استئصال الهيباتيك الجزئي في سمك الحمار الوحشي البالغ

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراء إزالة الفص البطني للكبد في سمك الحمار الوحشي البالغ لتمكين دراسة تجديد الكبد.

Abstract

فشل الكبد هو واحد من الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم، والوفيات الناجمة عن أمراض الكبد المزمنة ترتفع بشكل حاد في الولايات المتحدة. الكبد السليم قادر على تجديد من الأضرار السامة، ولكن في أمراض الكبد المتقدمة، وضعف القدرة الطبيعية للكبد لتجديد. وقد برزت حمار وحشي كنظام تجريبي قوي لدراسة التجديد. وهي نموذج مثالي لدراسة تجديد الكبد من استئصال الكبد الجزئي، وهو إجراء له صلة سريرية مباشرة تتم فيه إزالة جزء من الكبد جراحيا، تاركا الباقي سليما. لا يوجد بروتوكول قياسي لاستئصال الهيباتيك الجزئي؛ وقد استخدمت الدراسات السابقة باستخدام هذا النموذج بروتوكولات مختلفة قليلا وأفادت نتائج متباينة. الموصوفة هنا هو كفاءة، بروتوكول استنساخها لإجراء استئصال الهيباتيك الجزئي في حمار وحشي الكبار. نحن نستخدم هذه التقنية لإثبات أن حمار وحشي قادر على تجديد غير متبلور للفص المكروب. يمكن استخدام هذا البروتوكول لمزيد من الاستجواب الآليات اللازمة لتجديد الكبد في حمار وحشي.

Introduction

من بين الأعضاء الصلبة في البشر ، والكبد هو الجهاز الوحيد القادر على تجديد^1. وهذا أمر بالغ الأهمية، كما الكبد هو جهاز أساسي، المسؤولة عن وظائف التمثيل الغذائي الرئيسية، وتخزين الطاقة، وإزالة السموم من الدم، وإفراز بروتينات البلازما، وإنتاج الصفراء². يتم استبدال خلايا الكبد المفقودة بسبب الأضرار السامة أو الالتهابية في المقام الأول عن طريق تقسيم خلايا الكبد المتبقية¹. نموذج تجريبي كلاسيكي واحد لدراسة تجديد الكبد هو استئصال الكبد الجزئي ، حيث تتم إزالة الفصوص الفردية للكبد ، وترك الفصوص المتبقية سليمة³. تم تطوير هذا الإجراء في البداية في الفئران ، حيث تتم إزالة ما يقرب من ثلثي كتلة الكبد. بعد استئصال الكبد الجزئي في الثدييات ، يحدث التجديد التعويضي في الفصوص المتبقية حتى يستعيد الكبد كتلته الأولية. وتجدر الإشارة إلى أن كبد الثدييات لا يحل محل الفصوص المفقودة.

Zebrafish (دانيو rerio) تمثل نموذجا قابلة للسحب لدراسة تجديد الأعضاء الكبار⁴. الكبد حمار وحشي، في حين تختلف هيكليا عن الكبد الثدييات، و تتكون من نفس أنواع الخلايا ويخدم نفس الوظيفة كما هو الحال في الثدييات². ويتكون من ثلاثة فصوص، مع اثنين من الفصوص الظهرية وفص بطني واحد التي تتسطح على طول الأمعاء. وقد سبق إجراء استئصال الهيباتيك الجزئي في سمك الحمار الوحشي، مع روايات متضاربة حول الطريقة الدقيقة للتجديد. عادة، يتم إجراء استئصال الهيباتيك الجزئي ثلث عن طريق إزالة الفص البطني بأكمله. وأشارت التقارير الأولية إلى أنه بعد إزالة الفص البطني ، تم تجديده بالكامل في غضون أسبوع^5،6،7، مما يشير إلى أنه على النقيض من كبد الثدييات ، فإن كبد الحمار الوحشي قادر على التجديد غير المتبلور. أظهرت الدراسات اللاحقة أن إزالة الفص البطني أدت إلى تجديد تعويضي في الفصوص الظهرية ، بدلا من تجديد الفص البطني المفقود ، وفي النهاية استعادة كتلة الكبد في غضون أسبوع^8،9. كشف التنميط النسخي للفص الظهري بعد استئصال الفص البطني عن تغييرات كبيرة مرتبطة بالتجديد التعويضي^10. وبالنظر إلى أن طريقة تجديد الكبد يمكن أن تختلف مع مدى^{الإصابة 8}، تكهننا بأن التناقضات في النتائج قد تكون بسبب الاختلاف التقني في بروتوكول استئصال الكبد الجزئي بين مجموعات البحث.

