6s), עירור: 488 ננומטר, פליטה: 498-555 ננומטר, צבע כוזב: ירוק (בחר GFP); mCherry, עירור: 561 ננומטר (mCherry), פליטה: 570-640 ננומטר, צבע כוזב: אדום (בחר mCherry). אור מועבר, צבע כוזב: אפור.
11. כוונן את מישור ההדמיה על ידי התאמת מישור המוקד לאורך ציר ה-z של האי. מצא מישור המכיל את רוב β התאים.
12. התאם את הרווח של אות ה-mCherry הגרעיני לזיהוי אחיד של כל תא בודד ומכסה כ-70% מהיסטוגרמה של הצבע.
13. כוונן את הרווח של אות GCaMP6s לכיסוי לפחות 25% מהיסטוגרמה של הצבע, מכיוון שה-GCaMP6s מגדיל את הבהירות שלו עד פי 4.
14. כוונן את הרווח של האור המשודר לאות אחיד של הדגימה המכסה כ-70% מהיסטוגרמה של הצבע.
    הערה: התעלה האפורה משמשת להמחשה והבטחת זרימת דם תקינה של האי.
15. במצב רכישה, קבעו את רזולוציית התמונה ל- 512 x 512 פיקסלים, התקרב ל- 5, צעד שורה ל- 3, מהירות סריקה ל- 13 וקו ממוצע ל- 2-3. בחר באפשרות סדרת זמן, והגדר את משך הזמן ל-500 מחזורים, עם קצב רכישה של 150 אלפיות השנייה למסגרת.
    הערה: 50 הפריימים הראשונים של סדרת הזמן תואמים את הקרינה הבסיסית לפני הזרקת הגלוקוז. נצפה כי חלק מתאי β מראים פעילות בסיסית in vivo. תא β מגיב יראה עלייה בעוצמת הקרינה הירוקה עם הזרקת הגלוקוז לאורך זמן. רוב תאי β מראים תגובה להזרקת גלוקוז של 25 מ"מ in vivo.
16. התחל את ההדמיה. לאחר 50 הפריימים הראשונים (7.5 שניות), הזריק את הגלוקוז באמצעות המיקרו-משאבה.
    הערה: ההזרקות עשויות לייצר תנועה קלה שיכולה להזיז את מישור המוקד של האי. במהלך הקלטת הסרט, תנועות מעיים עשויות לשנות את מישור המוקד של האי.
17. עקוב אחר רכישת התמונה והתאם ידנית את קואורדינטות x, y ו- z כדי לשמור על אותו מישור מוקד לאורך הסרט.
18. לאחר הזרקת הגלוקוז, המערכת רושמת את תגובת האי במונחים של זרם Ca²⁺ כעלייה בפלואורסצנטיות GCaMP. לאחר כל זריקה, הניחו לזחלים לנוח לפחות 5 דקות לפני כל גירוי נוסף.
    הערה: ודא שגרעיני התאים נשארים יציבים במהלך התהליך. אם האי נע באופן נרחב במהלך הרכישה או אם האי זז מחוץ למישור המוקד, לא ניתן להשתמש בדגימה לניתוח נוסף.
19. חזור על ההזרקה שלוש פעמים. שמור את הסרטונים בפורמטים TIF, CZI או LSM (מומלץ). לאחר הקלטת תגובות Ca²⁺ , הסר את הנימים מהלב לאט מאוד. מעבר לדגימה הבאה.
    הערה: ניתן לשחזר את זחלי דג הזברה לצלחת פטרי עם E2 טרי המכיל PTU.

4. כימות עקבות פלואורסצנטיות GCaMP עבור תאי β בודדים

הערה: אם החיה מציגה יותר מדי תנועה, ניתן לייצב את הסרט באמצעות רישום סדרה מבוסס מתאר תוסף FIJI (2d/3d + t)¹⁷.

