在活斑马鱼中同时进行钙成像和葡萄糖刺激以研究体内β细胞功能

摘要

在这里，该研究提出了一种在 体内对斑马鱼胰腺β细胞进行钙成像和葡萄糖刺激的方案。

摘要

胰腺 β 细胞通过根据血糖水平产生和分泌胰岛素来维持全身葡萄糖稳态。β细胞功能缺陷与可导致糖尿病的高血糖有关。在胰岛素分泌过程中，β细胞会经历 Ca²⁺ 的流入。因此，使用基因编码的钙指示剂 （GECI） 对葡萄糖刺激的 Ca²⁺ 内流进行成像为研究β细胞功能提供了一条途径。以前，研究表明，表达 GCaMP6 的分离斑马鱼胰岛在用确定的葡萄糖浓度刺激后表现出显着的 Ca²⁺ 活性。然而，研究 β 细胞如何对葡萄糖做出反应不是孤立的，而是在其天然环境中，它们是系统连接的、血管化的和密集的神经支配。为此，该研究利用斑马鱼幼虫在发育早期的光学透明度来阐明 体内β细胞活动。在这里，提出了 Ca^{2 +} 成像和葡萄糖刺激的详细方案，以研究 体内 β细胞功能。该技术允许以单细胞分辨率监测β细胞中的配位 Ca^{2 +} 动力学。此外，该方法可用于任何注射溶液，例如小分子或肽。总而言之，该协议说明了斑马鱼模型在研究 体内 胰岛协调以及表征环境和遗传成分如何影响β细胞功能方面的潜力。

引言

胰腺 β 细胞表现出响应葡萄糖而分泌胰岛素的独特能力。吃完富含碳水化合物的饭后，血糖升高并进入β细胞，在那里迅速代谢产生 ATP。ATP/ADP 细胞内比率的增加导致 ATP 依赖性 K⁺ 通道关闭，细胞膜去极化并激活电压依赖性 Ca²⁺ 通道。细胞内 Ca²⁺ 的快速增加刺激 β 细胞分泌胰岛素颗粒。

小鼠完整胰腺内胰岛细胞的成像要求很高，需要对整个器官进行外部化。无创体内成像的一种有力替代方案是将胰岛移植到小鼠眼睛的前房 （AC）^{中 1}。移植到小鼠 AC 中的胰岛模拟体内环境，允许在体内进行纵向研究和 Ca²⁺ 成像 ^2,3。然而，胰岛血运重建过程可能需要在胰岛移植后数周⁴。因此，保留原始的天然环境，即β细胞血管化并与生物体的代谢状态相连，以及实现体内单细胞成像分辨率仍然非常具有挑战性和耗时。

为了克服这些限制，研究人员开发了在β细胞中表达 GECI 的斑马鱼转基因品系，从而可以实时可视化β细胞中 Ca²⁺ 内流 ^5,6,7,8,9。使用这些工具，发现在细胞培养中，斑马鱼β细胞对升高的葡萄糖表现出保守的反应，类似于小鼠和人胰岛。此外，斑马鱼幼虫的光学清晰度允许检查β细胞在其原生环境中的功能。重要的是，早在受精后 4 天 （dpf），斑马鱼原代胰岛的β细胞就表达成熟标志物，例如斑马鱼尿上皮质素的直系同源物3 （ucn3l），并在生理范围内显示对葡萄糖的体外反应⁶。此外，斑马鱼胰岛维管密集并受神经支配¹⁰。在这个阶段 β 细胞的基因消融导致葡萄糖耐受不良。此外，斑马鱼对胰岛素和磺脲类药物等降糖剂表现出保守的反应，表明原代胰岛是控制葡萄糖水平的葡萄糖反应和全身连接组织。这些特殊特性使斑马鱼成为研究体内胰岛β细胞活性的独特模型 ^11,12。

Ca^{2 +} 成像和直接在斑马鱼循环中同时注射葡萄糖的方案允许研究 β 细胞在体内的葡萄糖反应性。该协议能够注射确定的葡萄糖浓度以及高时间和空间分辨率，这共同揭示了 β 细胞对葡萄糖的协调反应以及体内第一反应者 β 细胞的存在 ¹³。此外，该方案可以适用于任何注射溶液，例如化合物或小肽。总体而言，这种方法说明了斑马鱼模型在研究体内β细胞协调以及表征环境和遗传成分如何影响β细胞功能方面的优势。

