생체 내 β세포 기능을 조사하기 위한 살아있는 제브라피시의 칼슘 이미징 및 포도당 자극 동시

요약

여기에서 이 연구는 생체 내에서 제브라피쉬의 췌장 β세포의 칼슘 이미징 및 포도당 자극을 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

췌장 β세포는 혈당 수치에 따라 인슐린을 생산하고 분비하여 전신 포도당 항상성을 유지합니다. β세포 기능의 결함은 당뇨병으로 이어질 수 있는 고혈당증과 관련이 있습니다. 인슐린이 분비되는 과정에서 β세포는 Ca²⁺의 유입을 경험합니다. 따라서 유전적으로 암호화된 칼슘 지표(GECI)를 사용하여 포도당 자극 Ca²⁺ 유입을 이미징하면 β세포 기능을 연구할 수 있습니다. 이전에 연구에 따르면 GCaMP6를 발현하는 고립된 제브라피시 섬은 정의된 포도당 농도로 자극할 때 상당한 Ca²⁺ 활성을 나타냅니다. 그러나 β세포가 포도당에 어떻게 반응하는지 연구하는 것이 가장 중요하며, 포도당은 단독으로 반응하는 것이 아니라 전신적으로 연결되고, 혈관화되고, 조밀하게 신경분포되어 있는 본래 환경에서 포도당에 반응합니다. 이를 위해 이 연구는 발달 초기 단계에서 제브라피시 유충의 광학적 투명도를 활용하여 생체 내에서 β세포 활동을 조명했습니다. 여기에서는 in vivo에서 β세포 기능을 조사하기 위한 Ca²⁺ 이미징 및 포도당 자극에 대한 자세한 프로토콜이 제시됩니다. 이 기술을 사용하면 단일 세포 분해능으로 β-세포에서 조정된 Ca²⁺ 역학을 모니터링할 수 있습니다. 게다가, 이 방법은 작은 분자 펩티드와 같은 어떤 주사 가능한 해결책든지 사용하기 위하여 적용될 수 있습니다. 전체적으로 이 프로토콜은 생체 내에서 섬 조정을 조사하고 환경 및 유전적 요소가 β세포 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 특성화할 수 있는 제브라피시 모델의 잠재력을 보여줍니다.

서문

췌장 β세포는 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 독특한 능력을 나타냅니다. 탄수화물이 풍부한 식사를 한 후에는 혈당이 증가하여 β세포로 들어가 빠르게 대사되어 ATP를 생성합니다. ATP/ADP의 세포 내 비율의 증가는 ATP 의존성 K⁺ 채널의 폐쇄로 이어지며, 세포막을 탈분극시키고 전압 의존성 Ca²⁺ 채널을 활성화합니다. 세포 내 Ca²⁺ 의 급격한 증가는 β세포의 인슐린 과립 분비를 자극합니다.

생쥐의 온전한 췌장 내에 있는 섬 세포의 이미징은 까다롭고 전체 장기의 외부화가 필요합니다. 비침습적 in vivo 이미징을 위한 강력한 대안은 마우스¹의 눈의 전방(AC)에 섬을 이식하는 것입니다. 마우스의 AC에 이식된 섬은 in vivo 환경을 모방하여 종단 연구 및 Ca²⁺ 이미징 in vivo ^2,3을 가능하게 합니다. 그럼에도 불구하고, 섬 혈관재생은 섬 이식 후 몇 주가 걸릴 수 있다⁴. 따라서 β세포가 혈관화되고 유기체의 대사 상태와 연결되는 원래의 네이티브 환경을 보존하고 in vivo 단일 세포 이미징 해상도를 달성하는 것은 매우 어렵고 시간이 많이 소요됩니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 연구자들은 β세포에서 GECI를 발현하는 제브라피시 형질전환 라인을 개발하여 β세포 ^5,6,7,8,9에서 Ca²⁺ 유입을 실시간으로 시각화할 수 있습니다. 이러한 도구를 사용하여 세포 배양에서 제브라피시 β세포가 마우스 및 인간 섬과 유사하게 상승된 포도당에 대해 보존된 반응을 보인다는 것을 발견했습니다. 더욱이, 제브라피시 유충의 광학적 선명도는 원래 환경에서 β세포의 기능을 조사할 수 있게 해주었습니다. 중요한 것은, 빠르면 수정 후 4일(dpf)이 되면 제브라피시 1차 섬의 β세포가 urocortin3 (UCN3L)의 제브라피시 orthologue와 같은 성숙도 마커를 발현하고 생리학적 범위⁶의 포도당에 대한 체외 반응을 보인다는 것입니다. 또한, 제브라피시 섬은 조밀하게 혈관화되어 있고 신경분포되어 있습니다¹⁰. 이 단계에서 β세포의 유전자 절제는 포도당 과민증을 유발합니다. 또한, 제브라피시는 인슐린 및 설포닐우레아와 같은 포도당 강하제에 대해 보존된 반응을 보이며, 이는 1차 섬이 포도당 수치를 조절하는 포도당 반응적이고 전신적으로 연결된 조직임을 보여줍니다. 이러한 특별한 특성으로 인해 제브라피쉬는 in vivo^11,12에서 섬 β세포 활성을 연구하는 독특한 모델입니다.

