Imagem simultânea de cálcio e estimulação de glicose em peixe-zebra vivo para investigar a função das células β in vivo

Resumo

Aqui, o estudo apresenta um protocolo para imagem de cálcio e estimulação de glicose das células β pancreáticas do peixe-zebra in vivo.

Resumo

As células β pancreáticas sustentam a homeostase sistêmica da glicose produzindo e secretando insulina de acordo com os níveis de glicose no sangue. Defeitos na função das células β estão associados à hiperglicemia que pode levar ao diabetes. Durante o processo de secreção de insulina, as células β experimentam um influxo de Ca²⁺. Assim, a imagem do influxo de Ca²⁺ estimulado por glicose usando indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs) fornece um caminho para estudar a função das células β. Anteriormente, estudos mostraram que ilhotas isoladas de peixe-zebra expressando GCaMP6s exibem atividade significativa de Ca²⁺ após estimulação com concentrações de glicose definidas. No entanto, é fundamental estudar como as células β respondem à glicose não isoladamente, mas em seu ambiente nativo, onde são sistemicamente conectadas, vascularizadas e densamente inervadas. Para esse fim, o estudo aproveitou a transparência óptica das larvas do peixe-zebra nos estágios iniciais de desenvolvimento para iluminar a atividade das células β in vivo. Aqui, é apresentado um protocolo detalhado para imagem de Ca²⁺ e estimulação de glicose para investigar a função das células β in vivo . Esta técnica permite monitorar a dinâmica coordenada de Ca²⁺ em células β com resolução de célula única. Além disso, este método pode ser aplicado para trabalhar com qualquer solução injetável, como pequenas moléculas ou peptídeos. Ao todo, o protocolo ilustra o potencial do modelo de peixe-zebra para investigar a coordenação das ilhotas in vivo e caracterizar como os componentes ambientais e genéticos podem afetar a função das células β.

Introdução

As células β pancreáticas exibem a capacidade única de secreção de insulina em resposta à glicose. Após uma refeição rica em carboidratos, o açúcar no sangue aumenta e entra nas células β, onde é rapidamente metabolizado para produzir ATP. O aumento da razão intracelular de ATP/ADP leva ao fechamento dos canais de K⁺ dependentes de ATP, despolarizando a membrana celular e ativando os canais de Ca²⁺ dependentes de voltagem. O rápido aumento do Ca²⁺ intracelular estimula a secreção de grânulos de insulina pelas células β.

A imagem das células das ilhotas dentro do pâncreas intacto em camundongos é exigente e requer a exteriorização de todo o órgão. Uma alternativa poderosa para imagens in vivo não invasivas é transplantar ilhotas para a câmara anterior (AC) do olho de camundongos¹. Ilhotas transplantadas para a CA de camundongos mimetizam um ambiente in vivo, permitindo estudos longitudinais e imagens de Ca²⁺ in vivo ^2,3. No entanto, o processo de revascularização das ilhotas pode levar várias semanas após o transplante das ilhotas⁴. Assim, preservar o ambiente nativo original, onde as células β são vascularizadas e conectadas ao estado metabólico do organismo, e alcançar a resolução de imagem de célula única in vivo continua sendo muito desafiador e demorado.

Para superar essas limitações, os pesquisadores desenvolveram linhagens transgênicas de peixe-zebra expressando GECIs em células β, que permitem a visualização em tempo real do influxo de Ca²⁺ em células β 5,6,7,8,9. Usando essas ferramentas, descobriu-se que, em cultura de células, as células β do peixe-zebra mostram uma resposta conservada à glicose elevada, semelhante às ilhotas de camundongos e humanos. Além disso, a clareza óptica das larvas do peixe-zebra permitiu examinar a função das células β em seu ambiente nativo. É importante ressaltar que, já 4 dias após a fertilização (dpf), as células β da ilhota primária do peixe-zebra expressam marcadores de maturidade, como o ortólogo do peixe-zebra de urocortina3 (ucn3l) e mostram respostas in vitro à glicose na faixa fisiológica⁶. Além disso, a ilhota do peixe-zebra é densamente vascularizada e inervada¹⁰. A ablação genética das células β nesta fase leva à intolerância à glicose. Além disso, o peixe-zebra mostra respostas conservadas a agentes redutores de glicose, como insulina e sulfonilureias, mostrando que a ilhota primária é um tecido responsivo à glicose e conectado sistemicamente que controla os níveis de glicose. Essas características especiais tornam o peixe-zebra um modelo único para estudar a atividade das células β ilhotas in vivo^11,12.

