Imagerie calcique et stimulation du glucose simultanées chez le poisson-zèbre vivant pour étudier la fonction β-cellules in vivo

Résumé

Ici, l’étude présente un protocole d’imagerie calcique et de stimulation du glucose des cellules β pancréatiques du poisson zèbre in vivo.

Résumé

Les cellules β pancréatiques maintiennent l’homéostasie systémique du glucose en produisant et en sécrétant de l’insuline en fonction de la glycémie. Les défauts de fonction des cellules β sont associés à l’hyperglycémie qui peut conduire au diabète. Au cours du processus de sécrétion d’insuline, les cellules β subissent un afflux de Ca²⁺. Ainsi, l’imagerie de l’afflux de Ca²⁺ stimulé par le glucose à l’aide d’indicateurs calciques génétiquement codés (GECI) offre une voie vers l’étude de la fonction des cellules β. Auparavant, des études ont montré que des îlots isolés de poisson-zèbre exprimant des GCaMP6 présentent une activité Ca²⁺ significative lors de la stimulation avec des concentrations de glucose définies. Cependant, il est primordial d’étudier comment les cellules β réagissent au glucose non pas de manière isolée, mais dans leur environnement d’origine, où elles sont systémiquement connectées, vascularisées et densément innervées. À cette fin, l’étude a exploité la transparence optique des larves de poisson-zèbre aux premiers stades de développement pour éclairer l’activité des cellules β in vivo. Ici, un protocole détaillé pour l’imagerie Ca²⁺ et la stimulation du glucose afin d’étudier la fonction des cellules β in vivo est présenté. Cette technique permet de surveiller la dynamique coordonnée du Ca²⁺ dans les cellules β avec une résolution unicellulaire. De plus, cette méthode peut être appliquée pour travailler avec n’importe quelle solution injectable telle que de petites molécules ou des peptides. Dans l’ensemble, le protocole illustre le potentiel du modèle de poisson-zèbre pour étudier la coordination des îlots de Langerhans in vivo et pour caractériser comment les composants environnementaux et génétiques pourraient affecter la fonction des cellules β.

Introduction

Les cellules β pancréatiques présentent la capacité unique de sécrétion d’insuline en réponse au glucose. Après un repas riche en glucides, la glycémie augmente et pénètre dans les cellules β, où elle est rapidement métabolisée pour produire de l’ATP. L’augmentation du rapport intracellulaire ATP/ADP conduit à la fermeture des canaux K⁺ dépendants de l’ATP, dépolarisant la membrane cellulaire et activant les canaux Ca²⁺ dépendants de la tension. L’augmentation rapide du Ca²⁺ intracellulaire stimule la sécrétion de granules d’insuline par les cellules β.

L’imagerie des cellules des îlots pancréatiques intacts chez la souris est exigeante et nécessite l’extériorisation de l’organe entier. Une alternative puissante pour l’imagerie in vivo non invasive consiste à transplanter des îlots dans la chambre antérieure (CA) de l’œil de souris¹. Les îlots transplantés dans l’AC de souris imitent un environnement in vivo, permettant des études longitudinales et l’imagerie Ca²⁺ in vivo ^2,3. Néanmoins, le processus de revascularisation des îlots pancréatiques peut prendre plusieurs semaines après la transplantation d’îlots^{pancréatiques 4}. Ainsi, la préservation de l’environnement natif d’origine, où les cellules β sont vascularisées et connectées à l’état métabolique de l’organisme, et l’obtention d’une résolution d’imagerie unicellulaire in vivo restent très difficiles et prennent beaucoup de temps.

