Imágenes simultáneas de calcio y estimulación de la glucosa en peces cebra vivos para investigar in vivo la función de las células β

Resumen

Aquí, el estudio presenta un protocolo para la obtención de imágenes de calcio y la estimulación de la glucosa de las células β pancreáticas del pez cebra in vivo.

Resumen

Las células β pancreáticas mantienen la homeostasis sistémica de la glucosa mediante la producción y secreción de insulina de acuerdo con los niveles de glucosa en sangre. Los defectos en la función de las células β se asocian con la hiperglucemia que puede conducir a la diabetes. Durante el proceso de secreción de insulina, las células β experimentan una afluencia de Ca²⁺. Por lo tanto, la obtención de imágenes de la afluencia de Ca²⁺ estimulada por la glucosa utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) proporciona una vía para estudiar la función de las células β. Anteriormente, los estudios mostraron que los islotes aislados de pez cebra que expresan GCaMP6 exhiben una actividad significativa de Ca²⁺ tras la estimulación con concentraciones de glucosa definidas. Sin embargo, es fundamental estudiar cómo las células β responden a la glucosa no de forma aislada, sino en su entorno nativo, donde están conectadas sistémicamente, vascularizadas y densamente inervadas. Con este fin, el estudio aprovechó la transparencia óptica de las larvas de pez cebra en las primeras etapas de desarrollo para iluminar la actividad de las células β in vivo. Aquí, se presenta un protocolo detallado para la obtención de imágenes de Ca²⁺ y la estimulación de la glucosa para investigar la función de las células β in vivo . Esta técnica permite monitorizar la dinámica coordinada de Ca²⁺ en β celdas con resolución de una sola célula. Además, este método se puede aplicar para trabajar con cualquier solución inyectable, como moléculas pequeñas o péptidos. En conjunto, el protocolo ilustra el potencial del modelo de pez cebra para investigar la coordinación de los islotes in vivo y para caracterizar cómo los componentes ambientales y genéticos podrían afectar la función de las células β.

Introducción

Las células β pancreáticas exhiben la capacidad única de secreción de insulina en respuesta a la glucosa. Después de una comida rica en carbohidratos, el azúcar en la sangre aumenta y entra en las células β, donde se metaboliza rápidamente para producir ATP. El aumento de la relación intracelular de ATP/ADP conduce al cierre de los canales de K⁺ dependientes de ATP, despolarizando la membrana celular y activando los canales de Ca²⁺ dependientes de voltaje. El rápido aumento de Ca²⁺ intracelular estimula la secreción de gránulos de insulina por parte de las células β.

La obtención de imágenes de las células de los islotes dentro del páncreas intacto en ratones es exigente y requiere la exteriorización de todo el órgano. Una potente alternativa para la obtención de imágenes in vivo no invasivas es el trasplante de islotes en la cámara anterior (CA) del ojo de ratones¹. Los islotes trasplantados en el CA de ratones imitan un entorno in vivo, lo que permite estudios longitudinales e imágenes de Ca²⁺ in vivo ^2,3. Sin embargo, el proceso de revascularización de los islotes puede llevar varias semanas después del trasplante de los islotes⁴. Por lo tanto, preservar el entorno nativo original, donde las células β están vascularizadas y conectadas al estado metabólico del organismo, y lograr la resolución de imágenes de una sola célula in vivo sigue siendo un gran desafío y requiere mucho tiempo.

Para superar estas limitaciones, los investigadores han desarrollado líneas transgénicas de pez cebra que expresan GECIs en β células, lo que permite la visualización en tiempo real de la afluencia de Ca²⁺ en las células^β 5,6,7,8,9. Utilizando estas herramientas, se encontró que en cultivo celular, las células β del pez cebra muestran una respuesta conservada a la glucosa elevada, similar a los islotes de ratón y humanos. Además, la claridad óptica de las larvas de pez cebra ha permitido examinar la función de las células β en su entorno nativo. Es importante destacar que, a partir de los 4 días después de la fertilización (dpf), las células β del islote primario del pez cebra expresan marcadores de madurez, como el ortólogo del pez cebra de urocortina3 (ucn3l) y muestran respuestas in vitro a la glucosa en el rango fisiológico⁶. Además, el islote del pez cebra está densamente vascularizado e inervado¹⁰. La ablación genética de las células β en esta etapa conduce a la intolerancia a la glucosa. Además, el pez cebra muestra respuestas conservadas a agentes reductores de glucosa como la insulina y las sulfonilureas, lo que demuestra que el islote primario es un tejido sensible a la glucosa y conectado sistémicamente que controla los niveles de glucosa. Estas características especiales hacen del pez cebra un modelo único para estudiar la actividad de las células β de los islotes in vivo^11,12.

