İn Vivo β-Hücre Fonksiyonunu Araştırmak için Canlı Zebra Balıklarında Eşzamanlı Kalsiyum Görüntüleme ve Glikoz Stimülasyonu

Özet

Burada, çalışma, zebra balığının pankreas β hücrelerinin in vivo kalsiyum görüntüleme ve glikoz stimülasyonu için bir protokol sunmaktadır.

Özet

Pankreas β hücreleri, kan şekeri seviyelerine göre insülin üretip salgılayarak sistemik glukoz homeostazını sürdürür. β hücre fonksiyonundaki kusurlar, diyabete yol açabilen hiperglisemi ile ilişkilidir. İnsülin sekresyonu sürecinde, β hücreleri Ca²⁺ akışı yaşar. Bu nedenle, genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörleri (GECI'ler) kullanılarak glikoz ile uyarılan Ca^{2 +} akışının görüntülenmesi, β hücre fonksiyonunu incelemek için bir yol sağlar. Daha önce yapılan çalışmalar, GCaMP6'ları eksprese eden izole zebra balığı adacıklarının, tanımlanmış glikoz konsantrasyonları ile stimülasyon üzerine önemli Ca²⁺ aktivitesi sergilediğini göstermiştir. Bununla birlikte, β hücrelerinin glikoza tek başına değil, sistemik olarak bağlandıkları, vaskülarize oldukları ve yoğun şekilde innerve oldukları doğal ortamlarında nasıl tepki verdiklerini incelemek çok önemlidir. Bu amaçla, çalışma, in vivo olarak β hücreli aktiviteyi aydınlatmak için gelişimin erken aşamalarında zebra balığı larvalarının optik şeffaflığından yararlandı. Burada, in vivo β hücre fonksiyonunu araştırmak için Ca²⁺ görüntüleme ve glukoz stimülasyonu için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu teknik, tek hücre çözünürlüğü ile β hücrelerde koordineli Ca²⁺ dinamiklerinin izlenmesine izin verir. Ek olarak, bu yöntem, küçük moleküller veya peptitler gibi herhangi bir enjekte edilebilir çözelti ile çalışmak için uygulanabilir. Toplamda, protokol, zebra balığı modelinin adacık koordinasyonunu in vivo olarak araştırma ve çevresel ve genetik bileşenlerin β hücre işlevini nasıl etkileyebileceğini karakterize etme potansiyelini göstermektedir.

Giriş

Pankreas β hücreleri, glikoza yanıt olarak insülin sekresyonu için benzersiz bir yetenek sergiler. Karbonhidrat açısından zengin bir yemekten sonra kan şekeri artar ve β hücrelere girer ve burada ATP üretmek için hızla metabolize edilir. ATP/ADP'nin hücre içi oranındaki artış, ATP'ye bağımlı K⁺ kanallarının kapanmasına, hücre zarının depolarize olmasına ve voltaja bağımlı Ca²⁺ kanallarının aktive olmasına yol açar. Hücre içi Ca^{2 +} 'daki hızlı artış, β hücreleri tarafından insülin-granül salgılanmasını uyarır.

Farelerde sağlam pankreas içindeki adacık hücrelerinin görüntülenmesi zahmetlidir ve tüm organın dıştan alınmasını gerektirir. Non-invaziv in vivo görüntüleme için güçlü bir alternatif, adacıkların farelerin gözünün ön kamarasına (AC) nakledilmesidir¹. Farelerin AC'sine nakledilen adacıklar, in vivo bir ortamı taklit eder, bu da uzunlamasına çalışmalara ve in vivo^2,3 Ca²⁺ görüntülemeye izin verir. Bununla birlikte, adacık revaskülarizasyon süreci, adacık naklinden sonra birkaç hafta sürebilir⁴. Bu nedenle, β hücrelerinin vaskülarize olduğu ve organizmanın metabolik durumuna bağlı olduğu orijinal doğal ortamın korunması ve in vivo tek hücreli görüntüleme çözünürlüğünün elde edilmesi çok zor ve zaman alıcı olmaya devam etmektedir.