O protocolo para imagem de Ca²⁺ e injeção simultânea de glicose diretamente na circulação do peixe-zebra permite investigar a capacidade de resposta à glicose das células β in vivo. Esse protocolo permite a injeção de concentrações definidas de glicose em combinação com alta resolução temporal e espacial, que juntas revelam a resposta coordenada das células β à glicose e a presença de células β respondedoras in vivo¹³. Além disso, o protocolo pode ser adaptado a qualquer solução injetável, como compostos químicos ou pequenos peptídeos. No geral, esta metodologia ilustra a força do modelo de peixe-zebra para investigar a coordenação de β-células in vivo e caracterizar como os componentes ambientais e genéticos podem afetar a função das células β.

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Protocolo

As linhagens transgênicas previamente estabelecidas utilizadas neste estudo foram Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)⁶, Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP)¹⁴. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as leis da União Europeia e da Alemanha (Tierschutzgesetz) e com a aprovação dos Comitês de Ética da TU Dresden e da Landesdirektion Sachsen (números de aprovação: AZ 24D-9168,11-1/2013-14, TV38/2015, T12/2016 e T13/2016, TVV50/2017, TVV 45/2018 e TVV33-2019). Neste estudo, todas as imagens ao vivo in vivo e injeções de glicose, bem como procedimentos experimentais foram realizados com larvas de peixe-zebra que não excederam o estágio de 5 dias após a fertilização (dpf), conforme declarado na lei de proteção animal (TierSchVersV §14). De acordo com a diretiva da UE 2010/63/UE, o uso desses estágios anteriores do peixe-zebra reduz o número de animais experimentais, de acordo com os princípios dos 3Rs.

1. Preparação

NOTA: Este protocolo refere-se à imagem in vivo de Ca²⁺ da ilhota primária do peixe-zebra de Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) larvas transgênicas duplas. Nesses animais, o promotor da insulina impulsiona a expressão de cdt1-mCherry, que rotula os núcleos de células β individuais em fluorescência vermelha. GCaMP6s mostra mudanças na fluorescência verde em resposta aos níveis intracelulares de Ca²⁺ . A expressão específica dos GCaMP6s em células β permite a caracterização da capacidade de resposta à glicose de células individuais sem a interferência de outros tipos de células ou tecidos.

