Gleichzeitige Calcium-Bildgebung und Glukosestimulation in lebenden Zebrafischen zur Untersuchung der in vivo β-Zell-Funktion

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Kalziumbildgebung und Glukosestimulation der Pankreas-β-Zellen des Zebrafisches in vivo vorgestellt.

Zusammenfassung

Die β-Zellen der Bauchspeicheldrüse halten die systemische Glukosehomöostase aufrecht, indem sie Insulin entsprechend dem Blutzuckerspiegel produzieren und ausschütten. Defekte in der β-Zell-Funktion sind mit Hyperglykämie verbunden, die zu Diabetes führen kann. Während des Prozesses der Insulinsekretion kommt es bei β-Zellen zu einem Einstrom von Ca²⁺. Daher bietet die Abbildung des glukosestimulierten Ca2⁺ -Einstroms mit genetisch kodierten Kalziumindikatoren (GECIs) einen Weg, um die β-Zell-Funktion zu untersuchen. Frühere Studien zeigten, dass isolierte Zebrafischinseln, die GCaMP6s exprimieren, nach Stimulation mit definierten Glukosekonzentrationen eine signifikante Ca2⁺ -Aktivität aufweisen. Es ist jedoch von größter Bedeutung zu untersuchen, wie β-Zellen nicht isoliert, sondern in ihrer natürlichen Umgebung auf Glukose reagieren, wo sie systemisch verbunden, vaskularisiert und dicht innerviert sind. Zu diesem Zweck nutzte die Studie die optische Transparenz der Zebrafischlarven in frühen Entwicklungsstadien, um die β-Zell-Aktivität in vivo zu beleuchten. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Ca2⁺ -Bildgebung und Glukosestimulation zur Untersuchung der β-Zell-Funktion in vivo vorgestellt. Diese Technik ermöglicht es, die koordinierte Ca2⁺ -Dynamik in β-Zellen mit Einzelzellauflösung zu überwachen. Darüber hinaus kann diese Methode auf die Arbeit mit jeder injizierbaren Lösung wie kleinen Molekülen oder Peptiden angewendet werden. Insgesamt veranschaulicht das Protokoll das Potenzial des Zebrafischmodells, die Inselkoordination in vivo zu untersuchen und zu charakterisieren, wie Umwelt- und genetische Komponenten die β-Zell-Funktion beeinflussen könnten.

Einleitung

Die β-Zellen der Bauchspeicheldrüse weisen die einzigartige Fähigkeit zur Insulinsekretion als Reaktion auf Glukose auf. Nach einer kohlenhydratreichen Mahlzeit steigt der Blutzucker an und gelangt in die β-Zellen, wo er schnell verstoffwechselt wird, um ATP zu produzieren. Die Erhöhung des intrazellulären Verhältnisses von ATP/ADP führt zum Verschluss der ATP-abhängigen K⁺ -Kanäle, wodurch die Zellmembran depolarisiert und die spannungsabhängigen Ca2⁺ -Kanäle aktiviert werden. Der rasche Anstieg des intrazellulären Ca2⁺ -Gehalts stimuliert die Insulin-Granula-Sekretion durch die β-Zellen.