El protocolo para la obtención de imágenes de Ca²⁺ y la inyección simultánea de glucosa directamente en la circulación del pez cebra permite investigar la respuesta a la glucosa de la célula β in vivo. Este protocolo permite la inyección de concentraciones de glucosa definidas en combinación con una alta resolución temporal y espacial, que en conjunto revelan la respuesta coordinada de las células β a la glucosa y la presencia de células β de primera respuesta in vivo¹³. Además, el protocolo se puede adaptar a cualquier solución inyectable, como compuestos químicos o péptidos pequeños. En general, esta metodología ilustra la fortaleza del modelo de pez cebra para investigar la coordinación β células in vivo y caracterizar cómo los componentes ambientales y genéticos podrían afectar la función de las células β.

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Protocolo

Las líneas transgénicas previamente establecidas y utilizadas en este estudio fueron Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)⁶, Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP)¹⁴. Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las leyes de la Unión Europea y Alemania (Tierschutzgesetz) y con la aprobación de los Comités de Ética de la Universidad Técnica de Dresde y de la Landesdirektion Sachsen (números de aprobación: AZ 24D-9168,11-1/2013-14, TV38/2015, T12/2016 y T13/2016, TVV50/2017, TVV 45/2018 y TVV33-2019). En este estudio, se realizaron todas las imágenes en vivo in vivo e inyecciones de glucosa, así como procedimientos experimentales con larvas de pez cebra que no superaron la etapa de 5 días después de la fertilización (dpf), según lo establecido en la ley de protección animal (TierSchVersV §14). De acuerdo con la directiva de la UE 2010/63/UE, el uso de estas etapas anteriores del pez cebra reduce el número de animales de experimentación, de acuerdo con los principios de las 3R.

1. Preparación

NOTA: Este protocolo se refiere a la obtención de imágenes in vivo de Ca²⁺ del islote primario del pez cebra de Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) larvas transgénicas dobles. En estos animales, el promotor de insulina impulsa la expresión de cdt1-mCherry, que marca los núcleos de las células β individuales en fluorescencia roja. GCaMP6s muestra cambios en la fluorescencia verde en respuesta a los niveles intracelulares de Ca²⁺ . La expresión específica de los GCaMP6 en las células β permite caracterizar la capacidad de respuesta a la glucosa de las células individuales sin la interferencia de otros tipos de células o tejidos.