1. Prepare o meio embrionário E2¹⁵.
2. Prepare 0,003% (200 μm) de 1-feniil-2-tioureia (PTU) em solução salina de Hanks^{15 a 10}%.
3. Prepare 1% de agarose de baixo ponto de fusão (LMA) em meio embrionário E2 aquecendo em um micro-ondas e filtrando-o com um filtro de tamanho de poro de <25 μm. Mantenha o LMA a >37 °C por até 1 semana.
   NOTA: Todas as soluções devem ser filtradas para evitar o entupimento do capilar de vidro utilizado para injeção.
4. Prepare uma solução a 0,4% de sulfonato de metano de tricaína (MS222) com 979 mL de H₂O estéril e 21 mL de Tris 1 M (pH 9). Ajuste o pH para 7.
5. Dissolva 1,8 g de D-glicose em 50 mL de PBS para preparar a solução de D-glicose 200 mM e filtre-a com filtros de poros de <25 μm. Prepare uma solução de trabalho de D-glicose (25 mM) por uma diluição de 1:8 da D-glicose 200 mM em 1x PBS (filtrado). Conservar a 4 °C para conservação a longo prazo. Adicione 5 μL de vermelho de fenol a 1 mL de D-glicose 25 mM para poder visualizar a solução após a injeção.
   NOTA: Esta solução pode ser mantida a 4 °C durante 1 semana. No entanto, a solução de trabalho de 25 mM deve ser preparada fresca. Descarte o estoque se houver algum sinal de contaminação.
6. Prepare capilares de vidro de microinjeção puxados usando um extrator capilar ou adquira capilares de microvidro disponíveis comercialmente. As configurações para puxar agulha são descritas na Tabela de Materiais.
   NOTA: Os capilares de microinjeção feitos de vidro borossilicato sem filamento interno apresentaram melhores resultados em comparação com capilares semelhantes com filamento interno.
7. Adquira pratos com fundo de vidro de 35 mm de diâmetro para montar as larvas de peixe-zebra. Placas com fundo de vidro com cobertura de vidro de 0,17 mm foram utilizadas neste protocolo, pois permitem imagens com objetivas corrigidas por vidro em sistemas confocais.
8. Adquira pontas de pipeta de microcarregamento. Microcarregadores de 20 μL com 100 mm de comprimento foram utilizados neste protocolo.
9. Adquira um conjunto de micropinças.
10. Adquira placas de Petri de 90 mm para triagem e cultivo de peixe-zebra.
11. Adquira óleo mineral.
12. Adquira uma microbomba pneumática ou um sistema para fornecer 1-5 nL de volumes de líquido através dos capilares de vidro.
13. Para a classificação e montagem do peixe-zebra, utilizar um microscópio estéreo equipado com uma fonte de luz e com cubos de filtro azuis e vermelhos para fluorescência (CFP: excitação 420-450 nm, emissão 460-490 nm, TRITC: excitação: 532-554 nm, emissão: 570-613 nm; ou Texas-Red: excitação: 540-580 nm, emissão: 592-667 nm). Classifique o Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) usando o estereoscópio. Selecione os embriões com fluorescência azul e vermelha na retina devido à expressão de CFP e mCherry sob o promotor cristalino.
14. Para obter imagens do influxo de Ca²⁺ em células β, use um microscópio confocal invertido equipado com uma objetiva de ar de 10x (0,8 NA) e uma objetiva de água de 40x (1,0 NA). Utilize uma platina contendo o suporte da placa para as lojas com fundo de vidro de 35 mm de diâmetro.
15. Adquira um manipulador manual ou motorizado 3D com suporte capilar. Insira o capilar de vidro no suporte capilar e monte o suporte capilar no manipulador 3D.
    NOTA: O manipulador 3D permite o movimento preciso do capilar de vidro e a inserção nas larvas do peixe-zebra.

2. Montagem de larvas de peixe-zebra

NOTA: A Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) são tratados com 0,03% (20 μM) de 1-fenil 2-tioureia (PTU) para inibir a pigmentação a partir de 24 horas após a fertilização. A 4,5 dpf, anestesiar as larvas usando 0,04% da concentração final de Tricaína antes da montagem.

1. Para manter a anestesia durante a sessão de imagem, adicione à agarose de baixo ponto de fusão a 1% uma concentração final de 0,04% de tricaína e 20 μM de PTU. Mantenha a agarose LMA a >37 °C até o uso. Use esta solução no mesmo dia da preparação.
2. Classifique o Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) larvas. Coloque 3-5 peixes em uma placa de Petri com fundo de vidro e remova a maior parte do líquido.
   NOTA: Não deixe as larvas secarem nesta etapa e mantenha-as sempre imersas em uma quantidade mínima de E2.
3. Adicione 500 μL de LMA na placa de Petri com fundo de vidro que contém o peixe e, com a ajuda das micropinças, mova suavemente o peixe para que o lado direito do peixe fique diretamente em contato com o fundo de vidro. Retire o excesso de agarose e deixe solidificar por 1-3 min. Observe que a agarose se torna ligeiramente opaca neste ponto (Figura 1B).
   NOTA: Se a agarose estiver muito quente, pode danificar as larvas. Para evitar isso, deixe a agarose esfriar em temperatura ambiente por 30-45 s antes de adicioná-la às larvas.
4. Assim que a agarose se tornar sólida, com a ajuda das micropinças, remova cuidadosamente a agarose ao redor da área do coração para evitar a quebra da agulha usada para injeção subsequente ao entrar em contato com a agarose (Figura 1C).
5. Adicione 500 μL de E2 contendo uma concentração final de 0,04% de tricaína e 20 μM de PTU.
   NOTA: Certifique-se de evitar o ressecamento das larvas durante a imagem ao vivo.

3. Injeção simultânea e imagem de Ca²⁺ de células β

NOTA: As larvas que apresentam gema excessiva no topo do pâncreas devido a um atraso no desenvolvimento não devem ser usadas para exames de imagem, pois os lipídios da gema interferem na qualidade da imagem. Além disso, baixas potências de laser são usadas (0,5% -5%) para evitar fotobranqueamento e fototoxicidade.