Die Darstellung der Inselzellen in der intakten Bauchspeicheldrüse bei Mäusen ist anspruchsvoll und erfordert eine Exteriorisation des gesamten Organs. Eine leistungsfähige Alternative für die nicht-invasive In-vivo-Bildgebung ist die Transplantation von Inselzellen in die Vorderkammer (AC) des Auges von Mäusen¹. Transplantierte Inselzellen in die AC von Mäusen ahmen eine in vivo-Umgebung nach und ermöglichen Längsschnittstudien und Ca2⁺-Bildgebung in vivo ^2,3. Dennoch kann der Prozess der Revaskularisation von Inselzellen nach der Inseltransplantation mehrere Wochen dauern⁴. Daher bleiben die Erhaltung der ursprünglichen natürlichen Umgebung, in der die β-Zellen vaskularisiert und mit dem Stoffwechselstatus des Organismus verbunden sind, und das Erreichen einer In-vivo-Einzelzell-Bildgebungsauflösung nach wie vor eine große Herausforderung und zeitaufwändig.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben Forscher transgene Zebrafischlinien entwickelt, die GECIs in β-Zellen exprimieren und eine Echtzeit-Visualisierung des Ca2⁺-Einstroms in β-Zellen^ermöglichen 5,6,7,8,9. Mit diesen Werkzeugen wurde festgestellt, dass Zebrafische β-Zellen in Zellkulturen eine konservierte Reaktion auf erhöhte Glukose zeigen, ähnlich wie bei Mäusen und menschlichen Inseln. Darüber hinaus hat die optische Klarheit der Zebrafischlarven es ermöglicht, die Funktion der β-Zellen in ihrer natürlichen Umgebung zu untersuchen. Wichtig ist, dass die β-Zellen der primären Zebrafischinsel bereits 4 Tage nach der Befruchtung (dpf) Reifemarker exprimieren, wie z. B. das Zebrafisch-Ortholog von Urocortin3 (ucn3l) und in vitro Reaktionen auf Glukose im physiologischen Bereich^{zeigen 6}. Darüber hinaus ist das Zebrafisch-Inselchen dicht vaskularisiert und innerviert¹⁰. Die genetische Ablation von β-Zellen in diesem Stadium führt zu einer Glukoseintoleranz. Darüber hinaus zeigt der Zebrafisch konservierte Reaktionen auf glukosesenkende Wirkstoffe wie Insulin und Sulfonylharnstoffe, was zeigt, dass die primäre Insel ein glukoseresponsives und systemisch verbundenes Gewebe ist, das den Glukosespiegel steuert. Diese besonderen Eigenschaften machen den Zebrafisch zu einem einzigartigen Modell für die Untersuchung der Insel- β-Zell-Aktivität in vivo^11,12.

Das Protokoll für die Ca2^+-Bildgebung und die gleichzeitige Glukoseinjektion direkt in den Blutkreislauf des Zebrafisches ermöglicht es, die Glukosereaktionsfähigkeit der β-Zellen in vivo zu untersuchen. Dieses Protokoll ermöglicht die Injektion definierter Glukosekonzentrationen in Kombination mit einer hohen zeitlichen und räumlichen Auflösung, die insgesamt die koordinierte Reaktion der β-Zellen auf Glukose und das Vorhandensein von First-Responder-β-Zellen in vivo zeigen ¹³. Darüber hinaus kann das Protokoll an jede injizierbare Lösung wie chemische Verbindungen oder kleine Peptide angepasst werden. Insgesamt verdeutlicht diese Methodik die Stärke des Zebrafischmodells, um die β-Zell-Koordination in vivo zu untersuchen und zu charakterisieren, wie umweltbedingte und genetische Komponenten die Funktion β-Zellen beeinflussen könnten.

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Protokoll

Die zuvor etablierten transgenen Linien, die in dieser Studie verwendet wurden , waren Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)⁶, Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP)¹⁴. Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit dem Tierschutzgesetz der Europäischen Union und Deutschlands und mit Genehmigung der Ethikkommissionen der TU Dresden und der Landesdirektion Sachsen durchgeführt (Zulassungsnummern: AZ 24D-9168, 11-1/2013-14, TV38/2015, T12/2016 und T13/2016, TVV50/2017, TVV 45/2018 und TVV33-2019). In dieser Studie wurden alle live Imaging in vivo und Glukoseinjektionen sowie experimentelle Verfahren mit Zebrafischlarven durchgeführt, die das im Tierschutzgesetz (TierSchVersV §14) festgelegte Stadium von 5 Tagen nach der Befruchtung (dpf) nicht überschritten haben. Gemäß der EU-Richtlinie 2010/63/EU reduziert die Verwendung dieser früheren Zebrafischstadien die Anzahl der Versuchstiere, nach den Prinzipien der 3R.