Pour surmonter ces limitations, les chercheurs ont développé des lignées transgéniques de poisson-zèbre exprimant des GECI dans les cellules β, qui permettent de visualiser en temps réel l’afflux de Ca²⁺ dans les cellules β^{5, 6, 7, 8, 9}. À l’aide de ces outils, il a été constaté qu’en culture cellulaire, les β-cellules de poisson-zèbre présentent une réponse conservée à une glycémie élevée, similaire à celle des îlots de souris et humains. De plus, la clarté optique des larves de poisson-zèbre a permis d’examiner la fonction des cellules β dans leur environnement d’origine. Il est important de noter que dès 4 jours après la fécondation (dpf), les cellules β de l’îlot primaire du poisson-zèbre expriment des marqueurs de maturité, tels que l’orthologue de l’urocortine3 du poisson-zèbre (ucn3l) et montrent des réponses in vitro au glucose dans la plage physiologique⁶. De plus, l’îlot poisson-zèbre est densément vascularisé et innervé¹⁰. L’ablation génétique des cellules β à ce stade conduit à une intolérance au glucose. De plus, le poisson-zèbre présente des réponses conservées aux agents hypoglycémiants tels que l’insuline et les sulfonylurées, montrant que l’îlot primaire est un tissu sensible au glucose et connecté de manière systémique contrôlant les niveaux de glucose. Ces caractéristiques particulières font du poisson-zèbre un modèle unique pour étudier l’activité des îlots β-cellules in vivo^11,12.

Le protocole d’imagerie Ca²⁺ et d’injection simultanée de glucose directement dans la circulation du poisson-zèbre permet d’étudier la réactivité au glucose de la cellule β in vivo. Ce protocole permet l’injection de concentrations de glucose définies en combinaison avec une résolution temporelle et spatiale élevée, qui révèlent ensemble la réponse coordonnée des cellules β au glucose et la présence de cellules β premières répondantes in vivo¹³. De plus, le protocole peut être adapté à toute solution injectable telle que les composés chimiques ou les petits peptides. Dans l’ensemble, cette méthodologie illustre la force du modèle du poisson-zèbre pour étudier la coordination des cellules β in vivo et pour caractériser comment les composants environnementaux et génétiques pourraient affecter la fonction des cellules β.

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Protocole

Les lignées transgéniques précédemment établies utilisées dans cette étude étaient les suivantes : Tg(ins :GCaMP6s ; cryaa :mCherry)⁶, Tg(ins :cdt1-mCherry ; cryaa :CFP)¹⁴. Toutes les expériences ont été réalisées dans le respect des lois de l’Union européenne et de l’Allemagne (Tierschutzgesetz) et avec l’approbation des comités d’éthique de l’Université technique de Dresde et des Landesdirektion Sachsen (numéros d’agrément : AZ 24D-9168, 11-1/2013-14, TV38/2015, T12/2016 et T13/2016, TVV50/2017, TVV 45/2018 et TVV33-2019). Dans cette étude, toutes les injections d’imagerie en direct in vivo et de glucose, ainsi que les procédures expérimentales ont été réalisées avec des larves de poisson-zèbre qui n’ont pas dépassé le stade de 5 jours après la fécondation (dpf), comme indiqué dans la loi sur la protection des animaux (TierSchVersV §14). Selon la directive européenne 2010/63/UE, l’utilisation de ces premiers stades de poisson-zèbre réduit le nombre d’animaux de laboratoire, selon les principes des 3R.

1. Préparation

REMARQUE : Ce protocole concerne l’imagerie in vivo Ca²⁺ de l’îlot primaire du poisson-zèbre à partir de Tg(ins :cdt1-mCherry ; cryaa :CFP) ; Tg(ins :GCaMP6s ; cryaa :mCherry) larves transgéniques doubles. Chez ces animaux, le promoteur de l’insuline pilote l’expression de cdt1-mCherry, qui marque les noyaux des cellules β individuelles en fluorescence rouge. GCaMP6s montre des changements dans la fluorescence verte en réponse aux niveaux intracellulaires de Ca²⁺ . L’expression spécifique des GCaMP6 dans les cellules β permet de caractériser la réactivité au glucose des cellules individuelles sans interférence d’autres types de cellules ou de tissus.