研究方案

本研究中使用的先前建立的转基因品系是 Tg（ins：GCaMP6s;cryaa：mCherry）⁶， Tg（ins：cdt1-mCherry;cryaa：CFP）¹⁴.所有实验均按照欧盟和德国法律 （Tierschutzgesetz） 进行，并经德累斯顿工业大学和萨克森州伦理委员会批准（批准号：AZ 24D-9168、11-1/2013-14、TV38/2015、T12/2016 和 T13/2016、TVV50/2017、TVV 45/2018 和 TVV33-2019）。在这项研究中，所有 体内实时成像 和葡萄糖注射以及实验程序均使用不超过受精后 5 天 （dpf） 阶段的斑马鱼幼虫进行，如动物保护法 （TierSchVersV §14） 所述。根据欧盟指令 2010/63/EU，根据 3R 原则，使用这些早期斑马鱼阶段可以减少实验动物的数量。

1. 准备工作

注意：该协议涉及来自 Tg（ins：cdt1-mCherry;cryaa：CFP）;Tg（ins：GCaMP6s;cryaa：mCherry） 双转基因幼虫。在这些动物中，胰岛素启动子驱动 cdt1-mCherry 的表达，cdt1-mCherry 以红色荧光标记单个 β 细胞的细胞核。GCaMP6 响应细胞内 Ca²⁺ 水平而显示绿色荧光变化。GCaMP6 在β细胞中的特异性表达允许表征单个细胞的葡萄糖反应性，而不受其他细胞类型或组织的干扰。

1. 准备 E2 胚胎培养基¹⁵.
2. 在 10% Hanks 盐水¹⁵ 中制备 0.003% （200 μm） 1-苯基-2-硫脲 （PTU）。
3. 通过在微波炉中加热并用 <25 μm 孔径过滤器过滤，在 E2 胚胎培养基中制备 1% 低熔点琼脂糖 （LMA）。将 LMA 保持在 >37 °C 长达 1 周。
   注意：所有溶液都应过滤，以防止用于注射的玻璃毛细管堵塞。
4. 制备 0.4% 甲烷磺酸三卡因溶液 （MS222） 与 979 mL 无菌 H₂O 和 21 mL 1 M Tris （pH 9）。将 pH 值调节至 7。
5. 将 1.8 g D-葡萄糖溶解在 50 mL PBS 中，制备 200 mM D-葡萄糖溶液，并用 <25 μm 孔径过滤器过滤。通过将 200 mM D-葡萄糖在 1x PBS（过滤）中以 1：8 稀释来制备 D-葡萄糖 （25 mM） 的工作溶液。保存在 4 °C 下长期储存。将 5 μL 酚红添加到 1 mL 25 mM D-葡萄糖中，以便能够在注射时看到溶液。
   注意：该溶液可在 4 °C 下保存 1 周。但是，25 mM 工作溶液应新鲜制备。如果有任何污染迹象，请丢弃原液。
6. 使用毛细管拉拔器制备拉出的显微注射玻璃毛细管，或购买市售的微玻璃毛细管。针牵引的设置在 材料表中进行了描述。
   注：与具有内细丝的类似毛细管相比，发现由硼硅酸盐玻璃制成的无内细丝的显微注射毛细管提供更好的结果。
7. 购买直径为 35 毫米的玻璃底培养皿，用于安装斑马鱼幼虫。该方案中使用了玻璃盖为 0.17 mm 的玻璃底培养皿，因为它们允许在共聚焦系统中使用玻璃校正物镜进行成像。
8. 购买微量加载移液器吸头。本方案中使用了 20 μL 100 mm 长的微量加载器。
9. 购买一套微型镊子。
10. 采购 90 毫米培养皿，用于分拣和培养斑马鱼。
11. 采购矿物油。
12. 购买气动微型泵或系统，通过玻璃毛细管输送 1-5 nL 体积的液体。
13. 对于斑马鱼的分选和安装，使用配备有光源和蓝色和红色荧光滤光片立方体的立体显微镜（CFP：激发 420-450 nm，发射 460-490 nm，TRITC：激发：532-554 nm，发射：570-613 nm;或德克萨斯红：激发：540-580 nm，发射：592-667 nm）。对双转基因 Tg（ins：cdt1-mCherry;cryaa：CFP）; Tg（ins：GCaMP6s;cryaa：mCherry） 幼虫。由于晶状体蛋白启动子下 CFP 和 mCherry 的表达，选择视网膜中具有蓝色和红色荧光的胚胎。
14. 为了对β细胞中的 Ca^{2 +} 内流进行成像，请使用配备 10 倍 （0.8 NA） 空气物镜和 40 倍 （1.0 NA） 水物镜的倒置共聚焦显微镜。使用包含直径为 35 mm 的玻璃底培养皿的板架的载物台。
15. 购买带有毛细管支架的 3D 手动或电动机械手。将玻璃毛细管插入毛细管支架，并将毛细管支架安装到 3D纵器中。
    注意：3D 机械手允许玻璃毛细管的精确移动并插入斑马鱼幼虫。