1. Preparar medios embrionarios E2¹⁵.
2. Prepare 1-feniil-2-tiourea (PTU) al 0,003% (200 μm) en solución salina de Hanks^{al 10% 15}.
3. Preparar agarosa (LMA) de bajo punto de fusión al 1% en medio embrionario E2 calentándola en un microondas y filtrándola con un filtro de tamaño de poro de <25 μm. Mantenga la LMA a >37 °C durante un máximo de 1 semana.
   NOTA: Todas las soluciones deben filtrarse para evitar la obstrucción del capilar de vidrio utilizado para la inyección.
4. Prepare una solución al 0,4% de sulfonato de metano tricaína (MS222) con 979 mL de H₂O estéril y 21 mL de Tris 1 M (pH 9). Ajuste el pH a 7.
5. Disuelva 1,8 g de D-glucosa en 50 mL de PBS para preparar una solución de D-glucosa de 200 mM y fíltrela con filtros de tamaño de poro de <25 μm. Prepare una solución de trabajo de D-Glucosa (25 mM) mediante una dilución 1:8 de la D-Glucosa 200 mM en 1x PBS (filtrado). Mantener a 4 °C para almacenamiento a largo plazo. Añadir 5 μL de rojo de fenol a 1 mL de D-glucosa de 25 mM para poder visualizar la solución tras la inyección.
   NOTA: Esta solución puede mantenerse a 4 °C durante 1 semana. Sin embargo, la solución de trabajo de 25 mM debe prepararse fresca. Deseche el caldo si hay algún signo de contaminación.
6. Prepare capilares de vidrio de microinyección extraídos utilizando un extractor de capilares o adquiera capilares de microvidrio disponibles en el mercado. Los ajustes para la extracción de la aguja se describen en la Tabla de materiales.
   NOTA: Se encontró que los capilares de microinyección hechos de vidrio de borosilicato sin filamento interno ofrecen mejores resultados en comparación con capilares similares con filamento interno.
7. Procure platos con fondo de vidrio de 35 mm de diámetro para montar las larvas de pez cebra. En este protocolo se utilizaron antenas con fondo de vidrio con una cubierta de vidrio de 0,17 mm, ya que permiten la obtención de imágenes con objetivos corregidos por vidrio en sistemas confocal.
8. Adquisición de puntas de pipeta de microcarga. En este protocolo se utilizaron microcargadores de 20 μL con una longitud de 100 mm.
9. Consigue un juego de micropinzas.
10. Obtenga placas de Petri de 90 mm para clasificar y cultivar pez cebra.
11. Procura aceite mineral.
12. Adquirir una microbomba neumática o un sistema para suministrar de 1 a 5 nL de volúmenes de líquido a través de los capilares de vidrio.
13. Para la clasificación y el montaje del pez cebra, utilice un microscopio estereoscópico equipado con una fuente de luz y con cubos de filtro azul y rojo para la fluorescencia (CFP: excitación 420-450 nm, emisión 460-490 nm, TRITC: excitación: 532-554 nm, emisión: 570-613 nm; o Texas-Red: excitación: 540-580 nm, emisión: 592-667 nm). Ordene el doble transgénico Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) larvas utilizando el estereoscopio. Seleccionar los embriones con fluorescencia azul y roja en la retina debido a la expresión de CFP y mCherry bajo el promotor de cristalina.
14. Para obtener imágenes de la afluencia de Ca²⁺ en las células de β, utilice un microscopio confocal invertido equipado con un objetivo de aire de 10x (0,8 NA) y un objetivo de agua de 40x (1,0 NA). Utilice una platina que contenga el soporte de placas para las placas con fondo de vidrio de 35 mm de diámetro.
15. Obtenga un manipulador 3D manual o motorizado con un soporte capilar. Inserte el capilar de vidrio en el soporte capilar y monte el soporte capilar en el manipulador 3D.
    NOTA: El manipulador 3D permite el movimiento preciso del capilar de vidrio y la inserción en las larvas de pez cebra.

2. Montaje de larvas de pez cebra

NOTA: El doble transgénico Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; Los embriones cryaa:mCherry) se tratan con un 0,03% (20 μM) de 1-fenil-2-tiourea (PTU) para inhibir la pigmentación a partir de las 24 h posteriores a la fecundación. A 4,5 dpf, anestesiar las larvas utilizando el 0,04% de la concentración final de Tricaína justo antes de la monta.

1. Para mantener la anestesia durante la sesión de imagen, añadir a la agarosa de bajo punto de fusión al 1% una concentración final de 0,04% de tricaína y 20 μM de PTU. Mantenga la agarosa LMA a >37 °C hasta su uso. Utilice esta solución el mismo día de la preparación.
2. Clasifique el doble transgénico anestesiado Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) larvas . Coloque de 3 a 5 peces en una placa de Petri con fondo de vidrio y retire la mayor parte del líquido.
   NOTA: No deje que las larvas se sequen en este paso y manténgalas siempre sumergidas en una cantidad mínima de E2.
3. Agregue 500 μL de LMA en la placa de Petri con fondo de vidrio que contiene el pez y, con la ayuda de las micropinzas, mueva suavemente el pez para que el lado derecho del pez esté directamente en contacto con el fondo de vidrio. Retira el exceso de agarosa y deja que se solidifique durante 1-3 min. Observe que la agarosa se vuelve ligeramente opaca en este punto (Figura 1B).
   NOTA: Si la agarosa está demasiado caliente, podría dañar las larvas. Para evitar esto, deje que la agarosa se enfríe a temperatura ambiente durante 30-45 s antes de agregarla a las larvas.
4. Una vez que la agarosa se solidifique, con la ayuda de las micropinzas, retire cuidadosamente la agarosa alrededor de la zona del corazón para evitar la rotura de la aguja utilizada para la inyección posterior al contacto con la agarosa (Figura 1C).
5. Añadir 500 μL de E2 que contenga una concentración final de 0,04% de tricaína y 20 μM de PTU.
   NOTA: Asegúrese de evitar el secado de las larvas durante la toma de imágenes en vivo.

3. Inyección simultánea e imagen de Ca²⁺ de células β

NOTA: Aquellas larvas que tienen un exceso de yema en la parte superior del páncreas debido a un retraso en el desarrollo no deben usarse para la obtención de imágenes, ya que los lípidos de la yema interfieren con la calidad de la imagen. Además, se utilizan potencias láser bajas (0,5%-5%) para evitar el fotoblanqueo y la fototoxicidad.