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için araştırmacılar, β hücrelerinde GECI'leri eksprese eden zebra balığı transgenik hatları geliştirdiler ve bu da β hücrelerinde Ca²⁺ akışının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin verdi 5,6,7,8,9. Bu araçlar kullanılarak, hücre kültüründe, zebra balığı β hücrelerinin, fare ve insan adacıklarına benzer şekilde yüksek glikoza karşı korunmuş bir tepki gösterdiği bulundu. Ayrıca, zebra balığı larvalarının optik berraklığı, β hücrelerinin doğal ortamlarındaki işlevini incelemeye izin vermiştir. Daha da önemlisi, döllenmeden (dpf) 4 gün sonra (dpf), zebra balığı birincil adacığının β hücreleri, ürocortin3'ün (ucn3l) zebra balığı ortologu gibi olgunluk belirteçlerini ifade eder ve in vitro fizyolojik aralıkta^{glikoza tepkiler gösterir 6}. Ek olarak, zebra balığı adacığı yoğun bir şekilde vaskülarize edilir ve innerve^{edilir 10}. Bu aşamada β hücrelerinin genetik ablasyonu glikoz intoleransına yol açar. Ayrıca, zebra balığı, insülin ve sülfonilüreler gibi glikoz düşürücü ajanlara karşı korunmuş tepkiler gösterir, bu da birincil adacığın glikoz seviyelerini kontrol eden glikoza duyarlı ve sistemik olarak bağlı bir doku olduğunu gösterir. Bu özel özellikler, zebra balığını adacık β hücreli aktiviteyi in vivo olarak incelemek için benzersiz bir model haline getirir ^11,12.

Ca²⁺ görüntüleme ve doğrudan zebra balığı dolaşımına eşzamanlı glikoz enjeksiyonu protokolü, β hücresinin glikoz duyarlılığının in vivo olarak araştırılmasına olanak tanır. Bu protokol, tanımlanmış glikoz konsantrasyonlarının yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlükle kombinasyon halinde enjeksiyonunu sağlar, bu da β hücrelerinin glikoza koordineli tepkisini ve in vivo¹³ ilk yanıtlayıcı β hücrelerinin varlığını tamamen ortaya çıkarır. Ayrıca, protokol kimyasal bileşikler veya küçük peptitler gibi herhangi bir enjekte edilebilir çözeltiye uyarlanabilir. Genel olarak, bu metodoloji, zebra balığı modelinin β hücre koordinasyonunu in vivo olarak araştırma ve çevresel ve genetik bileşenlerin β hücrelerinin işlevini nasıl etkileyebileceğini karakterize etme gücünü göstermektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan daha önce kurulmuş transgenik hatlar Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)⁶, Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP)¹⁴. Tüm deneyler Avrupa Birliği ve Alman yasalarına (Tierschutzgesetz) uygun olarak ve TU Dresden ve Landesdirektion Sachsen Etik Kurullarının onayı ile gerçekleştirilmiştir (onay numaraları: AZ 24D-9168,11-1/2013-14, TV38/2015, T12/2016 ve T13/2016, TVV50/2017, TVV 45/2018 ve TVV33-2019). Bu çalışmada, hayvanları koruma kanununda belirtildiği gibi (TierSchVersV §14) döllenme sonrası 5 gün (dpf) aşamasını aşmayan zebra balığı larvaları ile tüm canlı görüntüleme, in vivo ve glukoz enjeksiyonları ile deneysel işlemler gerçekleştirilmiştir. 2010/63/EU sayılı AB direktifine göre, bu erken zebra balığı aşamalarının kullanılması, 3R'nin ilkelerine göre deney hayvanlarının sayısını azaltır.