يصف هذا البروتوكول إجراء لإجراء استئصال الهيباتيك الجزئي ثلث على حمار وحشي الكبار عن طريق إزالة الفص البطني. وستكون هذه التقنية قيمة لتقييم آليات تجديد الكبد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وأثيرت حمار وحشي وتربية وفقا للإجراءات القياسية. تمت الموافقة على التجارب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في مستشفى بريغهام والنساء (2016N000405). تم صائم حمار وحشي الكبار لمدة 24 ساعة قبل بدء البروتوكول. مياه النظام يشير إلى المياه في خزانات الإسكان حمار وحشي في المرفق المائي.

1. التحضير والتخدير

1. إعداد 0.016٪ Tricaine الحل في مياه النظام.
   تنبيه: Tricaine هو مهيج إذا كان يأتي في اتصال مع العينين والجلد، أو الجهاز التنفسي.
2. إعداد اسفنجة لعقد حمار وحشي مخدر خلال بروتوكول تشريح. قطع اسفنجة كاملة إلى أرباع. باستخدام شفرة حلاقة، قم بإزالة إسفين رقيقة من الإسفنج الذي يمتد بالتوازي مع المحور الطويل من الربع الإسفنج.
   1. يجب أن يكون الشق طويلا بما يكفي لاستيعاب سمكة بالغة (وهذا يختلف بين أحجام مختلفة من الأسماك). على سبيل المثال، بالنسبة للأسماك البالغة 35 ملم في الطول، يجب أن يكون طول الشق 20 ملم. يتم عقد الرأس والجسم بشكل مريح في الاسفنج، ولكن الذيل يمتد الماضي حافة الاسفنج(الشكل 1B).
3. نقع الاسفنج في حل Tricaine 0.016٪.
4. وضع حمار وحشي الكبار (سواء ذكر أو أنثى) في 625 مل من محلول Tricaine 0.016٪.
5. حضانة لمدة 6 دقائق أو حتى الأسماك لا تستجيب للمس.
6. باستخدام ملقط، وإزالة بعناية الأسماك من خزان Tricaine ووضع الجانب البطيني السمك حتى في الأخدود من الاسفنج (الشكل 1A - B).
7. ضع الإسفنج تحت مجهر تشريح مع إضاءة من أعلى إلى أسفل.

2. الجراحة

1. باستخدام ملقط ناعم، قرصة الجلد ومقاييس medially، فقط الخلفي إلى القلب(الشكل 1B).
2. باستخدام مقص الربيع محملة، وجعل خفض تحت ملقط لخلق ثقب في تجويف الجسم (الشكل 1C - D). الحرص على عدم إصابة القلب أو الأوعية الدموية الرئيسية، لأن هذا سيؤدي إلى زيادة معدل الوفيات.
3. باستخدام مقص محملة الربيع، وجعل شق 3-4 ملم على طول البطن، ومعالجة الخلفي حتى الشق يصل في زعانف الحوض(الشكل 1D - E). عند هذه النقطة، قد يكون الفص البطني للكبد مرئيا من خلال الشق.
4. اضغط على جانبي الاسفنج بيد واحدة لإجبار الأعضاء الحشوية على الخروج من تجويف الجسم. الفص البطني للكبد سوف تكون مرئية على رأس الأمعاء (الأرقام 1F, 2A-B). سيظهر الكبد كبنية وردية أو برتقالية منتشرة على الأمعاء الذهبية البنية. يتم استرداد الحيوانات المعينة كضوابط صورية في هذه المرحلة.
5. الضغط على ملقط غرامة بحيث اثنين من tines لمس. مع الحفاظ على الضغط على الاسفنج ، الشريحة من علب ملقط غرامة في ما بين الكبد والأمعاء(الشكل 1G). الحرص على عدم ثقب الأمعاء، لأن هذا سيؤدي إلى زيادة معدل الوفيات.
6. تخفيف الضغط ببطء على ملقط بحيث الطنين الابتعاد عن بعضها البعض (الشكل 1H). هذا العمل انزلاق يقطع العديد من المرفقات الوريد البوابة بين الفص البطني والأمعاء (الشكل 2B)، وضروري لإزالة الفص البطني نظيفة. كرر هذه العملية حتى يتم قطع جميع اتصالات البوابة بين الكبد والأمعاء.
7. قشر الفص البطني من الأمعاء باستخدام ملقط ناعم وقطع الفص البطني خالية من بقية الكبد (الشكل 1I).
8. ينتج عن هذا الإجراء استئصال جزء من الهيباتيكومي ثلث(الشكل 1J).