2. 斑马鱼幼虫安装

注：双转基因 Tg（ins：cdt1-mCherry;cryaa：CFP）; Tg（ins：GCaMP6s;cryaa：mCherry） 胚胎用0.03%（20μM）1-苯基2-硫脲（PTU）处理，以抑制受精后24小时开始的色素沉着。在 4.5 dpf 时，在安装前使用 0.04% 的最终浓度的 Tri卡因麻醉幼虫。

1. 为了在成像过程中保持麻醉，向 1% 低熔点琼脂糖中加入终浓度为 0.04% 三卡因和 20 μM PTU 的琼脂糖。将 LMA 琼脂糖保持在 >37 °C 直至使用。在制备的同一天使用此解决方案。
2. 对麻醉的双转基因 Tg（ins：cdt1-mCherry;cryaa：CFP）; Tg（ins：GCaMP6s; cryaa：mCherry） 幼虫。将 3-5 条鱼放在玻璃底培养皿上，去除大部分液体。
   注意：在此步骤中不要让幼虫干燥，并始终将它们浸入最少量的 E2 中。
3. 在装有鱼的玻璃底培养皿上加入 500 μL LMA，并在微镊的帮助下轻轻移动鱼，使鱼的右侧直接与玻璃底接触。去除多余的琼脂糖，使其凝固 1-3 分钟。观察琼脂糖在这一点上变得略微不透明（图 1B）。
   注意：如果琼脂糖太热，可能会损坏幼虫。为避免这种情况，让琼脂糖在室温下冷却 30-45 秒，然后再将其添加到幼虫中。
4. 一旦琼脂糖变成固体，在微镊子的帮助下，小心地去除心脏区域周围的琼脂糖，以防止在与琼脂糖接触时用于后续注射的针头断裂（图 1C）。
5. 加入 500 μL E2，含有终浓度为 0.04% 三卡因和 20 μM PTU。
   注意：确保在实时成像期间避免幼虫干燥。