1. Con un microscopio estereoscópico y micropinzas, corte la punta del capilar de vidrio.
   NOTA: No corte más que la punta del capilar, ya que el diámetro del capilar debe ser más pequeño que el tracto de entrada del corazón del pez cebra.
2. Con las puntas de carga, llene la aguja con la solución de D-glucosa de 25 mM.
   NOTA: El capilar debe llenarse uniformemente, teniendo especial cuidado para evitar la formación de burbujas de aire, ya que interfieren con la entrega de los volúmenes de inyección adecuados.
3. Monte el capilar de vidrio en el soporte capilar y conéctelo a la microbomba. Mantenga la microbomba a una presión de inyección entre 500 y 1.000 hPa, presión de compensación = 0 hPa y tiempo de entrega = 1 s.
4. Para calibrar el volumen de inyección, utilice un microscopio estereoscópico equipado con un ocular graduado. Coloque una gota de aceite mineral en un portaobjetos de vidrio debajo del estereoscopio. Ajuste el zoom del estereoscopio a una potencia de 4 con un objetivo de 1,5x. Inserto para inyectar el capilar de vidrio en el aceite mineral.
   NOTA: 5 nL equivalen a 5 unidades de la graduación que se muestra en el ocular del estereoscopio. Aumente o disminuya la presión de inyección de la microbomba para ajustar el volumen de gota.
5. Monte el soporte capilar en el manipulador 3D.
   NOTA: El manipulador 3D debe permitir un control preciso del movimiento en las direcciones x, y y z del soporte capilar.
6. Coloque con cuidado la placa que contiene las larvas montadas en el soporte de la placa del microscopio confocal. Utilice un objetivo aéreo de 10x y 0,8 NA para localizar las larvas utilizando la opción de campo claro.
7. Oriente el pez cebra con el lado del corazón hacia la dirección donde se encuentran el capilar y el manipulador 3D. Al observar la fluorescencia roja, asegúrese de que el islote esté en el centro del campo de visión.
   NOTA: A partir de este punto, la etapa debe permanecer fija (Figura 2).
8. Con el manipulador 3D, mueva el capilar de vidrio hacia el corazón de las larvas, penetre en la piel y apunte a la cavidad pericárdica. Inserte con cuidado el capilar en el centro de la vena cardinal común (CCV) y el seno venoso (SV), ubicado alrededor de 100-200 μm de la aurícula^{cardíaca 16} (Figura 1B y Figura 2C). El ángulo de la aguja es de aproximadamente 20-30° en relación con la superficie de la placa. Si el borde de la placa es demasiado alto, retírelo para permitir un acceso más fácil para el capilar.
   NOTA: Este es un paso crítico, ya que se requiere una penetración muy cuidadosa; Los movimientos rápidos pueden perturbar el corazón o causar sangre en esta área. Si el flujo sanguíneo está perturbado, se debe usar una muestra diferente. Dado que el manipulador 3D mantiene una posición fija, evite los movimientos de la platina para no interferir con el tejido cardíaco.
9. Una vez que el capilar se coloca en el SV, cambie a un objetivo de inmersión en agua de 40x, 1.2 NA. Usando los espejos dicromáticos rojo y verde 488/561, encuentre la señal nuclear mCherry en β celdas y concéntrese en el islote.
   NOTA: Los núcleos individuales deben ser claramente visibles y debe haber una fluorescencia verde baja (Figura 1D).
10. Configure una adquisición simultánea para GCaMP6s y fluorescencia mCherry con los siguientes parámetros en el menú de configuración inteligente: GFP (GCaMP6s), excitación: 488 nm, emisión: 498-555 nm, color falso: verde (Seleccione GFP); mCherry, excitación: 561 nm (mCherry), emisión: 570-640 nm, falso color: rojo (Select mCherry). Luz transmitida, falso color: grises.
11. Ajuste el plano de la imagen ajustando el plano focal a lo largo del eje z del islote. Encuentre un plano que contenga la mayoría de las β celdas.
12. Ajuste la ganancia de la señal nuclear mCherry para una identificación uniforme de cada célula individual y cubra alrededor del 70% del histograma de color.
13. Ajuste la ganancia de la señal GCaMP6s para cubrir al menos el 25% del histograma de color, ya que el GCaMP6s aumenta su brillo hasta 4 veces.
14. Ajuste la ganancia de la luz transmitida para obtener una señal uniforme de la muestra que cubra alrededor del 70% del histograma de color.
    NOTA: El canal gris se utiliza para visualizar y asegurar el flujo sanguíneo adecuado del islote.
15. En el modo de adquisición, establezca la resolución de la imagen en 512 x 512 píxeles, el zoom en 5, el paso de línea en 3, la velocidad de escaneo en 13 y el promedio de línea en 2-3. Seleccione la opción Serie temporal y establezca la Duración en 500 ciclos, con una velocidad de adquisición de 150 ms por fotograma.
    NOTA: Los primeros 50 fotogramas de la serie temporal corresponden a la fluorescencia basal antes de la inyección de glucosa. Se ha observado que algunas células β muestran actividad basal in vivo. Una célula β que responde mostrará un aumento en la intensidad de la fluorescencia verde con la inyección de glucosa con el tiempo. La mayoría de las células β muestran una respuesta a la inyección de glucosa de 25 mM in vivo.
16. Inicie la toma de imágenes. Después de los primeros 50 fotogramas (7,5 s), inyecte la glucosa con la microbomba.
    NOTA: Las inyecciones pueden producir un ligero movimiento que puede desplazar el plano focal del islote. Durante la grabación de la película, los movimientos intestinales pueden cambiar el plano focal del islote.
17. Vigile la adquisición de imágenes y ajuste manualmente las coordenadas x, y y z para mantener el mismo plano focal a lo largo de la película.
18. Después de la inyección de glucosa, el sistema registra la respuesta de los islotes en términos de afluencia de Ca²⁺ como un aumento en la fluorescencia de GCaMP. Después de cada inyección, deje reposar las larvas durante al menos 5 minutos antes de cualquier estimulación adicional.
    NOTA: Asegúrese de que los núcleos de las células permanezcan estables durante el proceso. Si el islote se mueve mucho durante la adquisición o si el islote se ha movido fuera del plano focal, la muestra no se puede utilizar para análisis posteriores.
19. Repita la inyección tres veces. Guarde los vídeos en formatos TIF, CZI o LSM (recomendado). Después de registrar las respuestas de Ca²⁺ , retire el capilar del corazón muy lentamente. Pase a la siguiente muestra.
    NOTA: Las larvas de pez cebra se pueden recuperar en una placa de Petri con E2 fresco que contiene PTU.