1. Hazırlık

NOT: Bu protokol, zebra balığı birincil adacığının Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) çift transgenik larvalar. Bu hayvanlarda, insülin promotörü, tek tek β hücresinin çekirdeklerini kırmızı floresanla etiketleyen cdt1-mCherry ekspresyonunu yönlendirir. GCaMP6s, hücre içi Ca^{2 +} seviyelerine yanıt olarak yeşil floresanstaki değişiklikleri gösterir. β hücrelerde GCaMP6'ların spesifik ekspresyonu, diğer hücre tiplerinden veya dokulardan gelen girişim olmaksızın tek tek hücrelerin glikoz duyarlılığının karakterizasyonuna izin verir.

1. E2 embriyonik besiyerini hazırlayın¹⁵.
2. % 10 Hanks'in tuzlu suyunda% 0.003 (200 μm) 1-fenil-2-tiyoüre (PTU) hazırlayın¹⁵.
3. Bir mikrodalgada ısıtarak ve <25 μm gözenek boyutunda bir filtre ile filtreleyerek E2 embriyonik ortamda% 1 düşük erime noktalı agaroz (LMA) hazırlayın. LMA'yı 1 haftaya kadar >37 °C'de tutun.
   NOT: Enjeksiyon için kullanılan cam kılcal damarın tıkanmasını önlemek için tüm solüsyonlar filtrelenmelidir.
4. 979 mL_{steril H 2}O ve 21 mL 1 M Tris (pH 9) ile% 0.4'lük bir trikain metan sülfonat (MS222) çözeltisi hazırlayın. PH'ı 7'ye ayarlayın.
5. 200 mM D-glikoz çözeltisi hazırlamak için 1.8 g D-glikozu 50 mL PBS'de çözün ve <25 μm gözenek boyutunda filtrelerle süzün. 1x PBS'de (filtrelenmiş) 200 mM D-Glikozun 1: 8 oranında seyreltilmesiyle çalışan bir D-Glikoz (25 mM) çözeltisi hazırlayın. Uzun süreli depolama için 4 °C'de saklayın. Enjeksiyon sırasında çözeltiyi görselleştirebilmek için 1 mL 25 mM D-Glikoz'a 5 μL fenol-kırmızı ekleyin.
   NOT: Bu solüsyon 4 °C'de 1 hafta tutulabilir. Bununla birlikte, 25 mM çalışma çözeltisi taze olarak hazırlanmalıdır. Herhangi bir kirlenme belirtisi varsa stoğu atın.
6. Bir kılcal çektirme kullanarak çekilmiş mikroenjeksiyon cam kılcal damarları hazırlayın veya piyasada bulunan mikro cam kılcal damarları temin edin. İğne çekme ayarları, Malzeme Tablosunda açıklanmıştır.
   NOT: İç filamenti olmayan borosilikat camdan yapılan mikroenjeksiyon kılcal damarların, iç filamenti olan benzer kılcal damarlara kıyasla daha iyi sonuçlar verdiği bulunmuştur.
7. Zebra balığı larvalarının montajı için 35 mm çapında cam tabanlı tabaklar temin edin. Bu protokolde, konfokal sistemlerde cam düzeltmeli objektiflerle görüntülemeye izin verdiği için 0.17 mm cam kapaklı cam tabanlı çanaklar kullanılmıştır.
8. Mikro yüklemeli pipet uçları temin edin. Bu protokolde 100 mm uzunluğunda 20 μL mikro yükleyiciler kullanılmıştır.
9. Bir dizi mikro cımbız temin edin.
10. Zebra balıklarını ayırmak ve büyütmek için 90 mm'lik Petri kapları satın alın.
11. Mineral yağ temin edin.
12. Cam kılcal damarlardan 1-5 nL sıvı hacmi sağlamak için pnömatik bir mikro pompa veya bir sistem temin edin.
13. Zebra balığı sıralama ve montajı için, bir ışık kaynağı ve floresan için mavi ve kırmızı filtre küpleri ile donatılmış bir stereo mikroskop kullanın (CFP: uyarma 420-450 nm, emisyon 460-490 nm, TRITC: uyarma: 532-554 nm, emisyon: 570-613 nm; veya Texas-Red: uyarma: 540-580 nm, emisyon: 592-667 nm). Çift transgenik Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) larvaları stereoskop kullanarak. Kristallin promotörü altında CFP ve mCherry ekspresyonu nedeniyle retinada mavi ve kırmızı floresan olan embriyoları seçin.
14. β hücrelerindeki Ca²⁺ akışını görüntülemek için, 10x (0.8 NA) hava ve 40x (1.0 NA) su hedefi ile donatılmış ters konfokal bir mikroskop kullanın. 35 mm çapındaki cam tabanlı tabaklar için plaka tutucuyu içeren bir tabla kullanın.
15. Kılcal tutuculu bir 3D manuel veya motorlu manipülatör temin edin. Cam kılcal damarı kılcal tutucuya yerleştirin ve kılcal tutucuyu 3D manipülatöre monte edin.
    NOT: 3D manipülatör, cam kılcal damarın hassas bir şekilde hareket etmesine ve zebra balığı larvalarına yerleştirilmesine izin verir.