1. טען את התמונה לניתוח על ידי גרירה ושחרור לתוך FIJI. בחלון אפשרויות ייבוא בפורמט ביו, לחץ על אישור.
   הערה: עבור פורמטים שאינם נתמכים על ידי FIJI, המר את הסרטונים לפורמט tiff לצורך ניתוח.
2. כדי לחלץ את עוצמת הפלואורסצנט של GCaMP, לחץ על התפריט נתח > קבע מדידות. סמן את התיבה צפיפות משולבת ולחץ על אישור.
   1. פתח את מנהל ההחזר על ההשקעה.
   2. בתפריט FIJI, בחר בחירות מצולע הממוקמות בסרגל הכלים.
   3. צייר ידנית מצולע המכסה שטח מעט גדול יותר מגרעין התא וכולל חלק מהשטח הציטופלזמי של התא כדי להבטיח כימות תקין של תא בודד של תגובת Ca²⁺ .
   4. ודא שמיקום ההחזר על ההשקעה עקבי מעל המסגרות; במידת הצורך, התאם את החזר ההשקעה.
   5. הוסף את ההחזר על ההשקעה שנבחר למנהל ה-ROI על ידי לחיצה על כפתור הוסף [t].
3. כדי לכמת את האות של ה-GCaMP, הפרד את ערוצי התמונה. לחץ על תפריט פיג'י תמונה > צבעים > ערוצים מפוצלים ובחר ערוץ ירוק.
4. במנהל החזר ההשקעה, בחר את כל האזורים ולחץ על התפריט עוד > רב מדידה. שמור את התוצאות.
   הערה: אם התא יוצא מאזור המצולע עקב הזרקת הגלוקוז או תנועת בעלי החיים, חלץ את הקרינה של התא לפני ואחרי התנועה על ידי התאמה ידנית של אזור המצולע.
5. כדי לבצע את ניתוח התא הבודד, בצע את השלבים הבאים.
   1. הסר את תפרחת הרקע. למטרה זו, קחו בחשבון את פלואורסצת הרקע כערך המינימלי שנרשם מעל הסרט עבור כל תא (F_MIN). המינימום מופחת מכל סדרת הזמן (F_T - F_MIN) עבור כל תא.
   2. נרמל את ערכי הקרינה לאורך הסרט. כדי להשיג זאת, חלקו כל ערך בערך העוצמה הגבוה ביותר על פני ההקלטות עבור כל תא. למטרה זו, חשב את ההפרש בין F_MIN ל- F_MAX, כלומר (F_MAX - F_MIN). לחלק (F_T - F_MIN) / (F_MAX - F_MIN).
      הערה: שלב זה מאפשר השוואה של תגובת Ca²⁺ בין תאים שונים ובין איים מבעלי חיים שונים, מכיוון שהם יפלטו רמות שונות של עוצמות פלואורסצנטיות בהתאם למישור המוקד ולנגישות התא או האי להדמיה.
6. לאחר רכישת ערכי פלואורסצנטיות של תא בודד, השתמש בתוכנית (למשל, Excel או R) כדי לעבד את הערכים הפלואורסצנטיים שנמדדו משלב 4 ולשרטט אוטומטית את העקבות הפלואורסצנטיים. לביצוע הניתוח בפרוטוקול זה (שלב 6), נעשה שימוש בטבלה משלימה 1 (Singlecelltrace.xlsx).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול זה, אופיינה תגובת הגלוקוז של תאי β בודדים בסביבתם הטבעית. לשם כך, זחל דג הזברה מותקן על צלחת פטרי עם תחתית זכוכית. באמצעות מניפולטור תלת-ממדי, נימי זכוכית הוכנסו למחזור הדם, המכוונים ל-SV (איור 1 ואיור 2). זה מאפשר הזרקה של כמו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בפרוטוקול זה נחקרה הדינמיקה של Ca²⁺ של תאי β במיקרו-סביבה המקורית שלהם עם רזולוציה של תא בודד. זה אפשרי על ידי גירוי תאי β דג הזברה עם הזרקת גלוקוז במחזור הדם תוך רישום דינמיקת ה-Ca²⁺ שלהם באמצעות GCaMP6s.

הפרוטוקול מספק שלושה יתרונות עיקריים. ראשית, חו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm diameter glass-bottom dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C	We use this glass-bottom dish to mount the zebrafish larvae and perform confocal microscopy
Blue-Green filter cube	ZEISS	489038-9901-000	Filter Set 38 HE
Confocal Microscope	ZEISS	LSM 980
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Excel (2016)			https://www.office.com/
Femtojet	Eppendorf	5252000013	This equipment is a pneumatic micropump, which allows precise volume delivery and is accompanied by a capillary holder. We use the micropump Femtojet (injection pressure between 500-1000 hPa; compensation pressure = 0 hPa; and delivery time = 1 second).
Femtotips, glass capillaries ready to be used.	Eppendorf	5242952008	This are ready to use glass capillaries that can substitute the pulled-capillaries.
FIJI, using ImageJ Version: 1.51c			https://fiji.sc/
Fluorescence lamp	ZEISS	423013-9010-000	Illuminator HXP 120 V
Glass capillaries 3.5"	Drummonds Scientific Company	3-000-203-G/X	We use these glass capillaries to prepare the injection capillaries by pulling them with a capillary -puller
Injectman	Eppendorf	5192000019	This equipment allows for 3D manipulation of the capillary holder
Low melting agarose	Biozym	Art. -Nr.: 840101	We use the agarose to mount the zebrafish onto the glass-bottom dish
Microloader tip for glass microcapillaries 0.5 – 20 µL, 100 mm	Eppendorf	5242956003	Long tips for loading the glass capillaries with the solutions
Micro-tweezers	Dumont Swiss made	0102-4-PO	We use the micro-tweezers to move the zebrafish larvae during the mounting and to cut off the tip of the glass capillary (eg. Dumont, size 4).
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904	We use the mineral oil to calibrate the drop size to inject
P-1000 Next Generation Pipette Puller	Science Products	P-1000	We use this capillary puller to prepare the glass capillary using the Drumond capillaries. We use the P-1000 capillary puller with the following parameters: Heat: 650, Pull: 20, Vel: 160, Time: 200, Pressure: 500.
PTU (1-phenyl-2-thiourea )	Sigma-Aldrich	P7629	We use this compound to inhibit pigmentation during zebrafish development
Red Filter Cube	ZEISS	000000-1114-462	Filter set 45 HQ TexasRed
Stereo microscope	ZEISS	495015-0001-000	SteREO Discovery.V8
Syringe filters, sterile. Pore size 0.2 µm	Pall Corporation	4612	We use these to filter all the solutions and prevent the capillary needle clothing
Transgenic Zebrafish line:Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)
tricaine methanesulfonate (MS222)	Sigma-Aldrich	E10521	We use this compound to anesthetize the fish larvae