4. Cuantificación de trazas de fluorescencia GCaMP para células β individuales

NOTA: Si el animal presenta demasiado movimiento, la película se puede estabilizar utilizando el plug-in FIJI Registro de series basado en descriptores (2d/3d + t)¹⁷.

1. Cargue la imagen a analizar arrastrando y soltando en FIJI. En la ventana Opciones de importación de bioformato, haga clic en Aceptar.
   NOTA: Para formatos no compatibles con FIJI, convierta los videos a formato tiff para su análisis.
2. Para extraer la intensidad fluorescente de GCaMP, haga clic en el menú Analizar > Establecer mediciones. Marque la casilla Densidad integrada y haga clic en Aceptar.
   1. Abra el Administrador de ROI.
   2. En el menú FIJI, seleccione Selecciones de polígonos ubicado en la barra de herramientas.
   3. Dibuje manualmente un polígono que cubra un área ligeramente mayor que el núcleo de la célula e incluya parte del área citoplasmática de la célula para garantizar la cuantificación adecuada de la respuesta de Ca²⁺ en una sola célula.
   4. Asegúrese de que la posición del ROI sea coherente a lo largo de los fotogramas; si es necesario, ajuste el ROI.
   5. Agregue el ROI seleccionado al Administrador de ROI haciendo clic en el botón Agregar [t].
3. Para cuantificar la señal del GCaMP, separe los canales de la imagen. Haga clic en el menú FIJI Imagen > Colores > Canales divididos y seleccione Canal verde.
4. En el Administrador de ROI, seleccione todas las áreas y haga clic en el menú Más > Multi Medida. Guarde los resultados.
   NOTA: Si la celda se mueve fuera del área del polígono debido a la inyección de glucosa o al movimiento del animal, extraiga la fluorescencia de la celda antes y después del movimiento ajustando manualmente el área del polígono.
5. Para realizar el análisis de una sola celda, ejecute los siguientes pasos.
   1. Elimina la florescencia de fondo. Para ello, considere la fluorescencia de fondo como el valor mínimo registrado en la película para cada celda (F_MIN). El mínimo se resta de toda la serie temporal (F_T - F_MIN) para cada celda.
   2. Normalice los valores de fluorescencia en toda la película. Para lograr esto, divida cada valor por el valor de intensidad más alto en las grabaciones de cada celda. Para ello, calcule la diferencia entre F_MIN y F_MAX, es decir, (F_MAX - F_MIN). Dividir (F_T - F_MIN) / (F_MAX - F_MIN).
      NOTA: Este paso permite comparar la respuesta de Ca²⁺ entre diferentes células y entre islotes de diferentes animales, ya que emitirán diferentes niveles de intensidades fluorescentes dependiendo del plano focal y de la accesibilidad de la célula o islote a las imágenes.
6. Después de adquirir los valores de fluorescencia de una sola célula, utilice un programa (por ejemplo, Excel o R) para procesar los valores fluorescentes medidos en el paso 4 y trace automáticamente las trazas fluorescentes. Para realizar el análisis en este protocolo (paso 6), se utilizó la Tabla Suplementaria 1 (Singlecelltrace.xlsx).