2. Zebra balığı larva montajı

NOT: Çift transgenik Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) embriyoları, döllenmeden 24 saat sonra pigmentasyonu inhibe etmek için% 0.03 (20 μM) 1-fenil 2-tiyoüre (PTU) ile muamele edilir. 4.5 dpf'de, montajdan hemen önce nihai Trikain konsantrasyonunun% 0.04'ünü kullanarak larvaları uyuşturun.

1. Görüntüleme seansı sırasında anesteziyi sürdürmek için,% 1 düşük erime noktalı agaroza% 0.04 Trikain ve 20 μM PTU'luk bir nihai konsantrasyon ekleyin. LMA agarozunu kullanıma kadar >37 °C'de tutun. Bu çözeltiyi hazırlandığı gün kullanın.
2. Anestezi uygulanmış çift transgenik Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) larvaları . Cam tabanlı bir Petri kabına 3-5 balık koyun ve sıvının çoğunu çıkarın.
   NOT: Bu adımda larvaların kurumasına izin vermeyin ve her zaman minimum miktarda E2'ye batırılmış halde tutun.
3. Balığın bulunduğu cam tabanlı Petri kabına 500 μL LMA ekleyin ve mikro cımbız yardımıyla balığı nazikçe hareket ettirin, böylece balığın sağ tarafı cam tabanla doğrudan temas eder. Fazla agarozu çıkarın ve 1-3 dakika katılaşmasına izin verin. Bu noktada agarozun hafifçe opak hale geldiğini gözlemleyin (Şekil 1B).
   NOT: Agaroz çok sıcaksa larvalara zarar verebilir. Bunu önlemek için, agarozu larvalara eklemeden önce oda sıcaklığında 30-45 saniye soğumaya bırakın.
4. Agaroz katılaştıktan sonra, mikro cımbız yardımıyla, agaroz ile temas ettiğinde sonraki enjeksiyon için kullanılan iğnenin kırılmasını önlemek için kalbin etrafındaki agarozu dikkatlice çıkarın (Şekil 1C).
5. % 0.04 Trikain ve 20 μM PTU nihai konsantrasyonu içeren 500 μL E2 ekleyin.
   NOT: Canlı görüntüleme sırasında larvaların kurumasını önlediğinizden emin olun.

3. β hücrelerinin eşzamanlı enjeksiyonu ve Ca²⁺ görüntülemesi

NOT: Gelişimsel gecikme nedeniyle pankreasın üst kısmında aşırı yumurta sarısı bulunan larvalar, yumurta sarısının lipitleri görüntü kalitesini bozduğundan görüntüleme için kullanılmamalıdır. Ek olarak, fotoağartma ve fototoksisiteyi önlemek için düşük lazer güçleri (% 0.5 -% 5) kullanılır.