1. Usando um microscópio estéreo e uma micropinça, corte a ponta do capilar de vidro.
   NOTA: Não corte mais do que apenas a ponta do capilar, pois o diâmetro do capilar deve ser menor que o trato de entrada do coração do peixe-zebra.
2. Usando as pontas de carregamento, encha a agulha com a solução de D-glicose 25 mM.
   NOTA: O capilar deve ser preenchido uniformemente, tomando especial cuidado para evitar a formação de bolhas de ar, pois elas interferem na entrega de volumes de injeção adequados.
3. Monte o capilar de vidro no suporte capilar e conecte-o à microbomba. Mantenha a microbomba a uma pressão de injeção entre 500-1.000 hPa, pressão de compensação = 0 hPa e tempo de entrega = 1 s.
4. Para calibrar o volume de injeção, use um microscópio estéreo equipado com uma ocular graduada. Coloque uma gota de óleo mineral em uma lâmina de vidro sob o estereoscópio. Ajuste o zoom do estereoscópio para uma potência de 4 com uma objetiva de 1,5x. Insira para injetar o capilar de vidro no óleo mineral.
   NOTA: 5 nL equivalem a 5 unidades da graduação mostrada na ocular do estereoscópio. Aumente ou diminua a pressão de injeção da microbomba para ajustar o volume de gota.
5. Monte o suporte capilar no manipulador 3D.
   NOTA: O manipulador 3D deve permitir o controle de movimento fino nas direções x, y e z do suporte capilar.
6. Coloque cuidadosamente o prato que contém as larvas montadas no suporte da placa do microscópio confocal. Use uma objetiva de ar de 10x, 0,8 NA para localizar as larvas usando a opção de campo claro.
7. Oriente o peixe-zebra com o lado do coração na direção em que o capilar e o manipulador 3D estão localizados. Ao observar a fluorescência vermelha, certifique-se de que a ilhota esteja no centro do campo de visão.
   NOTA: A partir deste ponto, o estágio deve permanecer fixo (Figura 2).
8. Usando o manipulador 3D, mova o capilar de vidro em direção ao coração das larvas, penetre na pele e aponte para a cavidade pericárdica. Insira cuidadosamente o capilar no meio da veia cardinal comum (CCV) e do seio venoso (SV), localizado a cerca de 100-200 μm do átrio cardíaco¹⁶, (Figura 1B e Figura 2C). O ângulo da agulha é de aproximadamente 20-30° em relação à superfície da placa. Se a borda da placa estiver muito alta, remova-a para facilitar o acesso do capilar.
   NOTA: Esta é uma etapa crítica, pois é necessária uma penetração muito cuidadosa; Movimentos rápidos podem perturbar o coração ou causar roupas de sangue nesta área. Se o fluxo sanguíneo for perturbado, uma amostra diferente deve ser usada. Como o manipulador 3D mantém uma posição fixa, evite movimentos do palco para não interferir no tecido cardíaco.
9. Assim que o capilar for colocado no SV, mude para uma objetiva de imersão em água de 40x, 1.2 NA. Usando os espelhos dicromáticos vermelho e verde 488/561, encontre o sinal nuclear mCherry em β células e concentre-se na ilhota.
   NOTA: Os núcleos individuais devem ser claramente visíveis e deve haver baixa fluorescência verde (Figura 1D).
10. Configure uma aquisição simultânea para GCaMP6s e fluorescência mCherry com os seguintes parâmetros no menu de configuração inteligente: GFP (GCaMP6s), excitação: 488 nm, emissão: 498-555 nm, cor falsa: verde (selecionar GFP); mCherry, excitação: 561 nm (mCherry), emissão: 570-640 nm, cor falsa: vermelho (Selecionar mCherry). Luz transmitida, cor falsa: cinzas.
11. Ajuste o plano da imagem ajustando o plano focal ao longo do eixo z da ilhota. Encontre um plano que contenha a maioria das células β.
12. Ajuste o ganho do sinal nuclear mCherry para uma identificação uniforme de cada célula individual e cobrindo cerca de 70% do histograma colorido.
13. Ajuste o ganho do sinal GCaMP6s para cobrir pelo menos 25% do histograma colorido, pois o GCaMP6s aumenta seu brilho em até 4 vezes.
14. Ajuste o ganho da luz transmitida para um sinal uniforme da amostra cobrindo cerca de 70% do histograma colorido.
    NOTA: O canal cinza é usado para visualizar e garantir o fluxo sanguíneo adequado da ilhota.
15. No Modo de aquisição, defina a resolução da imagem para 512 x 512 pixels, o zoom para 5, o passo da linha para 3, a velocidade de digitalização para 13 e a média da linha para 2-3. Selecione a opção Série temporal e defina a Duração para 500 ciclos, com taxa de aquisição de 150 ms por quadro.
    NOTA: Os primeiros 50 quadros da série temporal correspondem à fluorescência da linha de base antes da injeção de glicose. Observou-se que algumas células-β apresentam atividade basal in vivo. Uma célula β que responde mostrará um aumento na intensidade da fluorescência verde com a injeção de glicose ao longo do tempo. A maioria das células β mostra uma resposta à injeção de glicose de 25 mM in vivo.
16. Inicie a imagem. Após os primeiros 50 quadros (7,5 s), injete a glicose usando a microbomba.
    NOTA: As injeções podem produzir um leve movimento que pode mudar o plano focal da ilhota. Durante a gravação do filme, os movimentos intestinais podem alterar o plano focal da ilhota.
17. Fique de olho na aquisição da imagem e ajuste manualmente as coordenadas x, y e z para manter o mesmo plano focal ao longo do filme.
18. Após a injeção de glicose, o sistema registra a resposta das ilhotas em termos de influxo de Ca²⁺ como um aumento na fluorescência do GCaMP. Após cada injeção, deixe as larvas descansarem por pelo menos 5 minutos antes de qualquer estimulação adicional.
    NOTA: Certifique-se de que os núcleos das células permaneçam estáveis durante o processo. Se a ilhota estiver se movendo extensivamente durante a aquisição ou se a ilhota tiver saído do plano focal, a amostra não pode ser usada para análise posterior.
19. Repita a injeção três vezes. Salve os vídeos nos formatos TIF, CZI ou LSM (recomendado). Depois de registrar as respostas de Ca²⁺ , remova o capilar do coração muito lentamente. Passe para o próximo exemplo.
    NOTA: As larvas de peixe-zebra podem ser recuperadas em uma placa de Petri com E2 fresco contendo PTU.