제브라피쉬의 순환에서 직접 Ca²⁺ 이미징 및 동시 포도당 주입을 위한 프로토콜을 통해 in vivo에서 β세포의 포도당 반응성을 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜은 높은 시간 및 공간 해상도와 함께 정의된 포도당 농도를 주입할 수 있으며, 이를 통해 포도당에 대한 β세포의 조정된 반응과 in vivo 13의 첫 번째 반응 β세포의 존재를 모두 드러낼 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 화합물 또는 작은 펩타이드와 같은 모든 주사 가능한 용액에 적용할 수 있습니다. 전반적으로 이 방법론은 생체 내에서 β세포 조정을 조사하고 환경 및 유전적 요소가 β세포의 기능에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 특성화하는 제브라피시 모델의 강점을 보여줍니다.

프로토콜

이 연구에서 사용된 이전에 확립된 형질전환 라인은 Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)⁶, Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP)¹⁴. 모든 실험은 유럽연합 및 독일 법률(Tierschutzgesetz)에 따라 드레스덴 공과대학교(TU Dresden) 및 작센 작센 공과대학(Landesdirektion Sachsen) 윤리위원회(승인 번호: AZ 24D-9168,11-1/2013-14, TV38/2015, T12/2016, T13/2016, TVV50/2017, TVV 45/2018, TVV33-2019)의 승인을 받아 수행되었습니다. 이 연구에서는 동물 보호법(TierSchVersV §14)에 명시된 대로 수정 후 5일(dpf) 단계를 초과하지 않는 제브라피시 유충을 대상으로 모든 생체 내 이미징 및 포도당 주사와 실험 절차를 수행했습니다. EU 지침 2010/63/EU에 따르면 이러한 초기 제브라피시 단계를 사용하면 3R의 원칙에 따라 실험 동물의 수를 줄일 수 있습니다.

1. 준비

참고: 이 프로토콜은 Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(인스:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 이중 형질전환 유충. 이러한 동물에서 인슐린 프로모터는 개별 β세포의 핵을 적색 형광으로 표지하는 cdt1-mCherry의 발현을 유도합니다. GCaMP6s는 세포 내 Ca²⁺ 수준에 대한 반응으로 녹색 형광의 변화를 보여줍니다. β세포에서 GCaMP6s의 특이적 발현은 다른 세포 유형이나 조직의 간섭 없이 개별 세포의 포도당 반응성을 특성화할 수 있습니다.