3. الانتعاش

1. إزالة بعناية الأسماك من الإسفنج ووضعها في خزان من مياه النظام.
2. ماصة نظام المياه على الخياشيم لبضع دقائق حتى الأسماك تسبح من تلقاء نفسها(الشكل 1K).
3. مراقبة الأسماك لمدة 2-4 ساعات قبل وضعها مرة أخرى على النظام. لا تطعم السمك لمدة 24 ساعة كاملة بعد الجراحة.
4. مراقبة الأسماك يوميا طوال مدة التجربة.
5. مع مرور الوقت، شق في جدار الجسم سوف تلتئم بشكل طبيعي دون الحاجة إلى الغرز (الشكل 1L،2C).

4. الفص البطني إلى تحليل طول الأمعاء

1. قتل جميع الحيوانات الموجهة للتحليل في الماء المثلج لمدة 10 دقائق حتى تتوقف جميع الحركات opercular.
2. إزالة الأسماك من الماء المثلج ووضعها الجانب البطني حتى في الأخدود من اسفنجة.
3. باستخدام مقص محملة الربيع، وجعل شق في جدار الجسم البطني في الموقف الأمامي الخلفي للقلب. ثم جعل اثنين من أكثر الشقوق التي تعمل على طول المحور الأمامي الخلفي من الشق الأول على طول الطريق إلى زعانف الحوض. (الشكل 2A).
4. قشر الظهر الجلد والعضلات للكشف عن الأجهزة الحشوية (الشكل 2A).
5. الحصول على صور ذات مجال مشرق والفلورسنت من الأجهزة الحشوية باستخدام المجهر epifluorescence. وسيشمل مجال الرؤية هذا المنطقة التي أعيد فيها استئصال الفص البطني. ولأن الحيوانات يقتل رميا بالرصاص قبل التحليل، فإن هذا النوع من التحليل يحول دون التصوير طويل الأجل لنفس الأسماك.

5. تحليل نسبة الوزن الكبد إلى الجسم

1. قتل جميع الحيوانات الموجهة للتحليل في الماء المثلج لمدة 10 دقائق حتى تتوقف جميع الحركات opercular.
2. ضع السمك في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
3. إضافة 25 مل من 4٪ بارافورمالديهايد في برنامج تلفزيوني 1x و 0.3٪ توين إلى الأنبوب.
   تنبيه: الفورمالديهايد سام، وينبغي دائما معالجة الحلول التي تحتوي على الفورمالديهايد في غطاء محرك السيارة الكيميائية.
4. نوتات لمدة 48 ساعة في 4 درجة مئوية.
5. أداء أربعة يغسل 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1x و 0.3٪ توين.
6. استرداد الأسماك مع ملقط، ولطخة الجافة على منشفة ورقية.
7. سجل وزن السمك بأكمله.
8. باستخدام مقص محملة الربيع، وجعل شق في جدار الجسم البطني في الموقف الأمامي الخلفي للقلب. ثم، جعل اثنين من أكثر الشقوق التي تعمل على طول المحور الأمامي الخلفي من الشق الأول على طول الطريق إلى زعانف الحوض. (الشكل 2A).
9. قشر الظهر الجلد والعضلات للكشف عن الأجهزة الحشوية (الشكل 2A).
10. الحصول على صور ذات مجال مشرق للكبد باستخدام المجهر epifluorescence.
11. تشريح الكبد، ووضع قطعة من الكبد على قارب الوزن.
12. سجل وزن الكبد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

من أجل دراسة الإمكانات التجديدية لكبد حمار وحشي البالغين ، قمنا بإجراء استئصال الكبد الجزئي (PHX) في سمك الحمار الوحشي البالغ. بشكل عام، تم اختيار كبار البالغين (30-40 ملم في الطول)، تتراوح أعمارهم بين 1.5-2.5 سنة. وفي إطار التجارب الفردية، تم اختيار الحيوانات من نفس الخزان، وكانت مطابقة للعمر وال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الاختلافات التشريحية بين سمك الحمار الوحشي ونماذج الثدييات لتجديد الكبد تمثل تحديات فريدة من نوعها لاستئصال الكبد. الكبد في حمار وحشي على مقربة من القلب والأمعاء. عن غير قصد إتلاف أي من الأعضاء يؤدي إلى زيادة معدل الوفيات. لا يتم تغليف كبد حمار وحشي ، مما يجعل من الصعب فصله عن الأمعاء. الكب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15700
50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile	Corning	352098
AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance	Bay State Scale & Systems, INC.	WL-104-1051
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps	Electron Microscopy Sciences	72997-07
Epifluorescence microscope	Zeiss	Discovery.V8
Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge	Amazon	B07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4L	EMD Millipore	6505-4L
Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight	Biomedical Research Instruments	11-1020
Tricaine methanesulfonate	Syndel	TRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagents	Fischer Scientific	BP337-500