4. Quantificação de traços de fluorescência GCaMP para células β individuais

NOTA: Se o animal apresentar muito movimento, o filme pode ser estabilizado usando o plug-in FIJI Registro de série baseado em descritor (2d/3d + t)¹⁷.

1. Carregue a imagem a ser analisada arrastando e soltando em FIJI. Na janela Opções de importação de bioformato, clique em OK.
   NOTA: Para formatos não suportados pela FIJI, converta os vídeos para o formato tiff para análise.
2. Para extrair a intensidade fluorescente do GCaMP, clique no menu Analisar > Definir Medições. Marque a caixa Densidade integrada e clique em OK.
   1. Abra o ROI Manager.
   2. No menu FIJI, selecione Seleções de polígono localizadas na barra de ferramentas.
   3. Desenhe manualmente um polígono cobrindo uma área ligeiramente maior que o núcleo da célula e incluindo parte da área citoplasmática da célula para garantir a quantificação adequada de uma única célula da resposta de Ca²⁺ .
   4. Certifique-se de que a posição do ROI seja consistente sobre os quadros; se necessário, ajuste o ROI.
   5. Adicione o ROI selecionado ao ROI Manager clicando no botão Adicionar [t ].
3. Para quantificar o sinal do GCaMP, separe os canais da imagem. Clique no menu FIJI Imagem > Cores > Dividir Canais e selecione Canal Verde.
4. No ROI Manager, selecione todas as áreas e clique no menu Mais > Multi Measure. Salve os resultados.
   NOTA: Se a célula sair da área do polígono devido à injeção de glicose ou movimento do animal, extraia a fluorescência da célula antes e depois do movimento ajustando manualmente a área do polígono.
5. Para executar a análise de célula única, execute as etapas a seguir.
   1. Remova a florescência de fundo. Para isso, considere a fluorescência de fundo como o valor mínimo registrado sobre o filme para cada célula (F_MIN). O mínimo é subtraído de toda a série temporal (F_T - F_MIN) PARA CADA CÉLULA.
   2. Normalize os valores de fluorescência em todo o filme. Para conseguir isso, divida cada valor pelo valor de intensidade mais alto sobre as gravações de cada célula. Para isso, calcule a diferença entre F_MIN e F_MAX, ou seja, (F_MAX - F_MIN). Divida (F_T - F_MIN) / (F_MAX - F_MIN).
      NOTA: Esta etapa permite a comparação da resposta de Ca²⁺ entre diferentes células e entre ilhotas de diferentes animais, pois elas emitirão níveis variados de intensidades fluorescentes dependendo do plano focal e da acessibilidade da célula ou ilhota à imagem.
6. Após a aquisição dos valores de fluorescência de célula única, use um programa (por exemplo, Excel ou R) para processar os valores fluorescentes medidos a partir da etapa 4 e plotar automaticamente os traços fluorescentes. Para a realização da análise nesse protocolo (etapa 6), foi utilizada a Tabela Suplementar 1 (Singlecelltrace.xlsx).