1. Vorbereitung

HINWEIS: Dieses Protokoll bezieht sich auf die in vivo ^Ca2+ -Bildgebung der primären Zebrafisch-Insel von Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) doppelt transgene Larven. Bei diesen Tieren steuert der Insulinpromotor die Expression von cdt1-mCherry, das die Zellkerne einzelner β-Zellen in roter Fluoreszenz markiert. GCaMP6s zeigt Veränderungen der grünen Fluoreszenz als Reaktion auf die intrazellulären Ca2⁺ -Spiegel. Die spezifische Expression der GCaMP6s in β-Zellen ermöglicht die Charakterisierung der Glukose-Responsiveness einzelner Zellen ohne die Interferenz durch andere Zelltypen oder Gewebe.

1. Embryonale Medien E2 vorbereiten¹⁵.
2. 0,003 % (200 μm) 1-Pheniyl-2-thioharnstoff (PTU) in 10 % Hanks-Kochsalzlösung¹⁵ herstellen.
3. Bereiten Sie 1 % niedrigschmelzende Agarose (LMA) in embryonalem E2-Medium her, indem Sie sie in einer Mikrowelle erhitzen und mit einem Filter mit einer Porengröße von <25 μm filtrieren. Halten Sie den LMA bis zu 1 Woche lang bei >37 °C.
   HINWEIS: Alle Lösungen sollten filtriert werden, um ein Verstopfen der für die Injektion verwendeten Glaskapillare zu verhindern.
4. Bereiten Sie eine 0,4%ige Lösung von Tricain-Methansulfonat (MS222) mit 979 ml sterilem H₂O und 21 ml 1 M Tris (pH 9) vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7 ein.
5. Löse 1,8 g D-Glucose in 50 mL PBS auf, um 200 mM D-Glucose-Lösung herzustellen, und filtriere sie mit <25 μm Porenfiltern. Bereiten Sie eine Arbeitslösung aus D-Glucose (25 mM) durch eine 1:8-Verdünnung der 200 mM D-Glucose in 1x PBS (filtriert) her. Zur Langzeitlagerung bei 4 °C aufbewahren. Fügen Sie 5 μl Phenolrot zu 1 mL 25 mM D-Glucose hinzu, um die Lösung bei der Injektion visualisieren zu können.
   HINWEIS: Diese Lösung kann 1 Woche lang bei 4 °C aufbewahrt werden. Die 25 mM Arbeitslösung sollte jedoch frisch zubereitet werden. Entsorgen Sie die Brühe, wenn es Anzeichen von Verunreinigungen gibt.
6. Bereiten Sie gezogene Mikroinjektionsglaskapillaren mit einem Kapillarabzieher vor oder beschaffen Sie sich handelsübliche Mikroglaskapillaren. Die Einstellungen für das Nadelziehen sind in der Materialtabelle beschrieben.
   HINWEIS: Es wurde festgestellt, dass Mikroinjektionskapillaren aus Borosilikatglas ohne internes Filament im Vergleich zu ähnlichen Kapillaren mit internem Filament bessere Ergebnisse liefern.
7. Besorgen Sie sich Glasbodenschalen mit einem Durchmesser von 35 mm für die Montage der Zebrafischlarven. In diesem Protokoll wurden Glasbodenschalen mit einer Glasabdeckung von 0,17 mm verwendet, da sie die Bildgebung mit glaskorrigierten Objektiven in konfokalen Systemen ermöglichen.
8. Besorgen Sie sich Mikrolade-Pipettenspitzen. In diesem Protokoll wurden 20 μL Microloader mit 100 mm Länge verwendet.
9. Besorge dir eine Mikropinzette.
10. Beschaffung von 90 mm Petrischalen zum Sortieren und Züchten von Zebrafischen.
11. Mineralöl beschaffen.
12. Beschaffen Sie eine pneumatische Mikropumpe oder ein System, um 1-5 nL Flüssigkeitsvolumen durch die Glaskapillaren zu fördern.
13. Für die Sortierung und Montage von Zebrafischen verwenden Sie ein Stereomikroskop, das mit einer Lichtquelle und blauen und roten Filterwürfeln für die Fluoreszenz ausgestattet ist (CFP: Anregung 420-450 nm, Emission 460-490 nm, TRITC: Anregung: 532-554 nm, Emission: 570-613 nm; oder Texas-Red: Anregung: 540-580 nm, Strahlung: 592-667 nm). Sortieren Sie die doppelt transgenen Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) Larven mit dem Stereoskop. Wählen Sie die Embryonen mit blauer und roter Fluoreszenz in der Netzhaut aufgrund der Expression von CFP und mCherry unter dem Kristallin-Promotor aus.
14. Um den Ca2⁺ -Einstrom in β-Zellen abzubilden, verwenden Sie ein inverses Konfokalmikroskop, das mit einem 10x (0,8 NA) Luft- und einem 40x (1,0 NA) Wasserobjektiv ausgestattet ist. Verwenden Sie einen Tisch mit dem Tellerhalter für die Glasbodenschalen mit einem Durchmesser von 35 mm.
15. Besorgen Sie sich einen manuellen oder motorisierten 3D-Manipulator mit Kapillarhalter. Setzen Sie die Glaskapillare in den Kapillarhalter ein und montieren Sie den Kapillarhalter in den 3D-Manipulator.
    HINWEIS: Der 3D-Manipulator ermöglicht eine präzise Bewegung der Glaskapillare und das Einführen in die Zebrafischlarven.