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Resultados

Utilizando este protocolo, se caracterizó la respuesta a la glucosa de las células β individuales en su entorno nativo. Para ello, la larva de pez cebra se monta en una placa de Petri con fondo de cristal. Utilizando un manipulador 3D, se insertó un capilar de vidrio en la circulación, dirigido al SV (Figura 1 y Figura 2). Esto permite la inyección de volúmenes específicos de soluciones con una concentración definida. A...

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Discusión

En este protocolo, se exploró la dinámica de Ca²⁺ de las células β en su microambiente nativo con resolución de una sola célula. Esto es posible estimulando las células β del pez cebra con una inyección de glucosa en la circulación mientras registran su dinámica de Ca²⁺ utilizando GCaMP6s.

El protocolo ofrece tres ventajas principales. En primer lugar, los investigadores han demostrado que las células β del pez cebra muestran...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm diameter glass-bottom dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C	We use this glass-bottom dish to mount the zebrafish larvae and perform confocal microscopy
Blue-Green filter cube	ZEISS	489038-9901-000	Filter Set 38 HE
Confocal Microscope	ZEISS	LSM 980
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Excel (2016)			https://www.office.com/
Femtojet	Eppendorf	5252000013	This equipment is a pneumatic micropump, which allows precise volume delivery and is accompanied by a capillary holder. We use the micropump Femtojet (injection pressure between 500-1000 hPa; compensation pressure = 0 hPa; and delivery time = 1 second).
Femtotips, glass capillaries ready to be used.	Eppendorf	5242952008	This are ready to use glass capillaries that can substitute the pulled-capillaries.
FIJI, using ImageJ Version: 1.51c			https://fiji.sc/
Fluorescence lamp	ZEISS	423013-9010-000	Illuminator HXP 120 V
Glass capillaries 3.5"	Drummonds Scientific Company	3-000-203-G/X	We use these glass capillaries to prepare the injection capillaries by pulling them with a capillary -puller
Injectman	Eppendorf	5192000019	This equipment allows for 3D manipulation of the capillary holder
Low melting agarose	Biozym	Art. -Nr.: 840101	We use the agarose to mount the zebrafish onto the glass-bottom dish
Microloader tip for glass microcapillaries 0.5 – 20 µL, 100 mm	Eppendorf	5242956003	Long tips for loading the glass capillaries with the solutions
Micro-tweezers	Dumont Swiss made	0102-4-PO	We use the micro-tweezers to move the zebrafish larvae during the mounting and to cut off the tip of the glass capillary (eg. Dumont, size 4).
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904	We use the mineral oil to calibrate the drop size to inject
P-1000 Next Generation Pipette Puller	Science Products	P-1000	We use this capillary puller to prepare the glass capillary using the Drumond capillaries. We use the P-1000 capillary puller with the following parameters: Heat: 650, Pull: 20, Vel: 160, Time: 200, Pressure: 500.
PTU (1-phenyl-2-thiourea )	Sigma-Aldrich	P7629	We use this compound to inhibit pigmentation during zebrafish development
Red Filter Cube	ZEISS	000000-1114-462	Filter set 45 HQ TexasRed
Stereo microscope	ZEISS	495015-0001-000	SteREO Discovery.V8
Syringe filters, sterile. Pore size 0.2 µm	Pall Corporation	4612	We use these to filter all the solutions and prevent the capillary needle clothing
Transgenic Zebrafish line:Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)
tricaine methanesulfonate (MS222)	Sigma-Aldrich	E10521	We use this compound to anesthetize the fish larvae