3. β细胞同时注射和 Ca²⁺ 成像

注意：那些由于发育迟缓而在胰腺顶部具有过多蛋黄的幼虫不应用于成像，因为蛋黄的脂质会干扰图像质量。此外，使用低激光功率 （0.5%-5%） 以避免光漂白和光毒性。

1. 使用立体显微镜和微型镊子，切掉玻璃毛细管的尖端。
   注意：不要只切割毛细管的尖端，因为毛细管的直径应小于斑马鱼心脏的流入道。
2. 使用加载提示，将 25 mM D-葡萄糖溶液填充针头。
   注意：毛细管必须均匀填充，特别注意避免形成任何气泡，因为它们会干扰适当进样体积的输送。
3. 将玻璃毛细管安装到毛细管支架中，并将其连接到微型泵。将微泵保持在 500-1,000 hPa 之间的喷射压力，补偿压力 = 0 hPa，交货时间 = 1 s。
4. 要校准注射体积，请使用配备有分级目镜的立体显微镜。将一滴矿物油滴入立体镜下方的载玻片中。使用 4 倍物镜将立体镜的缩放比例调整为 1.5 的幂。将玻璃毛细管注入矿物油的插件中。
   注意：5 nL 相当于立体镜目镜上显示的 5 个刻度单位。增加或减少微型泵的注射压力以调整液滴量。
5. 将毛细管支架安装到 3D纵器中。
   注意：3D 机械手应允许在毛细管支架的 x、y 和 z 方向上进行精细运动控制。
6. 将装有已安装幼虫的培养皿小心地放在共聚焦显微镜的板架上。使用 10 倍、0.8 NA 空气物镜通过明场选项定位幼虫。
7. 将斑马鱼的心脏侧朝向毛细管和 3D纵器所在的方向。通过观察红色荧光，确保胰岛位于视野的中心。
   注意：从这一点开始，载物台应保持固定（图 2）。
8. 使用 3D 机械手，将玻璃毛细管移向幼虫的中心，穿透皮肤，并瞄准心包腔。小心地将毛细血管插入距离心房¹⁶ 约 100-200 μm 的总主静脉 （CCV） 和静脉窦 （SV） 的中间（图 1B 和 图 2C）。针的角度相对于板表面约为 20-30°。如果板的边缘太高，请将其移除，以便更容易进入毛细管。
   注意：这是一个关键步骤，因为需要非常小心的渗透;快速运动会扰乱心脏或导致该区域带血。如果血流受到干扰，应使用不同的样本。由于 3D 机械手保持固定位置，因此请避免载物台移动，以免干扰心脏组织。
9. 将毛细管放入 SV 后，更换为 40 倍、1.2 NA 水浸物镜。使用红色和绿色 488/561 双色镜，在β细胞中找到核 mCherry 信号，并专注于胰岛。
   注意：单个细胞核应清晰可见，并且应存在低绿色荧光（图 1D）。
10. 在 智能设置菜单中使用以下参数设置 GCaMP6 和 mCherry 荧光的同时采集：GFP （GCaMP6s），激发：488 nm，发射：498-555 nm，伪色：绿色（选择 GFP）;mCherry，激发波长：561 nm （mCherry），发射波长：570-640 nm，伪色：红色 （Select mCherry）。透射光，伪彩色：灰色。
11. 通过沿胰岛的 z 轴调整焦平面来调整成像平面。找到包含大多数 β 单元的平面。
12. 调整核 mCherry 信号的增益，以统一识别每个单独的细胞并覆盖大约 70% 的彩色直方图。
13. 调整 GCaMP6s 信号的增益以覆盖至少 25% 的彩色直方图，因为 GCaMP6s 的亮度最多可增加 4 倍。
14. 调整透射光的增益，以获得覆盖约 70% 彩色直方图的样品均匀信号。
    注意：灰色通道用于可视化并确保胰岛的正常血流。
15. 在 采集模式下，将图像分辨率设置为 512 x 512 像素，缩放为 5，线步长为 3，扫描速度为 13，平均线为 2-3。选择选项 Time-series，并将 Duration 设置为 500 个周期，每帧采集速率为 150 毫秒。
    注意：时间序列的前 50 帧对应于葡萄糖注射前的基线荧光。已经观察到一些 β 细胞 在体内表现出基础活性。随着时间的推移，反应β细胞将显示葡萄糖注射后绿色荧光强度的增加。大多数 β 细胞 在体内对 25 mM 葡萄糖注射有反应。
16. 开始成像。前 50 帧 （7.5 秒） 后，使用微型泵注射葡萄糖。
    注意：注射可能会产生轻微的运动，从而移动胰岛的焦平面。在电影录制过程中，肠道运动可能会改变胰岛的焦平面。
17. 密切关注图像采集并手动调整 x、y 和 z 坐标，以保持沿电影的相同焦平面。
18. 葡萄糖注射后，系统根据 Ca^{2 +} 内流记录胰岛反应，作为 GCaMP 荧光的增加。每次注射后，让幼虫休息至少 5 分钟，然后再进行任何进一步的刺激。
    注意：确保细胞核在此过程中保持稳定。如果胰岛在采集过程中剧烈移动，或者胰岛已移出焦平面，则样品不能用于进一步分析。
19. 重复注射 3 次。将视频保存为 TIF、CZI 或 LSM 格式（推荐）。记录 Ca²⁺ 反应后，非常缓慢地从心脏中取出毛细血管。移至下一个示例。
    注意：斑马鱼幼虫可以回收到含有 PTU 的新鲜 E2 的培养皿中。

4. 单个 β 细胞的 GCaMP 荧光迹线定量

注意：如果动物的动作过多，可以使用基于 FIJI 插件描述 符的系列注册 （2d/3d + t）¹⁷ 来稳定电影。

1. 通过拖放到 FIJI 中来加载要分析的图像。在 Bio-format Import Options 窗口中，单击 OK。
   注意：对于 FIJI 不支持的格式，请将视频转换为 tiff 格式以供分析。
2. 要提取 GCaMP 荧光强度，请单击菜单 Analyze > Set Measurements。勾选 Integrated density 框，然后单击 OK。
   1. 打开 ROI 管理器。
   2. 在 FIJI 菜单中，选择工具栏中的 Polygon selections 。
   3. 手动绘制一个多边形，覆盖面积略大于细胞核，包括细胞的一些细胞质区域，以确保 Ca²⁺ 响应的正确单细胞定量。
   4. 确保 ROI 的位置在帧上保持一致;如有必要，调整 ROI。
   5. 通过单击 Add [t] 按钮，将选定的 ROI 添加到 ROI 管理器中。
3. 要量化 GCaMP 的信号，请分离图像的通道。单击斐济菜单 图像 > 颜色 > 分割通道 并选择 绿色通道。
4. 在 ROI 管理器中，选择所有区域，然后单击菜单 More > Multi Measure。保存结果。
   注意：如果细胞因葡萄糖注射或动物运动而移出多边形区域，请通过手动调整多边形区域来提取运动前后的细胞荧光。
5. 要执行单细胞分析，请执行以下步骤。
   1. 去除背景荧光。为此，将背景荧光视为每个单元格在电影上记录的最小值 （F_MIN）。从每个单元格的整个时间序列 （F_T - F_MIN） 中减去最小值。
   2. 标准化整个电影的荧光值。为此，请将每个值除以每个单元格的录制内容的最高强度值。为此，计算 F_MIN 和 F_MAX 之间的差值，即 （F_MAX - F_MIN）。除法 （F_T - F_MIN） / （F_MAX - F_MIN）。
      注意：此步骤允许比较不同细胞之间和不同动物胰岛之间的 Ca^{2 +} 反应，因为它们会发出不同水平的荧光强度，具体取决于焦平面和细胞或胰岛对成像的可及性。
6. 采集单细胞荧光值后，使用程序（例如 Excel 或 R）处理从步骤 4 中测得的荧光值并自动绘制荧光轨迹。为了在该方案中执行分析（步骤 6），使用了 补充表 1 （Singlecelltrace.xlsx）。