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Resultados

Usando este protocolo, a resposta à glicose de células β individuais em seu ambiente nativo foi caracterizada. Para isso, a larva do peixe-zebra é montada em uma placa de Petri com fundo de vidro. Usando um manipulador 3D, um capilar de vidro foi inserido na circulação, visando o VS (Figura 1 e Figura 2). Isso permite a injeção de volumes específicos de soluções com uma concentração definida. Simultaneamente, o infl...

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Discussão

Neste protocolo, foi explorada a dinâmica de Ca²⁺ de células β em seu microambiente nativo com resolução de célula única. Isso é possível estimulando as células β peixe-zebra com uma injeção de glicose na circulação enquanto registra sua dinâmica de Ca²⁺ usando GCaMP6s.

O protocolo oferece três vantagens principais. Primeiro, os pesquisadores demonstraram que as células β do peixe-zebra mostram uma resposta coordenada ?...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm diameter glass-bottom dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C	We use this glass-bottom dish to mount the zebrafish larvae and perform confocal microscopy
Blue-Green filter cube	ZEISS	489038-9901-000	Filter Set 38 HE
Confocal Microscope	ZEISS	LSM 980
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Excel (2016)			https://www.office.com/
Femtojet	Eppendorf	5252000013	This equipment is a pneumatic micropump, which allows precise volume delivery and is accompanied by a capillary holder. We use the micropump Femtojet (injection pressure between 500-1000 hPa; compensation pressure = 0 hPa; and delivery time = 1 second).
Femtotips, glass capillaries ready to be used.	Eppendorf	5242952008	This are ready to use glass capillaries that can substitute the pulled-capillaries.
FIJI, using ImageJ Version: 1.51c			https://fiji.sc/
Fluorescence lamp	ZEISS	423013-9010-000	Illuminator HXP 120 V
Glass capillaries 3.5"	Drummonds Scientific Company	3-000-203-G/X	We use these glass capillaries to prepare the injection capillaries by pulling them with a capillary -puller
Injectman	Eppendorf	5192000019	This equipment allows for 3D manipulation of the capillary holder
Low melting agarose	Biozym	Art. -Nr.: 840101	We use the agarose to mount the zebrafish onto the glass-bottom dish
Microloader tip for glass microcapillaries 0.5 – 20 µL, 100 mm	Eppendorf	5242956003	Long tips for loading the glass capillaries with the solutions
Micro-tweezers	Dumont Swiss made	0102-4-PO	We use the micro-tweezers to move the zebrafish larvae during the mounting and to cut off the tip of the glass capillary (eg. Dumont, size 4).
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904	We use the mineral oil to calibrate the drop size to inject
P-1000 Next Generation Pipette Puller	Science Products	P-1000	We use this capillary puller to prepare the glass capillary using the Drumond capillaries. We use the P-1000 capillary puller with the following parameters: Heat: 650, Pull: 20, Vel: 160, Time: 200, Pressure: 500.
PTU (1-phenyl-2-thiourea )	Sigma-Aldrich	P7629	We use this compound to inhibit pigmentation during zebrafish development
Red Filter Cube	ZEISS	000000-1114-462	Filter set 45 HQ TexasRed
Stereo microscope	ZEISS	495015-0001-000	SteREO Discovery.V8
Syringe filters, sterile. Pore size 0.2 µm	Pall Corporation	4612	We use these to filter all the solutions and prevent the capillary needle clothing
Transgenic Zebrafish line:Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)
tricaine methanesulfonate (MS222)	Sigma-Aldrich	E10521	We use this compound to anesthetize the fish larvae