1. Stereo mikroskop ve mikro cımbız kullanarak cam kılcal damarın ucunu kesin.
   NOT: Kılcal damarın çapı zebra balığı kalbinin giriş yolundan daha küçük olması gerektiğinden, kılcal damarın ucundan fazlasını kesmeyin.
2. Yükleme uçlarını kullanarak iğneyi 25 mM D-Glikoz çözeltisi ile doldurun.
   NOT: Kılcal damar, uygun enjeksiyon hacimlerinin verilmesini engellediği için herhangi bir hava kabarcığı oluşumunu önlemek için özel dikkat gösterilerek düzgün bir şekilde doldurulmalıdır.
3. Cam kılcal damarı kılcal damar tutucuya monte edin ve mikro pompaya bağlayın. Mikro pompayı 500-1.000 hPa arasında bir enjeksiyon basıncında, dengeleme basıncında = 0 hPa'da ve teslimat süresi = 1 s'de tutun.
4. Enjeksiyon hacmini kalibre etmek için, dereceli bir göz merceği ile donatılmış bir stereo mikroskop kullanın. Stereoskopun altındaki bir cam slayta bir damla mineral yağ koyun. Stereoskopun yakınlaştırmasını 1,5x objektifle 4'ün kuvvetine ayarlayın. Cam kılcal damarı mineral yağa enjekte etmek için yerleştirin.
   NOT: 5 nL, stereoskopun göz merceğinde gösterilen 5 birim derecelendirmeye eşdeğerdir. Düşme hacmini ayarlamak için mikro pompanın enjeksiyon basıncını artırın veya azaltın.
5. Kılcal tutucuyu 3D manipülatöre monte edin.
   NOT: 3D manipülatör, kılcal tutucunun x, y ve z yönlerinde hassas hareket kontrolüne izin vermelidir.
6. Monte edilmiş larvaları içeren çanağı konfokal mikroskobun plaka tutucusuna dikkatlice yerleştirin. Parlak alan seçeneğini kullanarak larvaları bulmak için 10x, 0.8 NA hava hedefi kullanın.
7. Zebra balığını kalp tarafı ile kılcal damarın ve 3D manipülatörün bulunduğu yöne doğru yönlendirin. Kırmızı floresansı gözlemleyerek, adacığın görüş alanının merkezinde olduğundan emin olun.
   NOT: Bu noktadan itibaren sahne sabit kalmalıdır (Şekil 2).
8. 3D manipülatörü kullanarak cam kılcal damarı larvaların kalbine doğru hareket ettirin, cilde nüfuz edin ve perikard boşluğunu hedefleyin. Kılcal damarı, kalp atriyumu^16'dan yaklaşık 100-200 μm uzaklıkta bulunan ortak kardinal venin (CCV) ve sinüs venosusun (SV) ortasına dikkatlice yerleştirin (Şekil 1B ve Şekil 2C). İğnenin açısı, plakanın yüzeyine göre yaklaşık 20-30 ° 'dir. Plakanın kenarı çok yüksekse, kılcal damarın daha kolay erişmesini sağlamak için çıkarın.
   NOT: Bu kritik bir adımdır, çünkü çok dikkatli bir penetrasyon gereklidir; Hızlı hareketler kalbi rahatsız edebilir veya bu bölgede kan birikmesine neden olabilir. Kan akışı bozulursa, farklı bir örnek kullanılmalıdır. 3D manipülatör sabit bir pozisyon tuttuğundan, kalp dokusuna müdahale etmemek için sahnenin hareketlerinden kaçının.
9. Kılcal damar SV'ye yerleştirildikten sonra, 40x, 1.2 NA suya daldırma hedefine geçin. Kırmızı ve yeşil 488/561 dikromatik aynaları kullanarak, β hücrelerde nükleer mCherry sinyalini bulun ve adacığa odaklanın.