2. Montage der Zebrafischlarven

HINWEIS: Das doppelt transgene Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) Embryonen werden mit 0,03% (20 μM) 1-Phenyl-2-thiharnstoff (PTU) behandelt, um die Pigmentierung ab 24 h nach der Befruchtung zu hemmen. Bei 4,5 dpf die Larven kurz vor dem Aufsteigen mit 0,04 % der Endkonzentration von Tricain anästhesieren.

1. Um die Anästhesie während der Bildgebung aufrechtzuerhalten, fügen Sie der 1 % niedrigschmelzenden Agarose eine Endkonzentration von 0,04 % Tricain und 20 μM PTU hinzu. Bewahren Sie die LMA agarose bis zur Verwendung bei >37 °C auf. Verwenden Sie diese Lösung am selben Tag der Zubereitung.
2. Sortieren Sie die anästhesierten doppelt transgenen Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) Larven. Legen Sie 3-5 Fische auf eine Petrischale mit Glasboden und entfernen Sie den größten Teil der Flüssigkeit.
   HINWEIS: Lassen Sie die Larven bei diesem Schritt nicht trocknen und halten Sie sie immer in einer minimalen Menge E2 getaucht.
3. Geben Sie 500 μl LMA auf die Petrischale mit Glasboden, in der sich der Fisch befindet, und bewegen Sie den Fisch mit Hilfe der Mikropinzette vorsichtig so, dass die rechte Seite des Fisches direkt mit dem Glasboden in Kontakt kommt. Die überschüssige Agarose entfernen und 1-3 min fest werden lassen. Es ist zu beobachten, dass die Agarose an dieser Stelle leicht undurchsichtig wird (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Wenn die Agarose zu heiß ist, kann sie die Larven beschädigen. Um dies zu vermeiden, lassen Sie die Agarose 30-45 s bei Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie sie den Larven zugeben.
4. Sobald die Agarose fest wird, entfernen Sie mit Hilfe der Mikropinzette vorsichtig die Agarose im Bereich des Herzens, um einen Bruch der Nadel zu verhindern, die für die nachfolgende Injektion bei Kontakt mit der Agarose verwendet wurde (Abbildung 1C).
5. 500 μl E2 mit einer Endkonzentration von 0,04 % Tricain und 20 μM PTU zugeben.
   HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Larven während der Live-Bildgebung nicht austrocknen.

3. Gleichzeitige Injektion und Ca2⁺ -Bildgebung von β-Zellen

HINWEIS: Larven, die aufgrund einer Entwicklungsverzögerung überschüssiges Eigelb auf der Bauchspeicheldrüse haben, sollten nicht für die Bildgebung verwendet werden, da die Lipide des Eigelbs die Bildqualität beeinträchtigen. Darüber hinaus werden geringe Laserleistungen (0,5%-5%) verwendet, um Photobleiche und Phototoxizität zu vermeiden.