1. Préparer le milieu embryonnaire E2¹⁵.
2. Préparez 0,003 % (200 μm) de 1-phéniyl-2-thiourée (PTU) dans une solution saline de Hanks^{15 à 10} %.
3. Préparez de l’agarose à bas point de fusion (LMA) à 1 % dans un milieu embryonnaire E2 en la chauffant au micro-ondes et en la filtrant avec un filtre à pores de <25 μm. Maintenir la LMA à >37 °C jusqu’à 1 semaine.
   REMARQUE : Toutes les solutions doivent être filtrées pour éviter l’obstruction du capillaire en verre utilisé pour l’injection.
4. Préparez une solution à 0,4 % de sulfonate de méthane de tricaïne (MS222) avec 979 mL de H₂O stérile et 21 mL de 1 M de Tris (pH 9). Ajustez le pH à 7.
5. Dissoudre 1,8 g de D-glucose dans 50 mL de PBS pour préparer une solution de D-glucose de 200 mM et la filtrer avec des filtres de < de 25 μm de la taille des pores. Préparez une solution de travail de D-Glucose (25 mM) par dilution 1:8 de 200 mM de D-Glucose dans 1x PBS (filtré). Conserver à 4 °C pour un stockage à long terme. Ajouter 5 μL de rouge de phénol à 1 mL de D-glucose 25 mM pour pouvoir visualiser la solution lors de l’injection.
   REMARQUE : Cette solution peut être conservée à 4 °C pendant 1 semaine. Cependant, la solution de travail de 25 mM doit être préparée fraîche. Jetez le bouillon s’il y a le moindre signe de contamination.
6. Préparez des capillaires en verre de micro-injection à l’aide d’un extracteur de capillaire ou procurez-vous des capillaires en micro-verre disponibles dans le commerce. Les paramètres de tirage de l’aiguille sont décrits dans la Table des matériaux.
   REMARQUE : Les capillaires de micro-injection en verre borosilicate sans filament interne se sont avérés offrir de meilleurs résultats par rapport aux capillaires similaires avec filament interne.
7. Procurez-vous des plats à fond de verre de 35 mm de diamètre pour monter les larves de poisson-zèbre. Des paraboles à fond de verre avec un couvercle en verre de 0,17 mm ont été utilisées dans ce protocole, car elles permettent l’imagerie avec des objectifs corrigés en verre dans les systèmes confocaux.
8. Procurez-vous des pointes de pipette à microchargement. Des micro-chargeurs de 20 μL d’une longueur de 100 mm ont été utilisés dans ce protocole.
9. Procurez-vous un ensemble de micro-pinces à épiler.
10. Procurez-vous des boîtes de Pétri de 90 mm pour le tri et l’élevage du poisson-zèbre.
11. Procurez-vous de l’huile minérale.
12. Procurez-vous une micropompe pneumatique ou un système pour fournir 1 à 5 nL de volumes de liquide à travers les capillaires en verre.
13. Pour le tri et le montage du poisson-zèbre, utilisez un stéréomicroscope équipé d’une source lumineuse et de cubes filtrants bleus et rouges pour la fluorescence (CFP : excitation 420-450 nm, émission 460-490 nm, TRITC : excitation : 532-554 nm, émission : 570-613 nm ; ou Texas-Red : excitation : 540-580 nm, émission : 592-667 nm). Trier le double transgénique Tg(ins :cdt1-mCherry ; cryaa :CFP) ; Tg(ins :GCaMP6s ; cryaa :mCherry) à l’aide du stéréoscope. Sélectionnez les embryons avec une fluorescence bleue et rouge dans la rétine en raison de l’expression de CFP et mCherry sous le promoteur de cristalline.
14. Pour imager l’afflux de Ca²⁺ dans les cellules β, utilisez un microscope confocal inversé équipé d’un objectif d’air 10x (0,8 NA) et d’un objectif d’eau 40x (1,0 NA). Utilisez une platine contenant le support de plaque pour les plats à fond de verre de 35 mm de diamètre.
15. Procurez-vous un manipulateur 3D manuel ou motorisé avec un support capillaire. Insérez le capillaire en verre dans le support capillaire et montez le support capillaire dans le manipulateur 3D.
    REMARQUE : Le manipulateur 3D permet un mouvement précis du capillaire en verre et l’insertion dans les larves de poisson-zèbre.

2. Montage des larves de poisson-zèbre

REMARQUE : Le double transgénique Tg(ins :cdt1-mCherry ; cryaa :CFP) ; Tg(ins :GCaMP6s ; cryaa :mCherry) sont traités avec 0,03 % (20 μM) de 1-phényl-2-thiourée (PTU) pour inhiber la pigmentation à partir de 24 h après la fécondation. À 4,5 dpf, anesthésier les larves en utilisant 0,04 % de la concentration finale de tricaïne juste avant le montage.