   NOT: Tek tek çekirdekler açıkça görülebilir olmalı ve düşük yeşil floresan mevcut olmalıdır (Şekil 1D).
10. Akıllı Kurulum Menüsünde aşağıdaki parametrelerle GCaMP6'lar ve mCherry floresansı için aynı anda bir alım ayarlayın: GFP (GCaMP6s), uyarma: 488 nm, emisyon: 498-555 nm, yanlış renk: yeşil (GFP'yi seçin); mCherry, uyarma: 561 nm (mCherry), emisyon: 570-640 nm, yanlış renk: kırmızı (mCherry'yi seçin). İletilen ışık, sahte renk: griler.
11. Odak düzlemini adacığın z ekseni boyunca ayarlayarak görüntüleme düzlemini ayarlayın. β hücrelerinin çoğunluğunu içeren bir düzlem bulun.
12. Her bir hücrenin tek tip bir şekilde tanımlanması ve renk histogramının yaklaşık %70'ini kapsaması için nükleer mCherry sinyalinin kazancını ayarlayın.
13. GCaMP6s parlaklığını 4 kata kadar artırdığından, GCaMP6s sinyalinin kazancını renk histogramının en az %25'ini kaplayacak şekilde ayarlayın.
14. Renk histogramının yaklaşık %70'ini kaplayan numunenin tek tip bir sinyali için iletilen ışığın kazancını ayarlayın.
    NOT: Gri kanal, adacığın uygun kan akışını görselleştirmek ve sağlamak için kullanılır.
15. Çekim Modunda, görüntü çözünürlüğünü 512 x 512 piksele, yakınlaştırmayı 5'e, satır adımını 3'e, tarama hızını 13'e ve ortalama çizgiyi 2-3'e ayarlayın. Zaman serisi seçeneğini belirleyin ve Süre'yi kare başına 150 ms'lik alım hızıyla 500 döngü olarak ayarlayın.
    NOT: Zaman serisinin ilk 50 karesi, glikoz enjeksiyonundan önceki temel floresansa karşılık gelir. Bazı β hücrelerinin in vivo bazal aktivite gösterdiği gözlenmiştir. Yanıt veren bir β hücresi, zamanla glikoz enjeksiyonu ile yeşil floresan yoğunluğunda bir artış gösterecektir. Çoğu β hücresi, in vivo olarak 25 mM glikoz enjeksiyonuna bir yanıt gösterir.
16. Görüntülemeyi başlatın. İlk 50 kareden (7,5 sn) sonra, mikro pompayı kullanarak glikozu enjekte edin.
    NOT: Enjeksiyonlar, adacığın odak düzlemini kaydırabilecek hafif bir hareket üretebilir. Film kaydı sırasında, bağırsak hareketleri adacığın odak düzlemini değiştirebilir.
17. Görüntü alımına dikkat edin ve film boyunca aynı odak düzlemini korumak için x, y ve z koordinatlarını manuel olarak ayarlayın.
18. Glikoz enjeksiyonundan sonra sistem, GCaMP floresansında bir artış olarak Ca²⁺ akışı cinsinden adacık tepkisini kaydeder. Her enjeksiyondan sonra, daha fazla stimülasyon yapmadan önce larvaların en az 5 dakika dinlenmesine izin verin.
    NOT: İşlem sırasında hücrelerin çekirdeklerinin sabit kaldığından emin olun. Eğer adacık alım sırasında yoğun bir şekilde hareket ediyorsa veya adacık odak düzleminin dışına çıkmışsa, numune daha fazla analiz için kullanılamaz.
19. Enjeksiyonu üç kez tekrarlayın. Videoları TIF, CZI veya LSM formatlarında kaydedin (önerilir). Ca²⁺ yanıtlarını kaydettikten sonra, kılcal damarı kalpten çok yavaş bir şekilde çıkarın. Sonraki örneğe gitme.
    NOT: Zebra balığı larvaları, PTU içeren taze E2 içeren bir Petri kabına geri kazanılabilir.