1. Schneide mit einem Stereomikroskop und einer Mikropinzette die Spitze der Glaskapillare ab.
   HINWEIS: Schneiden Sie nicht mehr als nur die Spitze der Kapillare, da der Durchmesser der Kapillare kleiner sein sollte als der Zuflusstrakt des Zebrafischherzens.
2. Füllen Sie die Nadel mit den Ladespitzen mit der 25 mM D-Glucose-Lösung.
   HINWEIS: Die Kapillare muss gleichmäßig gefüllt werden, wobei besonders darauf zu achten ist, dass sich keine Luftblasen bilden, da diese die Abgabe geeigneter Injektionsmengen beeinträchtigen.
3. Montieren Sie die Glaskapillare in den Kapillarhalter und verbinden Sie sie mit der Mikropumpe. Halten Sie die Mikropumpe auf einem Einspritzdruck zwischen 500 und 1.000 hPa, Ausgleichsdruck = 0 hPa und Förderzeit = 1 s.
4. Um das Injektionsvolumen zu kalibrieren, verwenden Sie ein Stereomikroskop, das mit einem abgestuften Okular ausgestattet ist. Geben Sie einen Tropfen Mineralöl in einen Objektträger unter dem Stereoskop. Stellen Sie den Zoom des Stereoskops mit einem 1,5-fachen Objektiv auf eine Potenz von 4 ein. Einsatz zum Einspritzen der Glaskapillare in das Mineralöl.
   HINWEIS: 5 nL entspricht 5 Einheiten der Teilung, die im Okular des Stereoskops angezeigt wird. Erhöhen oder verringern Sie den Einspritzdruck der Mikropumpe, um das Tropfvolumen einzustellen.
5. Montieren Sie den Kapillarhalter in den 3D-Manipulator.
   HINWEIS: Der 3D-Manipulator sollte eine feine Bewegungssteuerung in x-, y- und z-Richtung des Kapillarhalters ermöglichen.
6. Stellen Sie die Schale mit den montierten Larven vorsichtig auf den Plattenhalter des Konfokalmikroskops. Verwenden Sie ein 10x, 0,8 NA Luftobjektiv, um die Larven mit der Hellfeldoption zu lokalisieren.
7. Richten Sie den Zebrafisch mit der Herzseite in die Richtung aus, in der sich die Kapillare und der 3D-Manipulator befinden. Stellen Sie durch Beobachtung der roten Fluoreszenz sicher, dass sich das Inselchen in der Mitte des Sichtfelds befindet.
   HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt sollte der Tisch fixiert bleiben (Abbildung 2).
8. Bewegen Sie mit dem 3D-Manipulator die Glaskapillare in Richtung des Herzens der Larven, dringen Sie in die Haut ein und zielen Sie auf die Perikardhöhle. Führen Sie die Kapillare vorsichtig in der Mitte der Vena cardinal communis (CCV) und des Sinus venosus (SV) ein, die etwa 100-200 μm vom Atrium des Herzens^{entfernt sind 16} (Abbildung 1B und Abbildung 2C). Der Winkel der Nadel beträgt ca. 20-30° in Bezug auf die Oberfläche der Platte. Wenn der Rand der Platte zu hoch ist, entfernen Sie ihn, um den Zugang für die Kapillare zu erleichtern.
   HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt, da eine sehr vorsichtige Penetration erforderlich ist; Schnelle Bewegungen können das Herz stören oder Blutkleidung in diesem Bereich verursachen. Wenn der Blutfluss gestört ist, sollte eine andere Probe verwendet werden. Da der 3D-Manipulator eine feste Position einnimmt, vermeiden Sie Bewegungen des Tisches, um das Herzgewebe nicht zu beeinträchtigen.
9. Sobald die Kapillare in den SV eingesetzt ist, wechseln Sie zu einem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv mit 1,2 NA. Finden Sie mit den roten und grünen dichromatischen Spiegeln 488/561 das nukleare mCherry-Signal in β-Zellen und fokussieren Sie sich auf die Insel.