1. E2 배아 배지 준비¹⁵.
2. 10% 행크스 식염수¹⁵에 0.003%(200μm) 1-페닐-2-티오우레아(PTU)를 준비합니다.
3. 전자레인지에서 가열하고 <25μm 공극 크기 필터로 여과하여 E2 배아 배지에 1% 저융점 아가로스(LMA)를 준비합니다. LMA를 최대 1주일 동안 >37 °C로 유지하십시오.
   참고: 주입에 사용되는 유리 모세관이 막히지 않도록 모든 용액을 여과해야 합니다.
4. 979mL의 멸균 H₂O 및 21mL의 1M Tris(pH 9)와 함께 0.4% 트리카인 메탄 설포네이트(MS222) 용액을 준비합니다. pH를 7로 조정합니다.
5. 50mL의 PBS에 1.8g의 D-글루코오스를 용해시켜 200mM D-글루코스 용액을 준비하고 <25μm 공극 크기 필터로 여과합니다. 200mM D-글루코스를 1x PBS(여과)에서 1:8로 희석하여 D-글루코스(25mM)의 작업 용액을 준비합니다. 장기 보관을 위해 4 °C에서 보관하십시오. 주입 시 용액을 시각화할 수 있도록 1mL의 25mM D-글루코스에 5μL의 페놀-레드를 추가합니다.
   참고: 이 용액은 4주일 동안 1°C에서 보관할 수 있습니다. 그러나 25mM 작업 용액은 새로 준비해야 합니다. 오염의 징후가 있으면 재고를 버리십시오.
6. 모세관 풀러를 사용하여 인발형 미세사출 유리 모세관을 준비하거나 시중에서 판매되는 마이크로 유리 모세관을 조달합니다. 바늘 당기기에 대한 설정은 재료 표에 설명되어 있습니다.
   참고: 내부 필라멘트가 없는 붕규산 유리로 만든 미세 주입 모세관은 내부 필라멘트가 있는 유사한 모세관에 비해 더 나은 결과를 제공하는 것으로 밝혀졌습니다.
7. 제브라피시 유충을 장착하기 위해 직경 35mm의 유리 바닥 접시를 조달하십시오. 이 프로토콜에는 0.17mm의 유리 덮개가 있는 유리 바닥 접시가 사용되었는데, 이는 컨포칼 시스템에서 유리 보정 대물렌즈로 이미징할 수 있기 때문입니다.
8. 마이크로 로딩 피펫 팁을 조달하십시오. 이 프로토콜에는 100mm 길이의 20μL 마이크로 로더가 사용되었습니다.
9. 마이크로 핀셋 세트를 구입하십시오.
10. 제브라피쉬를 분류하고 키우기 위한 90mm 페트리 접시를 조달하십시오.
11. 미네랄 오일을 조달하십시오.
12. 유리 모세관을 통해 1-5nL의 액체 부피를 전달할 수 있는 공압 마이크로 펌프 또는 시스템을 조달하십시오.
13. 제브라피시 분류 및 장착을 위해 광원과 형광용 청색 및 적색 필터 큐브가 장착된 실체 현미경을 사용하십시오(CFP: 여기 420-450nm, 방출 460-490nm, TRITC: 여기: 532-554nm, 방출: 570-613nm; 또는 텍사스-레드: 여기: 540-580nm, 방출: 592-667nm). 이중 형질전환 Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(인스:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 유충을 입체경을 사용하여 생성합니다. crystallin promoter 아래에서 CFP 및 mCherry의 발현으로 인해 망막에서 파란색과 빨간색 형광을 가진 배아를 선택합니다.
14. β 세포의 Ca²⁺ 유입을 이미징하려면 10x(0.8 NA) 공기 및 40x(1.0 NA) 물 대물렌즈가 장착된 도립 컨포칼 현미경을 사용합니다. 직경 35mm의 유리 바닥 접시용 접시 홀더가 포함된 스테이지를 사용합니다.
15. 모세관 홀더가 있는 3D 수동 또는 전동 매니퓰레이터를 조달하십시오. 유리 모세관을 모세관 홀더에 삽입하고 모세관 홀더를 3D 매니퓰레이터에 장착합니다.
    참고: 3D 매니퓰레이터를 사용하면 유리 모세관을 정밀하게 움직여 제브라피시 유충에 삽입할 수 있습니다.

2. 제브라피쉬 유충 장착

참고: 이중 형질전환 Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(인스:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 배아를 0.03%(20μM) 1-페닐 2-티오우레아(PTU)로 처리하여 수정 후 24시간 이후부터 색소 침착을 억제합니다. 4.5 dpf에서 장착 직전에 Tricaine의 최종 농도의 0.04%를 사용하여 유충을 마취합니다.