4. Bireysel β hücreleri için GCaMP floresan izlerinin miktarının belirlenmesi

NOT: Hayvan çok fazla hareket gösteriyorsa, film FIJI eklentisi Tanımlayıcı tabanlı seri kaydı (2d/3d + t)¹⁷ kullanılarak stabilize edilebilir.

1. Analiz edilecek görüntüyü FIJI'ye sürükleyip bırakarak yükleyin. Pencerede Biyo-format İçe Aktarma Seçenekleri, Tamam'a tıklayın.
   NOT: FIJI tarafından desteklenmeyen formatlar için videoları analiz için tiff formatına dönüştürün.
2. GCaMP floresan yoğunluğunu çıkarmak için Ölçümleri Analiz Et > Ayarla menüsüne tıklayın. Entegre yoğunluk kutusunu işaretleyin ve Tamam'a tıklayın.
   1. ROI Yöneticisi'ni açın.
   2. FIJI menüsünde, araç çubuğunda bulunan Poligon seçimleri'ni seçin.
   3. Ca²⁺ yanıtının uygun tek hücreli nicelleştirilmesini sağlamak için hücre çekirdeğinden biraz daha büyük bir alanı kaplayan ve hücrenin sitoplazmik alanının bir kısmını içeren bir çokgeni manuel olarak çizin.
   4. ROI'nin konumunun çerçeveler üzerinde tutarlı olduğundan emin olun; gerekirse yatırım getirisini ayarlayın.
   5. Seçilen ROI'yi, [t] Ekle düğmesine tıklayarak ROI Yöneticisine ekleyin.
3. GCaMP'nin sinyalini ölçmek için görüntünün kanallarını ayırın. FIJI menüsüne tıklayın Görüntü > Renkler > Bölünmüş Kanallar ve Yeşil Kanal'ı seçin.
4. ROI Manager'da tüm alanları seçin ve menüye tıklayın Daha fazla > Çoklu Ölçüm. Sonuçları kaydedin.
   NOT: Hücre, glikoz enjeksiyonu veya hayvan hareketi nedeniyle poligon alanından çıkarsa, poligon alanını manuel olarak ayarlayarak hareketten önce ve sonra hücre floresansını çıkarın.
5. Tek hücre analizini gerçekleştirmek için aşağıdaki adımları uygulayın.
   1. Arka plan çiçeklenmesini çıkarın. Bu amaçla, arka plan floresanını her hücre için film üzerinde kaydedilen minimum değer olarak düşünün (F_MIN). Minimum, her hücre için tüm zaman serisinden (F,_T - F_MIN) ÇıKARıLıR.
   2. Filmdeki floresan değerlerini normalleştirin. Bunu başarmak için, her bir değeri, her hücre için kayıtlar üzerindeki en yüksek yoğunluk değerine bölün. Bunun için F_MIN ve F_MAX arasındaki farkı hesaplayın, yani (F_MAX - F_MIN). Bölün (F_T - F_MIN) / (F_MAX - F_MIN).
      NOT: Bu adım, odak düzlemine ve hücrenin veya adacığın görüntülemeye erişilebilirliğine bağlı olarak değişen seviyelerde floresan yoğunlukları yayacaklarından, farklı hücreler arasında ve farklı hayvanlardan gelen adacıklar arasında Ca²⁺ yanıtının karşılaştırılmasına izin verir.
6. Tek hücreli floresan değerlerinin alınmasından sonra, 4. adımdan itibaren ölçülen floresan değerlerini işlemek ve floresan izlerini otomatik olarak çizmek için bir program (örneğin, Excel veya R) kullanın. Bu protokoldeki analizi gerçekleştirmek için (adım 6), Ek Tablo 1 (Singlecelltrace.xlsx) kullanılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak, bireysel β hücrelerinin doğal ortamlarındaki glikoz tepkisi karakterize edildi. Bu amaçla, zebra balığı larvası cam tabanlı bir Petri kabına monte edilir. Bir 3D manipülatör kullanılarak, SV'yi hedef alan bir cam kılcal damar dolaşıma yerleştirildi (Şekil 1 ve Şekil 2). Bu, tanımlanmış bir konsantrasyona sahip belirli hacimlerde çözeltilerin enjeksiyonuna izin verir. Eşzamanl?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokolde, tek hücre çözünürlüğüne sahip doğal mikro çevrelerindeki β hücrelerinin Ca²⁺ dinamikleri araştırıldı. Bu, zebra balığı β hücrelerinin dolaşımda bir glikoz enjeksiyonu ile uyarılması ve^{GCaMP6'lar kullanılarak Ca 2+} dinamiklerini kaydetmesiyle mümkündür.