   HINWEIS: Einzelne Kerne sollten deutlich sichtbar sein und eine geringe grüne Fluoreszenz sollte vorhanden sein (Abbildung 1D).
10. Richten Sie eine gleichzeitige Erfassung für GCaMP6s und mCherry-Fluoreszenz mit den folgenden Parametern im Smart Setup Menu ein: GFP (GCaMP6s), Anregung: 488 nm, Emission: 498-555 nm, Falschfarbe: grün ( GFP auswählen); mCherry, Anregung: 561 nm (mCherry), Emission: 570-640 nm, Falschfarbe: rot (Select mCherry). Durchlicht, Falschfarben: Grautöne.
11. Passen Sie die Bildebene an, indem Sie die Fokusebene entlang der z-Achse der Insel anpassen. Suchen Sie eine Ebene, die die meisten β-Zellen enthält.
12. Passen Sie die Verstärkung des nuklearen mCherry-Signals an, um eine einheitliche Identifizierung jeder einzelnen Zelle zu gewährleisten und etwa 70 % des Farbhistogramms abzudecken.
13. Passen Sie die Verstärkung des GCaMP6s-Signals so an, dass mindestens 25 % des Farbhistogramms abgedeckt werden, da der GCaMP6s seine Helligkeit auf das 4-fache erhöht.
14. Passen Sie die Verstärkung des Durchlichts an, um ein gleichmäßiges Signal der Probe zu erhalten, das etwa 70 % des Farbhistogramms abdeckt.
    HINWEIS: Der graue Kanal wird verwendet, um den ordnungsgemäßen Blutfluss der Insel zu visualisieren und sicherzustellen.
15. Stellen Sie im Aufnahmemodus die Bildauflösung auf 512 x 512 Pixel, den Zoom auf 5, den Zeilenschritt auf 3, die Scangeschwindigkeit auf 13 und die Mittelung der Zeile auf 2-3 ein. Wählen Sie die Option Zeitreihe und stellen Sie die Dauer auf 500 Zyklen mit einer Erfassungsrate von 150 ms pro Frame ein.
    HINWEIS: Die ersten 50 Bilder der Zeitreihe entsprechen der Basislinienfluoreszenz vor der Glukoseinjektion. Es wurde beobachtet, dass einige β-Zellen in vivo eine basale Aktivität zeigen. Eine ansprechende β-Zelle zeigt eine Zunahme der grünen Fluoreszenzintensität mit der Glukoseinjektion im Laufe der Zeit. Die meisten β-Zellen zeigen in vivo eine Reaktion auf die 25 mM Glukoseinjektion.
16. Starten Sie das Imaging. Nach den ersten 50 Bildern (7,5 s) injizieren Sie die Glukose mit der Mikropumpe.
    HINWEIS: Die Injektionen können eine leichte Bewegung erzeugen, die die Fokusebene des Inselchens verschieben kann. Während der Filmaufnahme kann es durch Darmbewegungen zu Veränderungen kommen, die die Brennebene der Insel verändern können.
17. Behalten Sie die Bildaufnahme im Auge und passen Sie die x-, y- und z-Koordinaten manuell an, um die gleiche Fokusebene entlang des Films beizubehalten.
18. Nach der Glukoseinjektion zeichnet das System die Inselreaktion in Bezug auf den Ca2⁺ -Einstrom als Erhöhung der GCaMP-Fluoreszenz auf. Lassen Sie die Larven nach jeder Injektion mindestens 5 Minuten ruhen, bevor Sie sie weiter stimulieren.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellkerne während des Prozesses stabil bleiben. Wenn sich das Inselchen während der Aufnahme stark bewegt oder wenn sich das Inselchen aus der Fokusebene bewegt hat, kann die Probe nicht für weitere Analysen verwendet werden.
19. Wiederholen Sie die Injektion dreimal. Speichern Sie die Videos im TIF-, CZI- oder LSM-Format (empfohlen). Nachdem Sie die Ca2⁺ -Reaktionen aufgezeichnet haben, entfernen Sie die Kapillare sehr langsam aus dem Herzen. Wechseln Sie zum nächsten Beispiel.
    HINWEIS: Die Zebrafischlarven können in eine Petrischale mit frischem E2 gewonnen werden, das PTU enthält.