1. 이미징 세션 동안 마취를 유지하려면 1% 저용융 아가로스에 0.04% 트리카인과 20μM PTU의 최종 농도를 추가합니다. 사용할 때까지 LMA 아가로스를 >37°C로 유지하십시오. 준비 당일에 이 용액을 사용하십시오.
2. 마취된 이중 형질전환 Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 유충. 유리 바닥 페트리 접시에 생선 3-5마리를 놓고 대부분의 액체를 제거합니다.
   알림: 이 단계에서 유충을 건조시키지 말고 항상 최소량의 E2에 담그십시오.
3. 물고기가 들어 있는 유리 바닥 페트리 접시에 LMA 500μL를 추가하고 마이크로 핀셋을 사용하여 물고기의 오른쪽이 유리 바닥과 직접 접촉하도록 물고기를 부드럽게 움직입니다. 여분의 아가로스를 제거하고 1-3분 동안 굳히십시오. 이 시점에서 아가로스가 약간 불투명해지는 것을 관찰하십시오(그림 1B).
   알림: 아가로스가 너무 뜨거우면 유충이 손상될 수 있습니다. 이를 방지하려면 아가로스를 유충에 넣기 전에 실온에서 30-45초 동안 식히십시오.
4. 아가로스가 단단해지면 마이크로 핀셋의 도움으로 심장 부위 주변의 아가로스를 조심스럽게 제거하여 아가로스와 접촉했을 때 후속 주입에 사용되는 바늘이 파손되는 것을 방지합니다(그림 1C).
5. 0.04% 트리카인과 20μM PTU의 최종 농도를 포함하는 500μL의 E2를 추가합니다.
   알림: 라이브 이미징 중에 유충이 건조되지 않도록 하십시오.

3. β 세포의 동시 주입 및 Ca²⁺ 이미징

참고: 발달 지연으로 인해 췌장 위에 과도한 난황이 있는 유충은 난황의 지질이 이미지 품질을 방해하므로 이미징에 사용해서는 안 됩니다. 또한 광표백 및 광독성을 피하기 위해 낮은 레이저 출력(0.5%-5%)이 사용됩니다.