1. Pour maintenir l’anesthésie pendant la séance d’imagerie, ajoutez à l’agarose à bas point de fusion à 1 % une concentration finale de 0,04 % de tricaïne et 20 μM de PTU. Maintenir l’agarose LMA à >37 °C jusqu’à l’utilisation. Utilisez cette solution le jour même de la préparation.
2. Trier le double transgénique anesthésié Tg(ins :cdt1-mCherry ; cryaa :CFP) ; Tg(ins :GCaMP6s ; cryaa :mCherry) larves. Placez 3 à 5 poissons sur une boîte de Pétri à fond de verre et retirez la majeure partie du liquide.
   REMARQUE : Ne laissez pas les larves sécher à cette étape et gardez-les toujours immergées dans une quantité minimale de E2.
3. Ajoutez 500 μL de LMA sur la boîte de Pétri à fond de verre contenant le poisson et, à l’aide de la micro-pince à épiler, déplacez doucement le poisson de manière à ce que le côté droit du poisson soit directement en contact avec le fond de verre. Retirez l’excès d’agarose et laissez-le se solidifier pendant 1 à 3 min. Observez que l’agarose devient légèrement opaque à ce point (Figure 1B).
   REMARQUE : Si l’agarose est trop chaude, elle pourrait endommager les larves. Pour éviter cela, laissez l’agarose refroidir à température ambiante pendant 30 à 45 s avant de l’ajouter aux larves.
4. Une fois que l’agarose devient solide, à l’aide de la micropince à épiler, retirez soigneusement l’agarose autour de la zone du cœur pour éviter la rupture de l’aiguille utilisée pour l’injection ultérieure au contact de l’agarose (figure 1C).
5. Ajouter 500 μL d’E2 contenant une concentration finale de 0,04 % de tricaïne et 20 μM de PTU.
   REMARQUE : Assurez-vous d’éviter le dessèchement des larves pendant l’imagerie en direct.

3. Injection simultanée et imagerie Ca²⁺ des cellules β

REMARQUE : Les larves qui ont un jaune excessif sur le dessus du pancréas en raison d’un retard de développement ne doivent pas être utilisées pour l’imagerie car les lipides du jaune interfèrent avec la qualité de l’image. De plus, de faibles puissances laser sont utilisées (0,5 % à 5 %) pour éviter le photoblanchiment et la phototoxicité.