Protokol üç ana avantaj sağlar. İlk olarak, araştırmacılar zebra balığı β hücrelerinin in vivo^<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm diameter glass-bottom dishes	Mattek	P35G-1.5-14-C	We use this glass-bottom dish to mount the zebrafish larvae and perform confocal microscopy
Blue-Green filter cube	ZEISS	489038-9901-000	Filter Set 38 HE
Confocal Microscope	ZEISS	LSM 980
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
Excel (2016)			https://www.office.com/
Femtojet	Eppendorf	5252000013	This equipment is a pneumatic micropump, which allows precise volume delivery and is accompanied by a capillary holder. We use the micropump Femtojet (injection pressure between 500-1000 hPa; compensation pressure = 0 hPa; and delivery time = 1 second).
Femtotips, glass capillaries ready to be used.	Eppendorf	5242952008	This are ready to use glass capillaries that can substitute the pulled-capillaries.
FIJI, using ImageJ Version: 1.51c			https://fiji.sc/
Fluorescence lamp	ZEISS	423013-9010-000	Illuminator HXP 120 V
Glass capillaries 3.5"	Drummonds Scientific Company	3-000-203-G/X	We use these glass capillaries to prepare the injection capillaries by pulling them with a capillary -puller
Injectman	Eppendorf	5192000019	This equipment allows for 3D manipulation of the capillary holder
Low melting agarose	Biozym	Art. -Nr.: 840101	We use the agarose to mount the zebrafish onto the glass-bottom dish
Microloader tip for glass microcapillaries 0.5 – 20 µL, 100 mm	Eppendorf	5242956003	Long tips for loading the glass capillaries with the solutions
Micro-tweezers	Dumont Swiss made	0102-4-PO	We use the micro-tweezers to move the zebrafish larvae during the mounting and to cut off the tip of the glass capillary (eg. Dumont, size 4).
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5904	We use the mineral oil to calibrate the drop size to inject
P-1000 Next Generation Pipette Puller	Science Products	P-1000	We use this capillary puller to prepare the glass capillary using the Drumond capillaries. We use the P-1000 capillary puller with the following parameters: Heat: 650, Pull: 20, Vel: 160, Time: 200, Pressure: 500.
PTU (1-phenyl-2-thiourea )	Sigma-Aldrich	P7629	We use this compound to inhibit pigmentation during zebrafish development
Red Filter Cube	ZEISS	000000-1114-462	Filter set 45 HQ TexasRed
Stereo microscope	ZEISS	495015-0001-000	SteREO Discovery.V8
Syringe filters, sterile. Pore size 0.2 µm	Pall Corporation	4612	We use these to filter all the solutions and prevent the capillary needle clothing
Transgenic Zebrafish line:Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)
tricaine methanesulfonate (MS222)	Sigma-Aldrich	E10521	We use this compound to anesthetize the fish larvae