1. 실체 현미경과 마이크로 핀셋을 사용하여 유리 모세관의 끝을 잘라냅니다.
   알림: 모세관의 직경은 제브라피시 심장의 유입관보다 작아야 하므로 모세혈관의 끝 부분 이상을 절단하지 마십시오.
2. 로딩 팁을 사용하여 바늘에 25mM D-포도당 용액을 채웁니다.
   참고: 모세관은 균일하게 채워져야 하며, 적절한 주입량의 전달을 방해하는 기포가 형성되지 않도록 특별한 주의를 기울여야 합니다.
3. 유리 모세관을 모세관 홀더에 장착하고 마이크로 펌프에 연결합니다. 마이크로 펌프를 500-1,000hPa의 사출 압력, 보상 압력 = 0hPa, 전달 시간 = 1초로 유지하십시오.
4. 주입량을 보정하려면 등급이 매겨진 접안렌즈가 장착된 실체 현미경을 사용하십시오. 스테레오스코프 아래의 유리 슬라이드에 미네랄 오일 한 방울을 떨어뜨립니다. 1.5x 대물렌즈를 사용하여 입체경의 줌을 4의 거듭제곱으로 조정합니다. 유리 모세관을 미네랄 오일에 주입하기 위해 삽입합니다.
   알림: 5nL은 입체경의 접안렌즈에 표시된 눈금의 5단위에 해당합니다. 마이크로 펌프의 사출 압력을 높이거나 낮추어 방울 부피를 조정합니다.
5. 모세관 홀더를 3D 매니퓰레이터에 장착합니다.
   알림: 3D 매니퓰레이터는 모세관 홀더의 x, y 및 z 방향으로 미세한 움직임을 제어할 수 있어야 합니다.
6. 장착된 유충이 들어 있는 접시를 컨포칼 현미경의 플레이트 홀더에 조심스럽게 놓습니다. 명시야 옵션을 사용하여 유충을 찾기 위해 10x, 0.8 NA 공기 대물렌즈를 사용합니다.
7. 심장 쪽이 있는 제브라피쉬를 모세관과 3D 매니퓰레이터가 있는 방향으로 향하게 합니다. 적색 형광을 관찰하여 섬이 시야의 중앙에 있는지 확인하십시오.
   참고: 이 시점부터 stage는 고정된 상태로 유지되어야 합니다(그림 2).
8. 3D 매니퓰레이터를 사용하여 유리 모세관을 유충의 심장 쪽으로 이동하고 피부를 관통하여 심낭강을 조준합니다. 심장 심방¹⁶에서 약 100-200μm 떨어진 총추기경(CCV)과 부비동 정맥(SV)의 중간에 모세혈관을 조심스럽게 삽입합니다(그림 1B 및 그림 2C). 바늘의 각도는 플레이트 표면에 대해 약 20-30°입니다. 플레이트의 가장자리가 너무 높으면 모세관에 더 쉽게 접근할 수 있도록 제거합니다.
   참고: 이것은 매우 신중한 삽입이 필요하기 때문에 중요한 단계입니다. 빠른 움직임은 심장을 동요시키거나 이 부위에 혈액을 유발할 수 있습니다. 혈류가 교란되면 다른 샘플을 사용해야 합니다. 3D 매니퓰레이터는 고정된 위치를 유지하므로 심장 조직을 방해하지 않도록 스테이지의 움직임을 피하십시오.
9. 모세관을 SV에 삽입한 후 40x, 1.2 NA 침수 대물렌즈로 변경합니다. 적색 및 녹색 488/561 이색 미러를 사용하여 β 세포에서 핵 mCherry 신호를 찾고 섬에 초점을 맞춥니다.
   참고: 개별 핵이 명확하게 보여야 하고 낮은 녹색 형광이 있어야 합니다(그림 1D).
10. 스마트 설정 메뉴에서 다음 매개변수를 사용하여 GCaMP6 및 mCherry 형광에 대한 동시 획득을 설정합니다: GFP (GCaMP6s), 여기: 488 nm, 방출: 498-555 nm, 가색: 녹색 (GFP 선택); mCherry, 여기 : 561 nm (mCherry), 방출 : 570-640 nm, 가색 : 빨간색 (mCherry 선택). 투과광, 가색: 회색.
11. 섬의 z축을 따라 초점면을 조정하여 이미징 평면을 조정합니다. 대부분의 β-셀을 포함하는 평면을 찾습니다.
12. 각 개별 세포를 균일하게 식별하고 색상 히스토그램의 약 70%를 커버하기 위해 핵 mCherry 신호의 게인을 조정합니다.
13. GCaMP6s가 밝기를 최대 6배까지 증가시키므로 색상 히스토그램의 최소 25%를 커버하도록 GCaMP6s 신호의 게인을 조정합니다.
14. 컬러 히스토그램의 약 70%를 커버하는 샘플의 균일한 신호에 대해 투과광의 게인을 조정합니다.
    참고: 회색 채널은 섬의 적절한 혈류를 시각화하고 보장하는 데 사용됩니다.
15. 획득 모드에서 이미지 해상도를 512 x 512 픽셀로, 확대/축소를 5로, 선 단계를 3으로, 스캔 속도를 13으로, 평균 선을 2-3으로 설정합니다. Time-series(시계열 옵션)를 선택하고 Duration(기간)을 500주기로 설정하고 프레임당 150ms의 획득 속도를 제공합니다.
    참고: 시계열의 처음 50개 프레임은 포도당 주입 전의 기준선 형광에 해당합니다. 일부 β세포는 생체 내에서 기저 활성을 보이는 것으로 관찰되었습니다. 반응하는 β세포는 시간이 지남에 따라 포도당 주입으로 녹색 형광 강도가 증가하는 것을 보여줍니다. 대부분의 β세포는 in vivo에서 25mM 포도당 주입에 대한 반응을 보입니다.
16. 이미징을 시작합니다. 처음 50프레임(7.5초) 후 마이크로 펌프를 사용하여 포도당을 주입합니다.
    참고: 주사로 인해 섬의 초점면이 이동할 수 있는 약간의 움직임이 발생할 수 있습니다. 동영상을 촬영하는 동안 배짱의 움직임으로 인해 섬의 초점면이 변경될 수 있습니다.
17. 이미지 획득을 주시하고 x, y 및 z 좌표를 수동으로 조정하여 동영상을 따라 동일한 초점면을 유지합니다.
18. 포도당 주입 후 시스템은 Ca²⁺ 유입 측면에서 섬 반응을 GCaMP 형광의 증가로 기록합니다. 각 주사 후에는 더 이상 자극을 주기 전에 유충을 최소 5분 동안 쉬게 하십시오.
    참고: 이 과정에서 세포의 핵이 안정적으로 유지되는지 확인하십시오. 획득하는 동안 섬이 광범위하게 움직이거나 섬이 초점면을 벗어나 이동한 경우 샘플을 추가 분석에 사용할 수 없습니다.
19. 주입을 세 번 반복합니다. 비디오를 TIF, czi 또는 LSM 형식으로 저장합니다(권장). Ca²⁺ 반응을 기록한 후 심장에서 모세혈관을 매우 천천히 제거합니다. 다음 샘플로 이동합니다.
    참고: 제브라피쉬 유충은 PTU가 포함된 신선한 E2가 있는 페트리 접시로 회수할 수 있습니다.