1. À l’aide d’un stéréomicroscope et d’une micro-pince à épiler, coupez l’extrémité du capillaire en verre.
   REMARQUE : Ne coupez pas plus que l’extrémité du capillaire, car le diamètre du capillaire doit être plus petit que la voie d’entrée du cœur du poisson zèbre.
2. À l’aide des embouts de chargement, remplissez l’aiguille avec la solution de D-Glucose de 25 mM.
   REMARQUE : Le capillaire doit être rempli uniformément, en prenant soin d’éviter la formation de bulles d’air car elles interfèrent avec l’administration de volumes d’injection appropriés.
3. Montez le capillaire en verre dans le support capillaire et connectez-le à la micro-pompe. Maintenez la micropompe à une pression d’injection comprise entre 500 et 1 000 hPa, une pression de compensation = 0 hPa et un temps de refoulement = 1 s.
4. Pour calibrer le volume d’injection, utilisez un stéréomicroscope équipé d’un oculaire gradué. Placez une goutte d’huile minérale dans une lame de verre sous le stéréoscope. Réglez le zoom du stéréoscope à une puissance de 4 avec un objectif 1,5x. Insérer pour injecter le capillaire en verre dans l’huile minérale.
   REMARQUE : 5 nL équivaut à 5 unités de la graduation indiquée dans l’oculaire du stéréoscope. Augmentez ou diminuez la pression d’injection de la micro-pompe pour ajuster le volume de la goutte.
5. Montez le support capillaire dans le manipulateur 3D.
   REMARQUE : Le manipulateur 3D doit permettre un contrôle précis des mouvements dans les directions x, y et z du support capillaire.
6. Placez soigneusement la parabole contenant les larves montées sur le support de plaque du microscope confocal. Utilisez un objectif aérien 10x, 0,8 NA pour localiser les larves à l’aide de l’option de champ clair.
7. Orientez le poisson-zèbre avec le côté du cœur vers la direction où se trouvent le capillaire et le manipulateur 3D. En observant la fluorescence rouge, assurez-vous que l’îlot est au centre du champ de vision.
   REMARQUE : À partir de ce moment, la platine doit rester fixe (Figure 2).
8. À l’aide du manipulateur 3D, déplacez le capillaire de verre vers le cœur des larves, pénétrez la peau et visez la cavité péricardique. Insérez soigneusement le capillaire au milieu de la veine cardinale commune (CVC) et du sinus veineux (SV), situés à environ 100-200 μm de l’oreillette cardiaque¹⁶, (Figure 1B et Figure 2C). L’angle de l’aiguille est d’environ 20-30° par rapport à la surface de la plaque. Si le bord de la plaque est trop haut, retirez-la pour permettre un accès plus facile au capillaire.
   REMARQUE : Il s’agit d’une étape critique, car une pénétration très prudente est requise ; Des mouvements rapides peuvent perturber le cœur ou provoquer des vêtements sanguins dans cette zone. Si le flux sanguin est perturbé, un échantillon différent doit être utilisé. Étant donné que le manipulateur 3D garde une position fixe, évitez les mouvements de la platine afin de ne pas interférer avec le tissu cardiaque.
9. Une fois le capillaire placé dans le SV, passez à un objectif d’immersion dans l’eau 40x, 1,2 NA. À l’aide des miroirs dichromatiques 488/561 rouges et verts, trouvez le signal nucléaire mCherry dans les cellules β et concentrez-vous sur l’îlot.
   REMARQUE : Les noyaux individuels doivent être clairement visibles et une faible fluorescence verte doit être présente (Figure 1D).
10. Configurez une acquisition simultanée pour la fluorescence GCaMP6s et mCherry avec les paramètres suivants dans le menu Smart Setup : GFP (GCaMP6s), excitation : 488 nm, émission : 498-555 nm, fausse couleur : vert (sélectionnez GFP) ; mCherry, excitation : 561 nm (mCherry), émission : 570-640 nm, fausse couleur : rouge (Select mCherry). Lumière transmise, fausse couleur : gris.
11. Ajustez le plan d’imagerie en ajustant le plan focal le long de l’axe z de l’îlot. Trouvez un plan qui contient la majorité des cellules β.
12. Ajustez le gain du signal nucléaire mCherry pour une identification uniforme de chaque cellule individuelle et couvrant environ 70 % de l’histogramme couleur.
13. Ajustez le gain du signal GCaMP6s pour couvrir au moins 25 % de l’histogramme couleur, car le GCaMP6s augmente sa luminosité jusqu’à 4 fois.
14. Ajustez le gain de la lumière transmise pour un signal uniforme de l’échantillon couvrant environ 70 % de l’histogramme couleur.
    REMARQUE : Le canal gris est utilisé pour visualiser et assurer une bonne circulation sanguine de l’îlot.
15. En mode d’acquisition, réglez la résolution de l’image sur 512 x 512 pixels, le zoom sur 5, le pas de ligne sur 3, la vitesse de balayage sur 13 et la moyenne de la ligne sur 2-3. Sélectionnez l’option Série chronologique et définissez la durée sur 500 cycles, avec un taux d’acquisition de 150 ms par image.
    REMARQUE : Les 50 premières images de la série chronologique correspondent à la fluorescence de base avant l’injection de glucose. Il a été observé que certaines cellules β présentent une activité basale in vivo. Une cellule β répondante montrera une augmentation de l’intensité de la fluorescence verte avec l’injection de glucose au fil du temps. La plupart des cellules β montrent une réponse à l’injection de glucose de 25 mM in vivo.
16. Démarrez l’imagerie. Après les 50 premières images (7,5 s), injectez le glucose à l’aide de la micro-pompe.
    REMARQUE : Les injections peuvent produire un léger mouvement qui peut déplacer le plan focal de l’îlot. Pendant l’enregistrement vidéo, les mouvements intestinaux peuvent modifier le plan focal de l’îlot.
17. Gardez un œil sur l’acquisition de l’image et ajustez manuellement les coordonnées x, y et z pour conserver le même plan focal tout au long de la vidéo.
18. Après l’injection de glucose, le système enregistre la réponse des îlots en termes d’afflux de Ca²⁺ sous la forme d’une augmentation de la fluorescence du GCaMP. Après chaque injection, laissez reposer les larves pendant au moins 5 min avant toute stimulation supplémentaire.
    REMARQUE : Assurez-vous que les noyaux des cellules restent stables pendant le processus. Si l’îlot se déplace considérablement pendant l’acquisition ou s’il s’est déplacé hors du plan focal, l’échantillon ne peut pas être utilisé pour une analyse plus approfondie.
19. Répétez l’injection trois fois. Enregistrez les vidéos aux formats TIF, CZI ou LSM (recommandé). Après avoir enregistré les réponses Ca²⁺ , retirez très lentement le capillaire du cœur. Passez à l’échantillon suivant.
    REMARQUE : Les larves de poisson-zèbre peuvent être récupérées dans une boîte de Pétri avec de l’E2 frais contenant du PTU.