4. Quantifizierung von GCaMP-Fluoreszenzspuren für einzelne β-Zellen

HINWEIS: Wenn das Tier zu viel Bewegung zeigt, kann der Film mit dem FIJI-Plug-in Deskriptor-basierte Serienregistrierung (2d/3d + t)¹⁷ stabilisiert werden.

1. Laden Sie das zu analysierende Bild per Drag & Drop in FIJI. Klicken Sie im Fenster Bioformat-Importoptionen auf OK.
   HINWEIS: Bei Formaten, die von FIJI nicht unterstützt werden, konvertieren Sie die Videos zur Analyse in das TIFF-Format.
2. Um die GCaMP-Fluoreszenzintensität zu extrahieren, klicken Sie auf das Menü Analysieren > Messungen einstellen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Integrierte Dichte und klicken Sie auf OK.
   1. Öffnen Sie den ROI-Manager.
   2. Wählen Sie im Menü "FIJI" die Option "Polygonauswahl" aus, die sich in der Symbolleiste befindet.
   3. Zeichnen Sie manuell ein Polygon, das einen Bereich abdeckt, der etwas größer als der Zellkern ist und einen Teil des zytoplasmatischen Bereichs der Zelle umfasst, um eine korrekte Einzelzellquantifizierung der Ca2⁺ -Antwort sicherzustellen.
   4. Stellen Sie sicher, dass die Position des ROI über die Frames hinweg konsistent ist. Passen Sie bei Bedarf den ROI an.
   5. Fügen Sie den ausgewählten ROI zum ROI-Manager hinzu, indem Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen [t] klicken.
3. Um das Signal des GCaMP zu quantifizieren, trennen Sie die Kanäle des Bildes. Klicken Sie auf das FIJI-Menü Image > Colors > Split Channels und wählen Sie Green Channel.
4. Wählen Sie im ROI-Manager alle Bereiche aus und klicken Sie auf das Menü Mehr > Multi Measure. Speichern Sie die Ergebnisse.
   HINWEIS: Wenn sich die Zelle aufgrund der Glukoseinjektion oder der Tierbewegung aus dem Polygonbereich bewegt, extrahieren Sie die Zellfluoreszenz vor und nach der Bewegung, indem Sie die Polygonfläche manuell anpassen.
5. Um die Einzelzellanalyse durchzuführen, führen Sie die folgenden Schritte aus.
   1. Entfernen Sie den Hintergrundfloreszenz. Betrachten Sie zu diesem Zweck die Hintergrundfluoreszenz als den Mindestwert, der für jede Zelle (F_MIN) über dem Film registriert wird. Das Minimum wird von der gesamten Zeitreihe (F_T - F_MIN) für jede Zelle subtrahiert.
   2. Normalisieren Sie die Fluoreszenzwerte im gesamten Film. Um dies zu erreichen, dividieren Sie jeden Wert durch den höchsten Intensitätswert über die Aufzeichnungen für jede Zelle. Berechnen Sie dazu die Differenz zwischen F_MIN und F_MAX, d.h. (F_MAX - F_MIN). Teilen (F_T - F_MIN) / (F_MAX - F_MIN).
      HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht den Vergleich der Ca2⁺ -Reaktion zwischen verschiedenen Zellen und zwischen Inselzellen verschiedener Tiere, da sie je nach Fokusebene und der Zugänglichkeit der Zelle oder des Inselzells für die Bildgebung unterschiedliche Fluoreszenzintensitäten emittieren.
6. Verwenden Sie nach der Erfassung der Einzelzell-Fluoreszenzwerte ein Programm (z. B. Excel oder R), um die in Schritt 4 gemessenen Fluoreszenzwerte zu verarbeiten und die Fluoreszenzspuren automatisch darzustellen. Für die Durchführung der Analyse in diesem Protokoll (Schritt 6) wurde die Ergänzende Tabelle 1 (Singlecelltrace.xlsx) verwendet.