4. 개별 β세포에 대한 GCaMP 형광 미량의 정량화

참고: 동물이 너무 많이 움직이면 FIJI 플러그인 디스크립터 기반 시리즈 등록(2d/3d + t)¹⁷을 사용하여 영화를 안정화할 수 있습니다.

1. 분석할 이미지를 FIJI로 드래그 앤 드롭하여 로드합니다. Bio-format Import Options 창에서 OK를 클릭합니다.
   참고: FIJI에서 지원하지 않는 형식의 경우 분석을 위해 비디오를 tiff 형식으로 변환하십시오.
2. GCaMP 형광 강도를 추출하려면 Analyze > Set Measurements 메뉴를 클릭하십시오. Integrated density 상자를 선택하고 OK를 클릭합니다.
   1. ROI Manager를 엽니다.
   2. FIJI 메뉴의 도구 모음에 있는 폴리곤 선택을 선택합니다.
   3. Ca²⁺ 반응의 적절한 단세포 정량화를 보장하기 위해 세포핵보다 약간 큰 영역을 커버하고 세포의 세포질 영역 중 일부를 포함하는 다각형을 수동으로 그립니다.
   4. ROI의 위치가 프레임에서 일관되는지 확인합니다. 필요한 경우 ROI를 조정합니다.
   5. Add [t] 버튼을 클릭하여 선택한 ROI를 ROI Manager에 추가합니다.
3. GCaMP의 신호를 정량화하려면 이미지의 채널을 분리하십시오. FIJI 메뉴에서 Image > Colors > Split Channels 를 클릭하고 Green Channel을 선택합니다.
4. ROI Manager에서 모든 영역을 선택하고 More > Multi Measure 메뉴를 클릭합니다. 결과를 저장합니다.
   참고: 포도당 주입이나 동물의 움직임으로 인해 세포가 다각형 영역을 벗어날 경우, 다각형 영역을 수동으로 조정하여 이동 전후의 세포 형광을 추출합니다.
5. 단일 셀 분석을 수행하려면 다음 단계를 실행합니다.
   1. 배경 형광을 제거합니다. 이를 위해 배경 형광을 각 셀에 대해 동영상에 등록된 최소값(F_MIN)으로 간주합니다. 각 셀에 대한 전체 시계열(F,_T , T, F,_MIN)에서 최소값을 뺍니다.
   2. 동영상 전체에서 형광 값을 정규화합니다. 이를 위해 각 값을 각 셀에 대한 기록에 대한 가장 높은 강도 값으로 나눕니다. 이를 위해 F_MIN 과 F_MAX의 차이, 즉 (F_MAX - F_MIN)을 계산합니다. (F_T - F_MIN) / (F_MAX - F_MIN)으로 나눕니다.
      참고: 이 단계를 통해 서로 다른 세포 간 및 다른 동물의 섬 간 Ca²⁺ 반응을 비교할 수 있으며, 이는 초점면과 이미징에 대한 세포 또는 섬의 접근성에 따라 다양한 수준의 형광 강도를 방출하기 때문입니다.
6. 단일 세포 형광 값을 획득한 후 프로그램(예: Excel 또는 R)을 사용하여 4단계에서 측정한 형광 값을 처리하고 형광 흔적을 자동으로 플롯합니다. 이 프로토콜에서 분석을 수행하기 위해(6단계), 보충 표 1 (Singlecelltrace.xlsx)을 사용하였다.