4. Quantification des traces de fluorescence de GCaMP pour les cellules β individuelles

REMARQUE : Si l’animal présente trop de mouvement, le film peut être stabilisé à l’aide du repérage de série basé sur le descripteur du plug-in FIJI (2d/3d + t)¹⁷.

1. Chargez l’image à analyser par glisser-déposer dans FIJI. Dans la fenêtre Options d’importation du bioformat, cliquez sur OK.
   REMARQUE : Pour les formats non pris en charge par FIJI, convertissez les vidéos au format tiff pour l’analyse.
2. Pour extraire l’intensité fluorescente du GCaMP, cliquez sur le menu Analyser > définir les mesures. Cochez la case Densité intégrée et cliquez sur OK.
   1. Ouvrez le Gestionnaire de retour sur investissement.
   2. Dans le menu FIDJI, sélectionnez Sélections de polygones dans la barre d’outils.
   3. Dessinez manuellement un polygone couvrant une zone légèrement plus grande que le noyau cellulaire et incluant une partie de la zone cytoplasmique de la cellule pour assurer une quantification correcte de la réponse Ca²⁺ sur une seule cellule.
   4. Assurez-vous que la position du retour sur investissement est cohérente sur les cadres ; si nécessaire, ajustez le retour sur investissement.
   5. Ajoutez le retour sur investissement sélectionné au gestionnaire de retour sur investissement en cliquant sur le bouton Ajouter [t].
3. Pour quantifier le signal du GCaMP, séparez les canaux de l’image. Cliquez sur le menu FIJI Image > Couleurs > Diviser les canaux et sélectionnez Canal vert.
4. Dans le gestionnaire de retour sur investissement, sélectionnez toutes les zones et cliquez sur le menu Plus > Multi Mesure. Enregistrez les résultats.
   REMARQUE : Si la cellule se déplace hors de la zone du polygone en raison de l’injection de glucose ou du mouvement de l’animal, extrayez la fluorescence de la cellule avant et après le mouvement en ajustant manuellement la zone du polygone.
5. Pour effectuer l’analyse de cellule unique, procédez comme suit.
   1. Retirez la florescence d’arrière-plan. À cette fin, considérez la fluorescence d’arrière-plan comme la valeur minimale enregistrée sur le film pour chaque cellule (F_MIN). Le minimum est soustrait de l’ensemble de la série chronologique (F_T - F_MIN) pour chaque cellule.
   2. Normalisez les valeurs de fluorescence sur l’ensemble du film. Pour ce faire, divisez chaque valeur par la valeur d’intensité la plus élevée sur les enregistrements de chaque cellule. Pour ce faire, calculez la différence entre F_MIN et F_MAX, c’est-à-dire (F_MAX - F_MIN). Divisez (_{F T} - F_MIN) / (F_MAX - F_MIN).
      REMARQUE : Cette étape permet de comparer la réponse Ca²⁺ entre différentes cellules et entre des îlots de langerhans de différents animaux, car ils émettront des niveaux variables d’intensités fluorescentes en fonction du plan focal et de l’accessibilité de la cellule ou de l’îlot à l’imagerie.
6. Après l’acquisition des valeurs de fluorescence d’une seule cellule, utilisez un programme (par exemple, Excel ou R) pour traiter les valeurs fluorescentes mesurées à l’étape 4 et tracer automatiquement les traces fluorescentes. Pour effectuer l’analyse dans le cadre de ce protocole (étape 6), le tableau supplémentaire 1 (Singlecelltrace.xlsx) a été utilisé.