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Ergebnisse

Mit Hilfe dieses Protokolls wurde die Glukosereaktion einzelner β-Zellen in ihrer natürlichen Umgebung charakterisiert. Zu diesem Zweck wird die Zebrafischlarve auf eine Petrischale mit Glasboden montiert. Mit Hilfe eines 3D-Manipulators wurde eine Glaskapillare in die Zirkulation eingeführt, die auf den SV abzielte (Abbildung 1 und Abbildung 2). Dies ermöglicht die Injektion bestimmter Volumina von Lösungen mit einer defin...

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Diskussion

In diesem Protokoll wurde die Ca2⁺ -Dynamik von β-Zellen in ihrer nativen Mikroumgebung mit Einzelzellauflösung untersucht. Dies ist möglich, indem die Zebrafisch-β-Zellen mit einer Glukoseinjektion in den Blutkreislauf stimuliert werden, während ihre Ca2⁺ -Dynamik mit GCaMP6s aufgezeichnet wird.

Das Protokoll bietet drei Hauptvorteile. Zunächst haben Forscher gezeigt, dass Zebrafisch-β-Zellen in vivo eine koordinierte Rea...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm diameter glass-bottom dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C	We use this glass-bottom dish to mount the zebrafish larvae and perform confocal microscopy
Blue-Green filter cube	ZEISS	489038-9901-000	Filter Set 38 HE
Confocal Microscope	ZEISS	LSM 980
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Excel (2016)			https://www.office.com/
Femtojet	Eppendorf	5252000013	This equipment is a pneumatic micropump, which allows precise volume delivery and is accompanied by a capillary holder. We use the micropump Femtojet (injection pressure between 500-1000 hPa; compensation pressure = 0 hPa; and delivery time = 1 second).
Femtotips, glass capillaries ready to be used.	Eppendorf	5242952008	This are ready to use glass capillaries that can substitute the pulled-capillaries.
FIJI, using ImageJ Version: 1.51c			https://fiji.sc/
Fluorescence lamp	ZEISS	423013-9010-000	Illuminator HXP 120 V
Glass capillaries 3.5"	Drummonds Scientific Company	3-000-203-G/X	We use these glass capillaries to prepare the injection capillaries by pulling them with a capillary -puller
Injectman	Eppendorf	5192000019	This equipment allows for 3D manipulation of the capillary holder
Low melting agarose	Biozym	Art. -Nr.: 840101	We use the agarose to mount the zebrafish onto the glass-bottom dish
Microloader tip for glass microcapillaries 0.5 – 20 µL, 100 mm	Eppendorf	5242956003	Long tips for loading the glass capillaries with the solutions
Micro-tweezers	Dumont Swiss made	0102-4-PO	We use the micro-tweezers to move the zebrafish larvae during the mounting and to cut off the tip of the glass capillary (eg. Dumont, size 4).
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904	We use the mineral oil to calibrate the drop size to inject
P-1000 Next Generation Pipette Puller	Science Products	P-1000	We use this capillary puller to prepare the glass capillary using the Drumond capillaries. We use the P-1000 capillary puller with the following parameters: Heat: 650, Pull: 20, Vel: 160, Time: 200, Pressure: 500.
PTU (1-phenyl-2-thiourea )	Sigma-Aldrich	P7629	We use this compound to inhibit pigmentation during zebrafish development
Red Filter Cube	ZEISS	000000-1114-462	Filter set 45 HQ TexasRed
Stereo microscope	ZEISS	495015-0001-000	SteREO Discovery.V8
Syringe filters, sterile. Pore size 0.2 µm	Pall Corporation	4612	We use these to filter all the solutions and prevent the capillary needle clothing
Transgenic Zebrafish line:Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)
tricaine methanesulfonate (MS222)	Sigma-Aldrich	E10521	We use this compound to anesthetize the fish larvae