결과

이 프로토콜을 사용하여 네이티브 환경에서 개별 β 세포의 포도당 반응을 특성화했습니다. 이를 위해 제브라피쉬 유충은 유리 바닥 페트리 접시에 장착됩니다. 3D 매니퓰레이터를 사용하여 SV를 대상으로 하는 유리 모세관을 순환에 삽입했습니다(그림 1 및 그림 2). 이를 통해 정의된 농도의 특정 부피의 용액을 주입할 수 있습?...

토론

이 프로토콜에서는 단일 세포 해상도를 가진 기본 미세환경에서 β세포의 Ca²⁺ 역학을 조사했습니다. 이는 제브라피시 β세포를 순환계에 포도당 주입으로 자극하는 동시에 GCaMP6를 사용하여 Ca²⁺ 역학을 기록함으로써 가능합니다.

이 프로토콜은 세 가지 주요 이점을 제공합니다. 첫째, 연구자들은 제브라피시 β세포가 생체 내 포?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm diameter glass-bottom dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C	We use this glass-bottom dish to mount the zebrafish larvae and perform confocal microscopy
Blue-Green filter cube	ZEISS	489038-9901-000	Filter Set 38 HE
Confocal Microscope	ZEISS	LSM 980
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Excel (2016)			https://www.office.com/
Femtojet	Eppendorf	5252000013	This equipment is a pneumatic micropump, which allows precise volume delivery and is accompanied by a capillary holder. We use the micropump Femtojet (injection pressure between 500-1000 hPa; compensation pressure = 0 hPa; and delivery time = 1 second).
Femtotips, glass capillaries ready to be used.	Eppendorf	5242952008	This are ready to use glass capillaries that can substitute the pulled-capillaries.
FIJI, using ImageJ Version: 1.51c			https://fiji.sc/
Fluorescence lamp	ZEISS	423013-9010-000	Illuminator HXP 120 V
Glass capillaries 3.5"	Drummonds Scientific Company	3-000-203-G/X	We use these glass capillaries to prepare the injection capillaries by pulling them with a capillary -puller
Injectman	Eppendorf	5192000019	This equipment allows for 3D manipulation of the capillary holder
Low melting agarose	Biozym	Art. -Nr.: 840101	We use the agarose to mount the zebrafish onto the glass-bottom dish
Microloader tip for glass microcapillaries 0.5 – 20 µL, 100 mm	Eppendorf	5242956003	Long tips for loading the glass capillaries with the solutions
Micro-tweezers	Dumont Swiss made	0102-4-PO	We use the micro-tweezers to move the zebrafish larvae during the mounting and to cut off the tip of the glass capillary (eg. Dumont, size 4).
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904	We use the mineral oil to calibrate the drop size to inject
P-1000 Next Generation Pipette Puller	Science Products	P-1000	We use this capillary puller to prepare the glass capillary using the Drumond capillaries. We use the P-1000 capillary puller with the following parameters: Heat: 650, Pull: 20, Vel: 160, Time: 200, Pressure: 500.
PTU (1-phenyl-2-thiourea )	Sigma-Aldrich	P7629	We use this compound to inhibit pigmentation during zebrafish development
Red Filter Cube	ZEISS	000000-1114-462	Filter set 45 HQ TexasRed
Stereo microscope	ZEISS	495015-0001-000	SteREO Discovery.V8
Syringe filters, sterile. Pore size 0.2 µm	Pall Corporation	4612	We use these to filter all the solutions and prevent the capillary needle clothing
Transgenic Zebrafish line:Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)
tricaine methanesulfonate (MS222)	Sigma-Aldrich	E10521	We use this compound to anesthetize the fish larvae