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Résultats

À l’aide de ce protocole, la réponse glycémique des β-cellules individuelles dans leur environnement natif a été caractérisée. Pour ce faire, la larve de poisson-zèbre est montée sur une boîte de Pétri à fond de verre. À l’aide d’un manipulateur 3D, un capillaire en verre a été inséré dans la circulation, ciblant le SV (Figure 1 et Figure 2). Cela permet d’injecter des volumes spécifiques de solutions ...

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Discussion

Dans ce protocole, la dynamique Ca²⁺ des cellules β dans leur microenvironnement natif avec une résolution unicellulaire a été explorée. Cela est possible en stimulant les β-cellules du poisson-zèbre avec une injection de glucose dans la circulation tout en enregistrant leur dynamique Ca²⁺ à l’aide de GCaMP6.

Le protocole offre trois avantages principaux. Tout d’abord, les chercheurs ont démontré que les β-cellules du poiss...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm diameter glass-bottom dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C	We use this glass-bottom dish to mount the zebrafish larvae and perform confocal microscopy
Blue-Green filter cube	ZEISS	489038-9901-000	Filter Set 38 HE
Confocal Microscope	ZEISS	LSM 980
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Excel (2016)			https://www.office.com/
Femtojet	Eppendorf	5252000013	This equipment is a pneumatic micropump, which allows precise volume delivery and is accompanied by a capillary holder. We use the micropump Femtojet (injection pressure between 500-1000 hPa; compensation pressure = 0 hPa; and delivery time = 1 second).
Femtotips, glass capillaries ready to be used.	Eppendorf	5242952008	This are ready to use glass capillaries that can substitute the pulled-capillaries.
FIJI, using ImageJ Version: 1.51c			https://fiji.sc/
Fluorescence lamp	ZEISS	423013-9010-000	Illuminator HXP 120 V
Glass capillaries 3.5"	Drummonds Scientific Company	3-000-203-G/X	We use these glass capillaries to prepare the injection capillaries by pulling them with a capillary -puller
Injectman	Eppendorf	5192000019	This equipment allows for 3D manipulation of the capillary holder
Low melting agarose	Biozym	Art. -Nr.: 840101	We use the agarose to mount the zebrafish onto the glass-bottom dish
Microloader tip for glass microcapillaries 0.5 – 20 µL, 100 mm	Eppendorf	5242956003	Long tips for loading the glass capillaries with the solutions
Micro-tweezers	Dumont Swiss made	0102-4-PO	We use the micro-tweezers to move the zebrafish larvae during the mounting and to cut off the tip of the glass capillary (eg. Dumont, size 4).
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904	We use the mineral oil to calibrate the drop size to inject
P-1000 Next Generation Pipette Puller	Science Products	P-1000	We use this capillary puller to prepare the glass capillary using the Drumond capillaries. We use the P-1000 capillary puller with the following parameters: Heat: 650, Pull: 20, Vel: 160, Time: 200, Pressure: 500.
PTU (1-phenyl-2-thiourea )	Sigma-Aldrich	P7629	We use this compound to inhibit pigmentation during zebrafish development
Red Filter Cube	ZEISS	000000-1114-462	Filter set 45 HQ TexasRed
Stereo microscope	ZEISS	495015-0001-000	SteREO Discovery.V8
Syringe filters, sterile. Pore size 0.2 µm	Pall Corporation	4612	We use these to filter all the solutions and prevent the capillary needle clothing
Transgenic Zebrafish line:Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)
tricaine methanesulfonate (MS222)	Sigma-Aldrich	E10521	We use this compound to anesthetize the fish larvae