结果

使用该方案，表征了单个 β 细胞在其天然环境中的葡萄糖反应。为此，将斑马鱼幼虫安装在玻璃底培养皿上。使用 3D纵器，将玻璃毛细管插入循环中，瞄准 SV（图 1 和 图 2）。这允许注入特定体积的具有规定浓度的溶液。同时，记录了成像平面中所有 β 细胞的葡萄糖诱导的 Ca²⁺ 内流。使用 FIJI¹⁷ 提取...

讨论

在该协议中，以单细胞分辨率探索了 β 细胞在其天然微环境中的 Ca²⁺ 动力学。这可以通过在循环中注射葡萄糖刺激斑马鱼β细胞，同时使用 GCaMP6 记录它们的 Ca²⁺ 动态来实现。

该协议提供了三个主要优点。首先，研究人员已经证明，斑马鱼β细胞在体内表现出对葡萄糖刺激的协调反应 ^7,13,...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm diameter glass-bottom dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C	We use this glass-bottom dish to mount the zebrafish larvae and perform confocal microscopy
Blue-Green filter cube	ZEISS	489038-9901-000	Filter Set 38 HE
Confocal Microscope	ZEISS	LSM 980
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Excel (2016)			https://www.office.com/
Femtojet	Eppendorf	5252000013	This equipment is a pneumatic micropump, which allows precise volume delivery and is accompanied by a capillary holder. We use the micropump Femtojet (injection pressure between 500-1000 hPa; compensation pressure = 0 hPa; and delivery time = 1 second).
Femtotips, glass capillaries ready to be used.	Eppendorf	5242952008	This are ready to use glass capillaries that can substitute the pulled-capillaries.
FIJI, using ImageJ Version: 1.51c			https://fiji.sc/
Fluorescence lamp	ZEISS	423013-9010-000	Illuminator HXP 120 V
Glass capillaries 3.5"	Drummonds Scientific Company	3-000-203-G/X	We use these glass capillaries to prepare the injection capillaries by pulling them with a capillary -puller
Injectman	Eppendorf	5192000019	This equipment allows for 3D manipulation of the capillary holder
Low melting agarose	Biozym	Art. -Nr.: 840101	We use the agarose to mount the zebrafish onto the glass-bottom dish
Microloader tip for glass microcapillaries 0.5 – 20 µL, 100 mm	Eppendorf	5242956003	Long tips for loading the glass capillaries with the solutions
Micro-tweezers	Dumont Swiss made	0102-4-PO	We use the micro-tweezers to move the zebrafish larvae during the mounting and to cut off the tip of the glass capillary (eg. Dumont, size 4).
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904	We use the mineral oil to calibrate the drop size to inject
P-1000 Next Generation Pipette Puller	Science Products	P-1000	We use this capillary puller to prepare the glass capillary using the Drumond capillaries. We use the P-1000 capillary puller with the following parameters: Heat: 650, Pull: 20, Vel: 160, Time: 200, Pressure: 500.
PTU (1-phenyl-2-thiourea )	Sigma-Aldrich	P7629	We use this compound to inhibit pigmentation during zebrafish development
Red Filter Cube	ZEISS	000000-1114-462	Filter set 45 HQ TexasRed
Stereo microscope	ZEISS	495015-0001-000	SteREO Discovery.V8
Syringe filters, sterile. Pore size 0.2 µm	Pall Corporation	4612	We use these to filter all the solutions and prevent the capillary needle clothing
Transgenic Zebrafish line:Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)
tricaine methanesulfonate (MS222)	Sigma-Aldrich	E10521	We use this compound to anesthetize the fish larvae